CN110628791A - 一种tRNA修饰酶基因在非小细胞肺癌中的应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种tRNA修饰酶基因在非小细胞肺癌中的应用。本申请研究发现SEQ ID No.1所示序列的tRNA修饰酶基因，即FTSJ1基因，在非小细胞肺癌(NSCLC)癌组织中和NSCLC细胞中的表达水平都显著低于癌旁组织和正常支气管上皮细胞；证实FTSJ1低表达促进NSCLC细胞增殖、迁移并抑制凋亡；FTSJ1基因重组载体能有效抑制NSCLC细胞增殖和迁移并诱导NSCLC癌细胞凋亡，具有抗癌应用价值，可用于靶向药物研发及临床诊断检测。因此，本申请提供了tRNA修饰酶FTSJ1基因及FTSJ1重组载体在非小细胞肺癌中的新用途，为非小细胞肺癌的早期诊断、筛查、治疗提供了一种新的方案和途径。

Description

一种tRNA修饰酶基因在非小细胞肺癌中的应用
技术领域
本申请涉及非小细胞肺癌诊断和治疗试剂领域，特别是涉及一种tRNA修饰酶基因在非小细胞肺癌中的应用。
背景技术
肺癌是世界上发病率及死亡率最高，对人类健康危害最大的恶性肿瘤之一。全球每年大约有160万人死于肺癌，其中，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)约占肺癌总数的80％，是癌症导致死亡的最常见原因。在中国，肺癌不仅是最常见的恶性肿瘤，而且在过去的20多年里其发病率和死亡率均呈上升态势。根据世界卫生组织预测，如果不能采取有效的防治措施，中国到2025年每年将有超过一百万的新发肺癌患者，严重威胁国人的生命健康。因此，加强肺癌的防治研究，是当前肿瘤防治中重大而迫切的课题。
在临床上，外科手术是治疗早期NSCLC(I-II期)患者的最有效方法。比如，病理分期为IA的病人，手术后5年生存率可达80-90％；而IIB的病人术后5年存活率仅有56％。但是，由于NSCLC早期无典型的临床症状和体征，缺乏有效的早期诊断方法，70％以上的患者确诊时肿瘤已局部晚期或发生转移，无法进行切除治疗，失去了手术治疗的机会，因而外科切除仅适用于约30％的NSCLC患者。对于中晚期患者，以铂类药物为基础的联合化疗是临床治疗NSCLC的主流手段。多数患者化疗初期对药物敏感，表现为肿瘤体积缩小，临床症状明显减轻。但后期效果不佳，有效率仅约20％。而且化疗的毒副作用较大，多数病人容易产生耐药。其中多药耐药性(MDR)是导致肺癌化疗失败的主要原因。
近年来，作用于EGFR基因活性突变和ALK基因重排分子的靶向药物以其高效性、低毒性为晚期NSCLC的治疗开辟了新的途径。但总的来说，靶向药物治疗只对大约20％的NSCLC患者(主要是年轻的腺癌病人)有效，鳞癌以及高龄患者从EGFR-TKI靶向药物治疗中获益有限。在过去的5年中，以抗PD-1、PD-L1、CTLA-4的单克隆抗体为代表的免疫治疗异军突起，成为继手术、化疗、靶向治疗后又一种具有潜力的治疗NSCLC的方式。但是，免疫治疗的有效率也仅为20％左右，脱靶毒性及细胞因子风暴等毒副作用以及显著的耐药性等问题还有待克服。因此，虽然近年来在化疗、靶向药物、免疫治疗等中晚期NSCLC的治疗手段方面取得了明显的进步，NSCLC总体治疗效果并不理想，目前NSCLC治疗总的5年生存率只有4-17％。所以仍然迫切需要更深入地研究NSCLC的分子发病机制，积极探索新的治疗靶点和治疗方法。
转运RNA(transfer RNA,tRNA)是细胞内主要的一类RNA分子。在细胞内，tRNA分子首先以前体形式由RNA聚合酶III转录而成，然后经过加工修饰成为长度为70-90个核苷酸(nt)的成熟的tRNA。tRNA的二级结构呈三叶草型，由D臂、反密码子臂、T臂、额外臂和氨基酸受体臂组成。tRNA折叠后形成倒“L”型的三级结构，有利于tRNA携带的氨基酸进入核糖体的特定部位。tRNA的经典功能是参与蛋白质的合成，其3’末端负责将相应的氨基酸携带进入核糖体，然后通过反密码子与信使RNA(mRNA)上的密码子相互配对识别，从而实现遗传信息的精准传递和翻译。tRNA作为细胞内连接遗传信息和对应氨基酸之间的“接头分子”，是蛋白质合成中的关键大分子之一。
长期以来，大多数研究者仅把tRNA视作简单的蛋白质翻译元件。但是近年来的研究发现，tRNA除了参与蛋白合成外，在基因表达、细胞的增殖、迁移、凋亡以及血管生成等过程中也起重要的调控作用。tRNA的表达失调与癌症、代谢紊乱、神经性疾病以及病毒感染的发生有密切关联。研究表明转录tRNA基因的RNA聚合酶III受到多种癌基因(RAS)及抑癌基因的调控。tRNA表达谱分析表明，tRNA在多种肿瘤组织和肿瘤细胞中表达异常，而且不同种类的tRNA的表达异常在不同组织器官具有组织特异性，提示tRNA表达的异质性与各个组织器官的生物学作用有密切关系。增殖和分化是肿瘤细胞发生发展的两个重要特征，用肠癌、膀胱癌、前列腺癌、胶质瘤、B细胞淋巴癌等多种肿瘤组织和癌细胞系进行的全基因组tRNA表达谱分析发现，tRNA的表达谱与肿瘤的增殖和分化期有相关性，说明tRNA的异常表达与肿瘤的恶性程度有关。Goodzari等采用特异性的探针检测乳腺癌细胞内各种tRNA的含量，发现tRNAArg(CCG)和tRNAGlu(UUC)的表达上调促进EXOSC2和GRIPAP1等基因的表达，从而促进了乳腺癌的进展和转移。这些研究提示tRNA的表达异常是肿瘤发生发展的一个重要机制。
