CN114949222A

CN114949222A - 用于下调alkbh5基因和/或下调igf2bp2基因表达的试剂及其应用

Info

Publication number: CN114949222A
Application number: CN202210469869.5A
Authority: CN
Inventors: 庞丽红; 阮和云; 邓翎洁; 韦懿芸; 杨芳
Original assignee: First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University
Priority date: 2022-04-28
Filing date: 2022-04-28
Publication date: 2022-08-30

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及用于下调ALKBH5基因和/或下调IGF2BP2基因表达的试剂及其应用。本申请通过研究分析发现，首次提出了ALKBH5及IGF2BP2基因与K562细胞产生血红蛋白量有显著的关系。发现下调ALKBH5基因及IGF2BP2基因的表达，相对应的K562细胞的血红蛋白量增加的效果。同时在设计的siRNA能干扰ALKBH5基因及IGF2BP2基因表达，下调时，增加K562细胞的血红蛋白量，能改善地中海贫血严重程度。因此，siRNA也用于制备相对应的药物试剂，来对地中海贫血进行治疗。

Description

用于下调ALKBH5基因和/或下调IGF2BP2基因表达的试剂及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及用于下调ALKBH5基因和/或下调IGF2BP2基因表达的试剂及其应用。

背景技术

Α-地中海贫血是因α珠蛋白基因变异，导致α珠蛋白缺乏或合成水平降低所引起的单基因遗传性血液病。血红蛋H病[hemoglobin H(HbH)disease]又称中间型α－地中海贫血(Thalassemia)，是可存活的α地中海贫血中最严重的一种，主要是由于α珠蛋白肽链的4个α基因中有3个发生了缺陷，α-链的合成量严重降低，β链形成相对过多，形成β四聚体(β4)，使得红细胞受损而导致慢性溶血性贫血。HbH病的临床表现不仅局限于贫血与铁过载，它还可能导致生长发育不良、溶血危象、脾肿大、肝及心功能障碍、内分泌疾病等一系列严重的并发症。在广西，α-地贫基因携带率高达17.5％，居全国之首。而且由于人口的迁移及增长，HbH病的受累人群也不断增多，随之给社会带来的健康与经济负担也日益加重。根据基因分类，HBH病可以分为缺失型和非缺失型(突变型)HbH病。其中HBH CS病(基因型为－SEA/ααCS)是我国最常见的非缺失型HbH病。与缺失型患者相比，非缺失型HbH病的临床表现在个体间差异很大，而且非缺失型患者的的贫血和溶血表现整体上出现得更早、更严重，生长迟缓、骨骼畸形、脾肿大、铁过载也更明显。而妊娠对于HbH病来说是一种应激情况，在应激情况下，一些表型较轻的患者，出现较严重的症状，为减轻妊娠应激的严重临床症状，进一步寻找HBH CS病的发病机制，并制定出有效的防治策略显得尤为重要。

发明内容

针对上述问题，提供一种用于下调ALKBH5基因和/或下调IGF2BP2基因表达的试剂及其应用。目前对于中间型地中海贫血，在应激的时候病情加重，主要表现在贫血程度较前增加，在非应激状态下不需要输血，而当遇到应激状态时，出现严重的贫血，此时需要给予对症处理或给予输血才能减轻症状，渡过应激时期。且同一基因型的地中海贫血临床症状有轻有重，在应激状态下，症状较轻的可能变得很重。我们研究发现改变ALKBH5及IGF2BP2的表达状态可改变K562细胞向红系发育的状态。故我们认为改变ALKBH5及IGF2BP2可以改变无效造血的可能及改善HbHCS患者的无效造血，也是可以预测该疾病的严重程度的一个指标。可作为地中海贫血治疗的一个靶点。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明提供一种用于下调ALKBH5基因和/或下调IGF2BP2基因表达的试剂在制备或改善地中海贫血的药物中的应用。

进一步的，所述用于下调ALKBH5基因和/或下调IGF2BP2基因表达的试剂包括抑制ALKBH5基因和/或IGF2BP2基因表达的siRNA。

本发明还提供一种下调ALKBH5基因和/或下调IGF2BP2基因表达的siRNA，所述siRNA包括ALKBH5 siRNA和/或IGF2BP2 siRNA，所述ALKBH5 siRNA和/或IGF2BP2 siRNA的核酸序列分别如下SEQ ID NO：1-2所示：