在细胞内，直接由转录产生的tRNA前体并不能行使其功能，需要通过一系列的剪接和修饰酶修饰加工形成成熟的tRNA方能获得生物学功能。tRNA修饰在进化上非常保守，提示tRNA修饰具有重要作用。转录后核苷酸的修饰对维持tRNA“倒L”型三级结构的稳定性，保持在核糖体上阅读框正确地翻译有重要作用。tRNA修饰不足将导致tRNA结构和功能的显著改变，导致细胞死亡和相关的疾病发生。tRNA修饰主要发生在反密码环，特别是第34和37位点的核苷酸。通常，反密码子修饰主要影响翻译的准确度和效率，而D和T臂的修饰不足则调控tRNA结构的稳定性和功能的折叠。例如，tRNA(tRNA Lys)第9位腺苷酸的腺嘌呤第1位甲基化(m 1A)修饰缺失导致tRNA错误折叠，进而影响了tRNALys的正常功能；tRNA反密码环摆动位点(Wobble position)tRNALEU(CAA)m5C修饰可以增加核糖体应急反应蛋白RPL22A的翻译效率；而tRNA第34位核苷酸碱基上尿嘧啶U被Trm9甲基化修饰后促进了DNA损伤相关转录本的翻译速度和延伸。由于这些修饰的缺陷常常导致基因表达和蛋白质翻译异常，研究tRNA修饰将有助于揭示相关疾病的发病机理。
tRNA修饰主要通过tRNA修饰酶的催化作用来实现。在多数情况下，每一种tRNA修饰酶只负责修饰tRNA分子特定位点上的特定碱基。tRNA修饰酶催化tRNA修饰的特异性为研究tRNA修饰的生物学功能提供了一个很好的途径。目前已发现的tRNA核苷酸修饰大约有90种，但负责催化这些修饰的基因及修饰酶多数在大肠杆菌和酵母中被鉴定，人类细胞中tRNA修饰以及修饰酶异常在人类疾病中的作用及其机制大多数仍不清楚。有研究表明，tRNA摆动位点鸟苷转录后修饰(U34)高度保守并调控翻译的精确性。负责催化U34位点mcm5s2修饰的修饰酶ELP3和CTU1/2在乳腺癌细胞及组织中高表达，并通过调控癌蛋白DEK及侵袭转录因子LEF1的翻译促进乳腺癌的转移，敲除ELP3后则抑制癌细胞的增殖和迁移。另外的研究也证实ELP3和ELP4在肝癌组织中过表达并通过调控PI3K/AKT通路促进癌细胞的侵袭和转移。tRNA摆动位点甲基转移酶HTRM9L在乳腺、膀胱、宫颈、及睾丸、卵巢癌组织中表达下调，通过调控有丝分裂调节因子LIN9以及P53通路基因抑制癌细胞的增殖、迁移及凋亡。在大肠等癌组织或癌细胞中HTRM9L的低表达与癌症的不良预后有密切关系。这些实验证据说明hTRM9L可能是一个潜在的抑癌基因，干预HTRM9L的表达有可能为肿瘤的诊治带来新的突破。HIF1α(hypoxia inducible factor-1alpha)与肿瘤细胞的生长、转移和存活有密切关系，HTRM9L等U34修饰酶通过促进HIF1α的翻译，提高癌细胞抵抗-BRAF靶向治疗的耐药性，提示抑制U34-tRNA酶有可能是抗癌治疗的一个新的有效途径。tRNA甲基转移酶NSUN2(m5C)和Mettl1(m7G)在食管、胃、肝、胰腺、宫颈、前列腺、肾、乳腺、甲状腺，头颈等多部位癌症组织中的高表达与肿瘤的不良预后有密切关系，并参与5-氟尿嘧啶的耐药性。有研究发现PUS7修饰酶催化tRNA分子第8位点假尿苷酸化(pseudouridylation)修饰后产生mTOGs等tRNA片段，这些mTOGs可抑制蛋白质的合成，PUS7过表达则有可能驱使细胞转化成为恶性肿瘤细胞。ALKBH1-催化的tRNA去甲基化修饰(m1A)抑制蛋白质的翻译；而ALKBH3促进肿瘤细胞的增殖、迁移、和侵袭能力。这些研究说明tRNA修饰酶的表达异常在肿瘤的发生发展中起重要的作用。深入探索tRNA修饰与肿瘤发生发展的关系及其作用机理将有可能为发现肿瘤新的发病机制及发现新的治疗靶标提供科学依据。
发明内容
本申请的目的是提供一种新的tRNA修饰酶基因在非小细胞肺癌中的应用。
本申请具体采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一种tRNA修饰酶基因在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用，其中，tRNA修饰酶基因为SEQ ID No.1所示序列的FTSJ1基因。
需要说明的是，本申请经过研究发现tRNA修饰酶基因，即SEQ ID No.1所示序列的FTSJ1基因，在NSCLC病人癌组织中，以及在NSCLC癌细胞中均分别显著低于癌旁组织和正常支气管上皮细胞。深入研究证实FTSJ1基因在NSCLC中低表达，并且研究结果表明该FTSJ1基因高表达具有显著的抑制NSCLC细胞肿瘤活性的能力，是一个新发现的肿瘤抑制基因。因此，该FTSJ1基因的重组载体、干扰序列或扩增引物可以用于制备诊断或预后评估NSCLC的试剂盒，或者用于制备预防或治疗NSCLC的药物。
基于以上研究和认识，本申请进一步的公开了FTSJ1基因重组载体在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用、在制备提高非小细胞肺癌细胞中FTSJ1基因的表达的试剂中的应用、在制备提高非小细胞肺癌细胞中FTSJ1的表达的试剂中的应用、在制备抑制非小细胞肺癌细胞的细胞增殖的试剂中的应用、在制备抑制非小细胞肺癌细胞的细胞迁移的试剂中的应用、在制备促进非小细胞肺癌细胞的细胞凋亡的试剂中的应用等，一系列的FTSJ1重组载体的新用途。
本申请的另一面公开了一种用于非小细胞肺癌检测的试剂，该试剂能够特异性的检测非小细胞肺癌细胞中tRNA修饰酶基因的表达，其中，tRNA修饰酶基因为SEQ ID No.1所示序列的FTSJ1基因。
可以理解，本申请的关键在于研究发现非小细胞肺癌细胞中的FTSJ1基因表达下降，因此可以通过检测FTSJ1基因的表达水平或者FTSJ1基因作用的底物tRNA修饰(Am)的水平，检测非小细胞肺癌，或者作为一个判断分析的参考依据，用于非小细胞肺癌的前期诊断和筛查，从而解决NSCLC缺乏有效的早期诊断方法的问题。至于具体的FTSJ1基因的表达水平或者FTSJ1基因表达的引起的tRNA分子Am修饰的量如何检测，可以参考现有的基因检测方法或者tRNA修饰或蛋白含量分析方法，在此不作具体限定。例如，FTSJ1基因的表达水平可以通过检测非小细胞肺癌细胞的RNA中FTSJ1基因相应的mRNA的量，本申请的一种实现方式中，具体的是提取组织细胞的RNA，然后反转录后，再通过FTSJ1基因特异性引物进行定性或定量分析，以此表征FTSJ1基因的表达水平。
优选的，本申请的试剂为特异性的检测非小细胞肺癌细胞中FTSJ1基因的引物对，引物对的上游引物为SEQ ID No.2所示序列，下游引物为SEQ ID No.3所示序列；
SEQ ID No.2：5’-CCATTCTTACGACCCAGATTTCA-3’
SEQ ID No.3：5’-CCCTCTAGGTCCAGTGGGTAAC-3’。
需要说明的是，SEQ ID No.2所示序列和SEQ ID No.3所示序列的引物对只是本申请的一种实现方式中，具体采用的检测FTSJ1基因表达的特异性引物；一方面，可以在本申请的引物对的基础上进行若干碱基的增加或删除，只要能够特异性的检测FTSJ1基因即可；另一方面，除了本申请的特异性引物对以外，还可以根据需求设计特异性探针进行检测，在此不作具体限定。此外，本申请的一种实现方式中，具体是采用特异性引物对的方式对FTSJ1基因表达进行检测，可以理解，除此以外还可以采用蛋白分析检测方法直接对FTSJ1基因表达的tRNA修饰酶进行检测，同样可以达到本申请的非小细胞肺癌检测效果。
本申请的再一面公开了一种FTSJ1基因的干扰RNA，其中，FTSJ1基因为SEQ IDNo.1所示序列；干扰RNA为第一对siRNA、第二对siRNA和第三对siRNA中的至少一种；第一对siRNA的正义链和反义链的3’末端都具有T碱基粘性末端，其正义链核酸序列为SEQ IDNo.4所示序列，其反义链核酸序列为SEQ ID No.5所示序列；第二对siRNA的正义链和反义链的3’末端都具有T碱基粘性末端，其正义链核酸序列为SEQ ID No.6所示序列，其反义链核酸序列为SEQ ID No.7所示序列；第三对siRNA的正义链和反义链的3’末端都具有T碱基粘性末端，其正义链核酸序列为SEQ ID No.8所示序列，其反义链核酸序列为SEQ ID No.9所示序列；
SEQ ID No.4：5’-GGAAUUCCAACUCUUCCAATT-3’
SEQ ID No.5：5’-UUGGAAGAGUUGGAAUUCCTT-3’
SEQ ID No.6：5’-CCAUGAUGUUGAUGAGUAUTT-3’
SEQ ID No.7：5’-AUACUCAUCAACAUCAUGGTT-3’
SEQ ID No.8：5’-GCAGCCGGAACUCUAGCAUTT-3’
SEQ ID No.9：5’-AUGCUAGAGUUCCGGCUGCTT-3’。
需要说明的是，第一对siRNA的具体结构如图37所示，正义链和反义链为反向互补序列。第二对siRNA和第三对siRNA的结构与第一对siRNA类似，只是具体的序列不同，在此不累述。
本申请的再一面公开了一种用于非小细胞肺癌细胞中FTSJ1基因检测的试剂盒，该试剂盒中含有本申请的用于非小细胞肺癌检测的试剂和/或本申请的FTSJ1基因的干扰RNA。
需要说明的是，本申请的试剂盒中包含本申请的FTSJ1基因的干扰RNA，其作用是反向验证FTSJ1的功能，以供科研或临床检验使用。
本申请的有益效果在于：
本申请提供了tRNA修饰酶基因FTSJ1的基因重组载体及FTSJ1基因在非小细胞肺癌中的新用途，为非小细胞肺癌的早期诊断、筛查、治疗提供了一种新的方案和途径。
附图说明
图1是本申请实施例中NSCLC癌组织和癌旁组织tRNA分子Am修饰水平差异结果图；
图2是本申请实施例中NSCLC癌组织和癌旁组织tRNA分子Am修饰酶FTSJ1基因表达水平差异结果图；
图3是本申请实施例中FTSJ1在NSCLC癌细胞和正常支气管上皮细胞表达差异结果图；
图4是本申请实施例中FTSJ1过表达对NSCLC癌细胞内Am修饰水平影响结果图；
图5是本申请实施例中FTSJ1低表达对NSCLC癌细胞内Am修饰水平影响结果图；
图6是本申请实施例中采用的PcDNA3.1载体图谱；
图7至图9依序为本申请实施例中FTSJ1过表达抑制NSCLC细胞PC9、A549和HCC827增殖的实验结果图；
图10至图12依序为本申请实施例中FTSJ1低表达促进NSCLC细胞PC9、A549和HCC827增殖的实验结果图；