ALKBH5 siRNA(SEQ ID NO：1)：CCTCAGGAAGACAAGATTAGA；

IGF2BP2 siRNA(SEQ ID NO：2)：F 5'→3'GAAGUGAUCGUCAGAAUUAUU；R 5'→3'UAAUUCUGACGAUCACUUCUU。

另一方面说明，所述下调ALKBH5基因和/或下调IGF2BP2基因与地中海贫血病的严重程度以及无效的红细胞生成和清除程度呈正相关。

另一方面，本发明提供用于下调ALKBH5基因和/或下调IGF2BP2基因表达的试剂在制备药物中的应用，所述药物具备以下功能：增加K562细胞的血红蛋白量

由于采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

本申请通过研究分析发现，首次提出了ALKBH5及IGF2BP2基因与K562细胞产生血红蛋白量有显著的关系。发现下调ALKBH5基因及IGF2BP2基因的表达，相对应的K562细胞的血红蛋白量增加的效果。故ALKBH5级IGF2BP2可被认为一个地中海贫血严重程度的标志物。根据这一特性，对于中间型地中海贫血的胎儿，如胎儿的羊水或脐带血肿出现高表达的ALKBH5级IGF2BP2则提示胎儿出生后的贫血严重程度。通过过表达敲低ALKBH5，检测到ALKBH5可调控AHSP的表达，AHSP作为一种血红蛋白α蛋白的伴侣蛋白，在造血干细胞向红系分化的过程中，起着稳定α蛋白的作用。已有研究证实在非缺陷型的HbH疾病中，AHSP基因表达与α-珠蛋白基因表达，疾病严重程度以及无效的红细胞生成和清除程度呈正相关。而我们研究的两个分子与AHSP呈正相关。故我们也可以认为ALKBH5及IGF2BP2与疾病的严重程度以及无效的红细胞生成和清除程度呈正相关。同时在设计的siRNA能干扰ALKBH5基因及IGF2BP2基因表达，下调时，增加K562细胞的血红蛋白量，能改善地中海贫血严重程度。因此，siRNA也用于制备相对应的药物试剂，来对地中海贫血进行治疗。

附图说明

图1为本发明实施例在K562细胞中过表达ALKBH5的RT-qPCR图；

图2为本发明实施例在K562细胞中敲减ALKBH5的RT-qPCR图；

图3为本发明实施例在K562细胞中敲减IGF2BP2的RT-qPCR图；

图4为本发明实施例在K562细胞中过表达及敲减ALKBH5以及敲减IGF2BP2的WB图；

图5为本发明实施例的过表达敲减ALKBH5及敲减IGF2BP2对K562细胞生成血红蛋白影响图；

其中，A表示过表达ALKBH5的空载对照经联苯胺染色后细胞染色情况图；

B表示过表达ALKBH5的K562细胞经henmin诱导后细胞的蓝染情况图；

C表示空载对照和过表达组肉眼观察图；

D表示空载和多表达组的血红蛋白检测530的吸光值对比图；

E表示下调ALKBH5对照的联苯胺染色的情况图；

F表示下调ALKBH5的K562细胞蓝染情况图；

G表示肉眼可见的下调对照及下调ALKBH5的K562经hemin诱导后的变化情况图；

H表示下调对照及下调ALKBH5血红蛋白检测530的吸光值对比图；

I表示下调IGF2BP2对照联苯胺染色的情况图；

J表示下调IGF2BP2的K562细胞蓝染情况图；

K表示肉眼可见的下调对照及下调IGF2BP2的K562经hemin诱导后的变化情况图；

L表示下调对照及下调IGF2BP2血红蛋白检测530的吸光值对比图。

图6为本发明实施例过表达敲减ALKBH5后IGF2BP2及AHSP蛋白的变化以及单纯敲减IGF2BP2后的AHSP的表达变化图；

A：用RT-qPCR验证过表达ALKBH5时AHSP也呈现过表达；

B：用RT-qPCR验证过敲低ALKBH5时AHSP也呈现低表达；

C：用RT-qPCR验证过敲低IGF2BP2时AHSP也呈现过表达；

D/E/F/G/H:表示用WB验证过表达及敲除ALKBH5，单纯敲除IGF2BP2的AHSP的表达状态。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例与附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