图13是本申请实施例中FTSJ1正常表达时的PC9细胞迁移显微镜观察图；
图14是本申请实施例中FTSJ1低表达时的PC9细胞迁移显微镜观察图；
图15是本申请实施例中统计的FTSJ1低表达和正常情况下的PC9细胞迁移数量；
图16是本申请实施例中FTSJ1正常表达时的A549细胞迁移显微镜观察图；
图17是本申请实施例中FTSJ1低表达时的A549细胞迁移显微镜观察图；
图18是本申请实施例中统计的FTSJ1低表达和正常情况下的A549细胞迁移数量；
图19是本申请实施例中FTSJ1正常表达时的PC9细胞迁移显微镜观察图；
图20本申请实施例中FTSJ1过表达时的PC9细胞迁移显微镜观察图；
图21是本申请实施例中统计的FTSJ1过表达和正常情况下的PC9细胞迁移数量；
图22是本申请实施例中FTSJ1正常表达时的A549细胞迁移显微镜观察图；
图23是本申请实施例中FTSJ1过表达时的A549细胞迁移显微镜观察图；
图24是本申请实施例中统计的FTSJ1过表达和正常情况下的A549细胞迁移数量；
图25是本申请实施例中FTSJ1正常表达时的PC9细胞凋亡的流式细胞仪检测结果；
图26是本申请实施例中FTSJ1过表达时的PC9细胞凋亡的流式细胞仪检测结果；
图27是本申请实施例中统计的FTSJ1过表达和正常情况下的PC9细胞凋亡百分比；
图28是本申请实施例中FTSJ1正常表达时的A549细胞凋亡的流式细胞仪检测结果；
图29是本申请实施例中FTSJ1过表达时的A549细胞凋亡的流式细胞仪检测结果；
图30是本申请实施例中统计的FTSJ1过表达和正常情况下的A549细胞凋亡百分比；
图31是本申请实施例中FTSJ1正常表达时的PC9细胞凋亡的流式细胞仪检测结果；
图32本申请实施例中FTSJ1低表达时的PC9细胞凋亡的流式细胞仪检测结果；
图33是本申请实施例中统计的FTSJ1低表达和正常情况下的PC9细胞凋亡百分比；
图34是本申请实施例中FTSJ1正常表达时的A549细胞凋亡的流式细胞仪检测结果；
图35是本申请实施例中FTSJ1低表达时的A549细胞凋亡的流式细胞仪检测结果；
图36是本申请实施例中统计的FTSJ1低表达和正常情况下的A549细胞凋亡百分比；
图37是本申请实施例中第一对siRNA碱基互补配对结构示意图。
具体实施方式
现有研究显示，FTSJ1基因表达异常与精神发育障碍有关，但是FTSJ1基因与肿瘤的关系未见报道。本申请创造性的发现FTSJ1基因是催化tRNA分子AM修饰的特异性酶，并且FTSJ1基因能够抑制NSCLC的肿瘤活性，FTSJ1基因过表达能够抑制NSCLC细胞增殖、抑制NSCLC细胞迁移、促进NSCLC细胞凋亡。因此，本申请提供了FTSJ1基因重组载体以及FTSJ1基因表达引起的tRNA分子Am修饰在NSCLC中的一系列新的应用。
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例
1.NSCLC组织标本
本例的NSCLC组织标本取自深圳市人民医院胸外科手术切除的组织标本，NSCLC的诊断根据《中国原发性肺癌诊疗规范(2015年版)》有关诊断标准进行诊断，以病理学明确诊断的病例作为研究病例。排除以下情况患者：做过放化疗、近半年服用过抗肿瘤药物或免疫抑制剂、有传染病史、肿瘤已向远端转移、既往有其他恶性肿瘤病史。
取样标准：每个患者取3块癌组织和3块癌旁组织，癌旁组织要求距离癌组织5公分以上且肉眼观察无病理性改变，每块组织重量在150-200mg之间；组织标本切除后立即置于2mL外旋盖冻存管中，在管壁做好标记后在离体15分钟内置于液氮罐保存。
2.细胞系
本例采用NSCLC细胞系H226、HCC827、PC9、A549，正常气管上皮细胞系BEAS-2b进行试验。
3.LC-MS碱基修饰检测
a)tRNA分离：每个样品在用trizol法提取了总RNA后，通过含有7M urea的7.5％PAGE胶电泳分离。
b)从凝胶中提取60-90nt tRNA带，提取0.3MNH4Ac，用糖原和乙醇沉淀。
c)tRNA水解：纯化从步骤b)中得到的tRNA，单一核苷水解后，在50μL反应体系中脱磷酸；其中，50μL反应体系包含10U Benzonase、0.1U Phosphodiesterase I和1U AlkalinePhosphatase。
d)在37℃孵育3小时，加入300μL去离子水冲洗10000-DaMWCO过滤柱，4℃16000g离心5min。
e)将水解后的RNA样品转移到冲洗过的自旋过滤柱中，4℃16000g离心10min。
f)收集过滤液用于下游LC-MS分析。
LC-MS分析
设备：本例采用安捷伦6460QQQ质谱仪的安捷伦1260HPLC系统进行LC-MS分析，SB-Aq 3.5μm 2.1×150mm高效液相色谱柱(安捷伦)。
g)将tRNA的单核苷混合物注入LC-MS体系中，配制如下溶剂梯度：
溶液A为含甲酸的HPLC级水，最终甲酸浓度为0.1％(vol/vol)，
溶液B为100％乙腈与甲酸混合液，最终甲酸浓度为0.1％(vol/vol)
并按照表1进行梯度洗脱。
表1梯度洗脱条件
时间(min) 溶液A 溶液B 流速(mL/min)
0.0 100％ 0％ 0.05
14.0 100％ 0％ 0.05
33.0 90％ 10％ 0.05
33.1 25％ 75％ 0.35
37.0 0％ 100％ 0.35
37.1 100％ 0％ 0.35
46.0 100％ 0％ 0.35
46.1 100％ 0％ 0.05
50.0 100％ 0％ 0.05
h)LC-MS参数设置
Gas temperature 325℃、Gas Flow 6L/min、Nebulize 40psi、Sheath Gas Flow10L/min、Capillary 4000V(Positive)。
i)采用安捷伦定性分析软件提取各样品修饰核苷的峰信息。本例考虑信噪比不小于10的峰值作为可检测的核苷。然后将峰面积归一化为每个样品纯化tRNA的量。
本例按照以上方法，采用LC-MS+HPLC对比分析了非小细胞肺癌组织中和癌旁组织中的tRNA分子的2'-O-methyladenosine(Am)修饰水平，结果如图1所示，图1为LC-MS检测的肺癌组织和癌旁组织的tRNA修饰核苷峰面积。图1的结果显示，非小细胞肺癌的癌组织中的修饰水平显著低于癌旁组织，差异倍数1.81、P＝0.02260。并且，非小细胞肺癌细胞系及癌组织中tRNA修饰酶FTSJ1的表达水平也显著低于癌旁组织。细胞水平的检测发现，FTSJ1过表达可增加NSCLC癌细胞内Am修饰水平，结果如图4所示，图4为PC9细胞株过表达FTSJ1和正常情况下的tRNA修饰核苷峰面积；FTSJ1低表达则抑制NSCLC细胞内Am的修饰水平，结果如图5所示，图5为PC9细胞株敲低表达FTSJ1和正常情况下的tRNA修饰核苷峰面积。检测结果证明FTSJ1是tRNA分子Am的特异酶。
4.组织RNA提取
a)将液氮罐取出的组织标本置于冰上，用手术剪分离约40mg组织标本，放入研钵中，不断加入液氮研碎，直至成粉末状后加入1mLtrizol裂解，并转移至1.5mL EP管中，室温放置裂解20min。
c)加入1/5trizol体积的200μL氯仿，剧烈上下颠倒摇晃30s后室温静置10min，4℃12000g离心15min。
d)取上清400μL转移至新的EP管中，加入等体积异丙醇，摇匀30s后室温静置10min，4℃12000g离心10min。
e)弃上清，白色沉淀即为RNA，加入200μL 70％DEPC水溶的乙醇洗涤，4℃7500g离心5min后，弃上清，开盖干燥5min，加入30μLDEPC水，得到RNA溶液。
5.培养细胞RNA提取
a)在超净工作台中将培养的细胞弃旧培养基，用PBS清洗一遍。加入适量25％EDTA胰酶进行消化，5～10min后用2倍体积的完全培养基终止，置于做好标记的新EP管中，1000rpm5min离心后弃上清，加1mLtrizol重悬细胞，室温裂解20min。
b)加入1/5trizol体积的200μL氯仿，剧烈上下颠倒摇晃30s后室温静置10min，4℃12000g离心15min。
c)取上清400μL转移至新的EP管中，加入等体积异丙醇，上下轻柔颠倒摇匀30s后室温静置10min，4℃12000g离心10min。
d)弃上清，白色沉淀即为RNA，加入200μL 70％DEPC水溶的乙醇洗涤，4℃，7500g离心5min后，弃上清，开盖干燥5min，加入30μLDEPC水，得到RNA溶液。
6.反转录PCR(RT-PCR)
本例使用Takara逆转录试剂盒RR047A进行反转录。首先配制混合溶液10μL，包括：5×gDNA Eraser Buffer 2.0μL、gDNA Eraser 1.0μL、Total RNA 1.0μg，最后加RNaseFree dH2O至10.0μL。
反转录体系为20μL，包括：混合溶液10μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0μL、RT Primer Mix/specific Primer 1.0μL、4.0μL 5×PrimeScript Buffer 2、RNase FreedH2O 4.0μL。
反转录条件为：37℃15min、85℃5s，然后4℃待机。
反应完成即获得cDNA。
7.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
上述cDNA合成后，参照qPCR试剂盒(Takara,RR820A)说明，以如下体系加入八联管，每个标本做3复孔，内参基因为GAPDH。
反应体系为：TB Green Premix Ex TaqⅡ 10.0μL、cDNA 1.0μL、primer F(20μM)0.4μL、primer R(20μM)0.4μL、ddH2O 8.2μL，总计20μL。
其中primer F中包括等量的GAPDH内参基因上游引物以及FTSJ1基因特异性上游引物，primer R中包括等量的GAPDH内参基因下游引物以及FTSJ1基因特异性下游引物；FTSJ1基因特异性上游引物和FTSJ1基因特异性下游引物为本例针对FTSJ1基因设计的特异性引物，FTSJ1基因特异性上游引物为SEQ ID No.2所示序列，FTSJ1基因特异性下游引物为SEQ ID No.3所示序列。
SEQ ID No.2：5’-CCATTCTTACGACCCAGATTTCA-3’
SEQ ID No.3：5’-CCCTCTAGGTCCAGTGGGTAAC-3’。