1)通过过表达ALKBH5并下调IGF2BP2，可以增加K562细胞向红系的发育，且血红蛋白的含量增加。

2)通过下调IGF2BP2，增加K562细胞向红系发育，且血红蛋白的含量增加。

具体操作及实验步骤如下：

慢病毒感染K562细胞(过表达ALKBH5及敲除ALKBH5)：

病毒转染：

1、将状态良好的K562细胞收集至15ml离心管，600转/分，5分钟；

2、弃上清，用1×PBS 2ml重新悬浮，清洗2次。600转/分，5分钟；

3、弃上清，加入1ml无双抗，无血清的1640基础培养基，轻柔重悬细胞。

4、细胞计数后，根据实验设计进行铺板，每孔加入500μL基础培养基。每孔的细胞约1×105个。

5、对照组空内加入适量的空载病毒对照及适量的Ploybrene，实验组加入适量的过表达及下调的ALKBH5慢病毒及适量的Ploybrene。并设置空白对照组(只有培养基及K562细胞)。

病毒加样量(ul)＝(细胞数×MOI值/病毒原液低度)。K562细胞的MOI值：20。

6、将上述的24孔板放置37℃5％的CO₂的恒温培养箱培养。

7、感染病毒24小时后，进行换液，收集每孔的细胞分别至已经标记好的15mL离心管中，并用1×PBS清洗2次，再将离心的细胞分别加入含有双抗的完全培养基，再次放置24孔板进行培养。

8、视细胞状态进行换液。

9、病毒感染72h后，在荧光显微镜下观察细胞的荧光强弱，并判断病毒感染的1D效率。并通过RT-qPCR及WB验证K562细胞过表达及敲除的ALKBH5的表达情况。结果提示，siRNA2能明显敲减ALKBH5.

10、siALKBH5片段的获取，根据ALKBH5基因，设计三个siRNA,如下表1，将三个siRNA及对照转染K562细胞，并结合RT-qPCR结果，最后获得siRNA2敲除ALKBH5的效能最佳。

表1siRNA序列

Marker	TargetSeq	Gene ID	Gene
				siRNA1	ALKBH5	NM_017758.4	CCACCCAGCTATGCTTCAGAT
siRNA2	ALKBH5	NM_017758.4	CCTCAGGAAGACAAGATTAGA
				siRNA3	ALKBH5	NM_017758.4	GATGAAATCACTCACTGCATA
NC2	NC2		CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG

细胞转染siIGF2BP2(目的是敲除K562细胞中的IGF2BP2)

步骤：1、收集状态良好的细胞，并铺板

2、按实验设计转染目的干扰siRNA，及对照

3、用RT-qPCR方法及WB方法验证转染的成功与否。见图1、图2、图3、图4。

干扰siRNA片段的获得：

下调IGF2BP2的siRNA，结合IGF2BP2序列设计三对siRNA如下表2，我们选用三个siRNA、siCtrl及GAPDH(PC对照)在K562细胞转染了解敲低IGF2BP2。使用RT-qPCR技术进行验证其敲除的下效率，并验证其转染的最佳时间，发现使用三对siRNA时，只有siRNA3在72小时时可敲低IGF2BP2，并经过多次的验证发现，siRNA3均可在72小时后能及时的敲低IGF2BP2的表达。

表2 3个siRNA及其对照的序列

从图1中可以得出：经转染了过表达ALKBH5质粒后，K562细胞呈现过表达ALKBH5的状态。

从图2中可以得出：经转染了shALKBH5后，K562细胞呈现低ALKBH5表达状态。

从图3中可以得出：WB验证了K562细胞的ALKBH5及IGF2BP2的不同状态。

从图4中可以得出：WB验证了K562细胞的ALKBH5及IGF2BP2的不同状态。

可见，通过siRNA感染，可改变K562细胞分子的表达状态。

联苯胺染色实验：

1、种板：将实验组及对照组种板至6孔板，细胞数量约2×106/孔。

2、hemin诱导：将种好板的细胞，加入30mm hemin的培养基进行培养。每孔的培养基2ml。

3、染色：收集用hemin诱导培养24小时，48小时，72小时，96小时，120小时的K562细胞。用PBS洗涤2次。取一滴上述细胞，用新鲜配置的联苯胺溶液染色，5分钟内在倒置显微镜下观察细胞染色情况。并收集1×106个细胞进行血红蛋白的检测实验。(细胞蓝染表示K562细胞向红系发育的细胞状态)。

血红蛋白检测

1、配制检测工作液

1)配制表准品工作液：取出Hb(1mg/ml)，恢复室温，取10μL，加入74.76μL的ddH2O，即为标准品工作液(13.2μg/ml).