GAPDH内参基因上游引物和下游引物为常规的内参基因扩增引物。
反应条件为：95℃变性10min，然后进入40个循环：95℃变性15s、60℃退火15s、72℃延伸30s，循环结束后65℃6s。退火收集荧光。
计算公式如下：△Ct＝Ct目的基因-Ct内参基因
△△Ct＝△Ct实验组-△Ct对照组；目的基因量＝2-△△Ct
实验组目的基因与对照组的相对表达变化倍数＝log2-△△Ct
qRT-PCR检测结果表明，tRNA的Am修饰酶FTSJ1在NSCLC癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织，结果如图2所示，图2为肺癌组织和癌旁组织中FTSJ1基因表达量的检测结果；三个NSCLC癌细胞H226、A549、PC9中FTSJ1的表达水平也显著低于BEAS-2b细胞，结果如图3所示，图3为NSCLC癌细胞H226、A549、PC9和正常气管上皮细胞系BEAS-2b中FTSJ1基因表达量的检测结果。
8.细胞培养和传代
NSCLC细胞株PC9、A549和293T细胞使用DMEM高糖培养基加10％南美胎牛血清(FBS)加1％青霉素-链霉素(P/S)培养；HCC827和NCI-H226细胞使用RIPM1640培养基加10％FBS进行培养加1％P/S培养；正常肺上皮细胞BEAS-2B使用DMEM高糖加10％FBS进行培养。培养条件为37℃5％CO2培养箱培养，3-5天传代。
a)细胞复苏
将细胞冻存管从液氮中取出，迅速转移入37℃水浴锅中不停摇动冻存管，在1-2分钟完全融化；将冻存管中细胞液吹匀后转移至15mL EP管中，并加入2倍体积完全培养基吹打混匀后离心，1000rpm，室温3min；弃上清后，加入1mL完全培养基重悬细胞，转入加有5mL完全培养基的60mm培养皿或者T25培养瓶；置于37℃5％CO2培养箱培养，3-5天传代。
b)细胞传代培养(以T25培养瓶为例)
从培养箱中取出细胞，显微镜下观察细胞状态，确定细胞状态良好且细胞密度达到80-90％时，进行细胞传代。吸去旧培养基；PBS轻柔的润洗2遍细胞，加入1mL含0.25％EDTA的胰酶，置于培养箱消化6.5分钟；例如PC9细胞，在显微镜下观察细胞变大变圆并轻微晃动培养瓶后可见细胞脱落时加入3mL完全培养基停止消化；转移至15mL离心管；室温离心1000rpm 3min；弃上清，加入1mL完全培养基重悬细胞；按照1:3比例进行传代；重悬细胞加入T75培养瓶；置于37℃5％CO2培养箱培养。
c)细胞的冻存(以100mm dish为例)
去掉上清液，加入2mL 0.25％的胰酶，消化1～2min后，加入2mL等体积新鲜培养基终止消化，使用移液枪吹打混匀，移入15mL离心管中。细胞离心1500rpm 5min。去掉上清。
在细胞沉淀中加入70％完全培养基+20％FBS+10％DMSO的细胞冻存液，重悬细胞，常规一个100mm dish冻存3支细胞。分装进细胞冻存管，放冻存盒中，放入-80℃超低温冰箱。
9.细胞转染
显微镜下观察，确定细胞状态良好且处于生长旺盛期时，可进行细胞瞬时转染。常规消化、离心、重悬细胞后用进行细胞计数；接种在6孔板中，按1.5×105孔铺板，24小时后细胞达70-80％。取出合成的siRNA或质粒DNA，siRNA用DEPC水配制为20μM母液；质粒DNA为0.5μg/μL。取出前日接种细胞，更换新鲜完全培养基2mL，按不同的试验组分别加入转染试剂、第一siRNA、第二siRNA、第三siRNA、空白质粒DNA后放入培养箱继续培养。
其中，转染试剂即本例的FTSJ1基因重组载体，本例采用的质粒为PcDNA3.1。具体的，用SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示序列的FTSJ1基因特异性引物扩增人全长FTSJ1序列，即扩增获得990bp的FTSJ1基因序列，本例为SEQ ID No.1所示序列。然后按照表达载体pcDNA3.1的使用说明书将SEQ ID No.1所示序列的FTSJ1基因片段克隆入表达载体pcDNA3.1中，命名为pcDNA3.1-FTSJ1。表达载体pcDNA3.1的图谱如图6所示，其中，NheI和HindIII之间为FTSJ1插入区间。
需要说明的是，本例按目的基因与载体量3:1～8:1的比例配置连接体系，具体的，连接体系包括：1μL的表达载体pcDNA3.1、1μL的PCR扩增回收产物、T4 ligase 0.5μL、10×ligase Buffer 1μL，然后加ddH2O至10μL。连接条件为16℃16h，即完成连接。连接产物采用热激法转化大肠杆菌感受态细胞，PCR鉴定阳性菌落，使用测序引物开展一代测序验证。
本例设计了3组siRNA，即第一对siRNA、第二对siRNA和第三对siRNA；分别测试每一对siRNA的干扰效果。
第一对siRNA的正义链和反义链的3’末端都具有T碱基粘性末端，其正义链为SEQID No.4所示序列，其反义链为SEQ ID No.5所示序列；第二对siRNA的正义链和反义链的3’末端都具有T碱基粘性末端，其正义链为SEQ ID No.6所示序列，其反义链为SEQ ID No.7所示序列；第三对siRNA的正义链和反义链的3’末端都具有T碱基粘性末端，其正义链为SEQID No.8所示序列，其反义链为SEQ ID No.9所示序列。
SEQ ID No.4：5’-GGAAUUCCAACUCUUCCAATT-3’
SEQ ID No.5：5’-UUGGAAGAGUUGGAAUUCCTT-3’
SEQ ID No.6：5’-CCAUGAUGUUGAUGAGUAUTT-3’
SEQ ID No.7：5’-AUACUCAUCAACAUCAUGGTT-3’
SEQ ID No.8：5’-GCAGCCGGAACUCUAGCAUTT-3’
SEQ ID No.9：5’-AUGCUAGAGUUCCGGCUGCTT-3’。
根据lipo3000使用说明书，以6孔板为例配制每孔实验用组分，先取A管加入lipofectamine3000试剂7μL，与125μL无血清培养基DMEM/1640充分混匀，再取B管加入siRNA 6μL/质粒DNA 5μL后加入P3000试剂5μL(siRNA不加)与125μL无血清培养基DMEM/1640充分混匀后，将A管与B管混合均匀，室温静置10min孵育后，滴加入对应6孔板孔中，摇晃混匀后放入培养箱继续培养，待转染48h后进行后续功能实验。同样的分别测试了加第一对siRNA、第二对siRNA或第三对siRNA的对照组，或者不加干扰RNA的试验组，以及空白对照组。
10.细胞增殖
瞬时敲低或过表达后的细胞在转染48h后，常规消化、重悬、计数，铺96孔板用cck8试剂盒进行细胞增殖水平检测。将每孔细胞数调整至5000个细胞后，每孔加200μL完全培养基，以每组5个平行复孔5个时间点进行96孔板接种铺板，放入培养箱培养。选取一个时间为0h，将该时间点5个平行复孔的旧培养基弃去，每孔重新加入预先混匀的100μL新鲜完全培养基及10μL cck8试剂，同时加入3个空白孔作为空白对照。在培养箱中孵育1h后，用酶标仪在波长450nm处测量吸光度值OD450。再以0h为基准，在24h、48h、72h、96h时以同样的方法用cck8孵育1h后检测。本例中，敲低即转染克隆质粒的同时采用siRNA干扰表达；过表达即采用克隆质粒增强表达；对照即正常细胞或者转染空白质粒的细胞。
细胞增殖实验结果显示，FTSJ1过表达可抑制NSCLC的生长，结果如图7至图9所示；图7是PC9细胞过表达FTSJ1的细胞增殖吸光度测试结果，其中，虚线为正常表达的测试结果，标记为“OE NC”，实线为过表达的测试结果，标记为“OE FTSJ1”；图8是A549细胞过表达FTSJ1的细胞增殖吸光度测试结果，其中，虚线为正常表达的测试结果，标记为“OE NC”，实线为过表达的测试结果，标记为“OE FTSJ1”；图9是HCC827细胞过表达FTSJ1的细胞增殖吸光度测试结果，其中，虚线为正常表达的测试结果，标记为“OE NC”，实线为过表达的测试结果，标记为“OE FTSJ1”。
反之，抑制FTSJ1的表达，即FTSJ1低表达，可促进NSCLC的增殖，结果如图10至图12所示；图10是PC9细胞敲低表达FTSJ1的细胞增殖吸光度测试结果，其中，虚线为正常表达的测试结果，标记为“si NC”，实线为敲低表达的测试结果，标记为“si FTSJ1”；图11是A549细胞敲低表达FTSJ1的细胞增殖吸光度测试结果，其中，虚线为正常表达的测试结果，标记为“si NC”，实线为敲低表达的测试结果，标记为“si FTSJ1”；图12是HCC827细胞敲低表达FTSJ1的细胞增殖吸光度测试结果，其中，虚线为正常表达的测试结果，标记为“si NC”，实线为敲低表达的测试结果，标记为“si FTSJ1”。
11.细胞迁移
瞬时敲低或过表达后的细胞在转染48h后，常规消化，用PBS重悬，计数。每组做3个平行复孔，故细胞量调整至3×105个细胞后，用300μL无血清培养基重悬。准备transwell小室和培养板，下室加入600μL完全培养基，上室加入100μL用无血清培养基重悬后的细胞悬液，每孔为105细胞量。放入培养箱培养，迁移12h后取出上室，用PBS清洗一遍后，弃下室培养基，加入600μL甲醇固定20min，再用结晶紫染色30min后用棉签擦去小室内侧细胞，在显微镜下观察并选取上、下、左、右、中5个视野的4×和10×放大倍数进行拍照，后用image J计数。
本例分别测试了PC9细胞和A549细胞敲低FTSJ1和未敲低FTSJ1表达情况下的细胞迁移率。PC9细胞敲低FTSJ1表达后，采用显微镜观察，其细胞迁移数量明显高于未敲低FTSJ1表达的PC9细胞，显微镜观察结果如图13和图14所示，统计结果如图15所示。图13是未敲低FTSJ1表达的PC9细胞迁移观察结果，图14是敲低FTSJ1表达的PC9细胞迁移观察结果。A549细胞敲低FTSJ1表达后，采用显微镜观察，其细胞迁移数量明显高于未敲低FTSJ1表达的A549细胞，显微镜观察结果如图16和图17所示，统计结果如图18所示。图16是未敲低FTSJ1表达的A549细胞的迁移观察结果，图17是敲低FTSJ1表达的A549细胞的迁移观察结果。结果显示，抑制FTSJ1的表达，即FTSJ1低表达，可促进NSCLC细胞的迁移。