2)配置显色工作液：取Hb Assay buffer至恢复至室温。取显色底物溶解于HbAssay

2、准备样品：

1)将上述收集的研究组及对照组的细胞1×106个。1×PBS 2ML洗涤细胞，800转/分，4-5分钟。弃上清。重复洗涤2至3次、丢上清。

2)取100μl的RIP裂解液冰上裂解细胞30min，取上清。(如当天不继续实验，可将细胞冻存于负80℃)。

3、Hb加样

采用血红蛋白检测试剂盒检测细胞血红蛋白浓度。

空白对照组：8μLddH2O+40μL显色工作液+Acid Assay buffer 160μL

标准孔：8μL标准工作液+40μL显色工作液+Acid Assay buffer 160μL

待测样品：8μL待测样品+40μL显色工作液+Acid Assay buffer 160μL

上述样品轻轻混匀后，37°恒温孵育10min。每孔加入Acid Assay buffer 160ul混匀。

4、酶标仪检测530处吸光度。

血红蛋白浓度计算公式(mg/L)＝(OD样品–OD空白)/(OD标准品–OD空白)×13.2×100(mg/L)

5、计算：使用Graphpad 9.0计算不同分组间的530mm吸光度。详见图5。

从图5中可以得出：过表达ALKBH5可减少K562细胞的血红蛋白量的生成，敲减ALKBH5的K562细胞其血红蛋白量增加，而下调IGF2BP2的K562细胞的血红蛋白量增多。

由此我们认为，过表达ALKBH5可减少K562细胞的血红蛋白的生成，下调ALKBH5及IGF2BP2可增加K562细胞的血红蛋白的生成量。

另外我们进一步发现，ALKBH5-IGF2BP2-AHSP三者之间存在调控关系

通过过表达敲低ALKBH5，检测到ALKBH5可调控AHSP的表达，AHSP作为一种血红蛋白α蛋白的伴侣蛋白，在造血干细胞向红系分化的过程中，起着稳定α蛋白的作用。已有研究证实在非缺陷型的HbH疾病中，AHSP基因表达与α-珠蛋白基因表达，疾病严重程度以及无效的红细胞生成和清除程度呈正相关。而我们研究的两个分子与AHSP呈正相关。故我们也可以认为ALKBH5及IGF2BP2与疾病的严重程度以及无效的红细胞生成和清除程度呈正相关(如图6)。

综上所述：ALKBH5及IGF2BP2的表达改变可改变K562细胞向红系发育，可导致血红蛋白的改变。可导致无效造血。故ALKBH5级IGF2BP2可被认为一个地中海贫血严重程度的标志物。根据这一特性，对于中间型地中海贫血的胎儿，如胎儿的羊水或脐带血肿出现高表达的ALKBH5级IGF2BP2则提示胎儿出生后的贫血严重程度。

上述说明是针对本发明较佳可行试验例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

序列表

<110> 广西医科大学第一附属医院

<120> 用于下调ALKBH5基因和/或下调IGF2BP2基因表达的试剂及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

cctcaggaag acaagattag a 21

<210> 3

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

aagugaucgu cagaauuauu 20

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

uaauucugac gaucacuucu u 21

Claims

1.用于下调ALKBH5基因和/或下调IGF2BP2基因表达的试剂在制备或改善地中海贫血的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述用于下调ALKBH5基因和/或下调IGF2BP2基因表达的试剂包括抑制ALKBH5基因和/或IGF2BP2基因表达的siRNA。

3.下调ALKBH5基因和/或下调IGF2BP2基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA包括ALKBH5 siRNA和/或IGF2BP2 siRNA，所述ALKBH5 siRNA和/或IGF2BP2 siRNA的核酸序列分别如下SEQ ID NO：1-2所示：

ALKBH5 siRNA(SEQ ID NO：1)：CCTCAGGAAGACAAGATTAGA；

IGF2BP2 siRNA(SEQ ID NO：2)：F 5'→3'：GAAGUGAUCGUCAGAAUUAUU；

R 5'→3'：UAAUUCUGACGAUCACUUCUU。

4.如权利要求3所述的下调ALKBH5基因和/或下调IGF2BP2基因表达的siRNA，其特征在于，所述下调ALKBH5基因和/或下调IGF2BP2基因与地中海贫血病的严重程度以及无效的红细胞生成和清除程度呈正相关。

5.用于下调ALKBH5基因和/或下调IGF2BP2基因表达的试剂在制备药物中的应用，其特征在于，所述药物具备以下功能：增加K562细胞的血红蛋白量。