相应的，本例分别测试了PC9细胞和A549细胞过表达FTSJ1和正常情况下细胞迁移率。其中，PC9细胞过表达FTSJ1后，采用显微镜观察，其细胞迁移数量明显低于正常PC9细胞，显微镜观察结果如图19和图20所示，统计结果如图21所示。图19是正常PC9细胞的迁移观察结果，图20是过表达FTSJ1的PC9细胞的迁移观察结果。A549细胞过表达FTSJ1后，采用显微镜观察，其细胞迁移数量明显低于正常A549细胞，显微镜观察结果如图22和图23所示，统计结果如图24所示。图22是正常A549细胞的迁移观察结果，图23是过表达FTSJ1的A549细胞的迁移观察结果。结果显示，过表达FTSJ1，可抑制NSCLC细胞的迁移。
12.细胞凋亡
瞬时敲低或过表达后的6孔板细胞在转染72-96h后，收集每孔旧培养基上清液中部分未贴壁的凋亡细胞，其余贴壁细胞进行消化，与培养基中凋亡的细胞合并后，用PBS重悬清洗一遍，调整细胞密度，取出1.0×106细胞；根据Annexin V，FITC ApoptosisDetection Kit试剂盒使用说明书，将将10×Annexin V Binding Buffer用超纯水稀释10倍到1×。用预冷的PBS再洗一遍细胞并离心，用100μl 1×Annexin-binding buffer重悬；向细胞悬液中加入5μL Annexin V Solution，再加入5μL PI Solution。在室温下避光培养15min。加入400μL 1×Annexin V Binding Solution，在1h内检测。流式细胞仪进行开机流程后，先处理空白组、PI单染组、Annexin V单染组细胞上机，作为阴性对照调节细胞流式仪电压及门，实验组随后上机，使用Flow Jo软件进行流式数据分析。
本例分别测试了PC9细胞和A549细胞过表达FTSJ1和正常情况下的细胞凋亡情况。其中，PC9细胞过表达FTSJ1后，流式细胞仪检测其细胞数量明显低于正常PC9细胞，流式细胞仪检测结果如图25和图26所示，细胞凋亡百分比统计结果如图27所示。图25是正常PC9细胞检测结果，图26是过表达FTSJ1的PC9细胞检测结果。A549细胞过表达FTSJ1后，流式细胞仪检测其细胞数量明显低于正常A549细胞，流式细胞仪检测结果如图28和图29所示，细胞凋亡百分比统计结果如图30所示。图28是正常A549细胞的检测结果，图29是过表达FTSJ1的A549细胞的检测结果。结果显示，过表达FTSJ1，能够促进NSCLC细胞凋亡。
相应的，本例分别测试了PC9细胞和A549细胞敲低FTSJ1表达和正常情况下的细胞凋亡情况。其中，PC9细胞敲低FTSJ1表达后，流式细胞仪检测其细胞数量明显高于正常的PC9细胞，流式细胞仪检测结果如图31和图32所示，细胞凋亡百分比统计结果如图33所示。图31是正常PC9细胞检测结果，图32是敲低FTSJ1表达的PC9细胞的检测结果。A549细胞敲低FTSJ1表达后，流式细胞仪检测其细胞数量明显高于正常A549细胞，流式细胞仪检测结果如图34和图35所示，细胞凋亡百分比统计结果如图36所示。图34是正常A549细胞的检测结果，图35是敲低FTSJ1表达的A549细胞的检测结果。结果显示，敲低FTSJ1表达，能够抑制NSCLC细胞凋亡。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (10)

1.一种tRNA修饰酶基因在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用，所述tRNA修饰酶基因为SEQ ID No.1所示序列的FTSJ1基因。
2.一种FTSJ1基因重组载体在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用，所述FTSJ1基因为SEQ ID No.1所示序列。
3.一种FTSJ1基因重组载体在制备提高非小细胞肺癌细胞中FTSJ1基因的表达的试剂中的应用，所述FTSJ1基因为SEQ ID No.1所示序列。
4.一种FTSJ1基因重组载体在制备抑制非小细胞肺癌细胞的细胞增殖的试剂中的应用，所述FTSJ1基因为SEQ ID No.1所示序列。
5.一种FTSJ1基因重组载体在制备抑制非小细胞肺癌细胞的细胞迁移的试剂中的应用，所述FTSJ1基因为SEQ ID No.1所示序列。
6.一种FTSJ1基因重组载体在制备促进非小细胞肺癌细胞的细胞凋亡的试剂中的应用，所述FTSJ1基因为SEQ ID No.1所示序列。
7.一种用于非小细胞肺癌检测的试剂，其特征在于：所述试剂能够特异性的检测非小细胞肺癌细胞中tRNA修饰酶基因的表达；
所述tRNA修饰酶基因为SEQ ID No.1所示序列的FTSJ1基因。
8.根据权利要求7所述的试剂，其特征在于：所述试剂为特异性的检测非小细胞肺癌细胞中tRNA修饰酶基因的引物对，所述引物对的上游引物为SEQ ID No.2所示序列，下游引物为SEQ ID No.3所示序列；
SEQ ID No.2：5’-CCATTCTTACGACCCAGATTTCA-3’
SEQ ID No.3：5’-CCCTCTAGGTCCAGTGGGTAAC-3’。
9.一种FTSJ1基因的干扰RNA，其特征在于：所述FTSJ1基因为SEQ ID No.1所示序列；所述干扰RNA为第一对siRNA、第二对siRNA和第三对siRNA中的至少一种；
所述第一对siRNA的正义链和反义链的3’末端都具有T碱基粘性末端，其正义链为SEQID No.4所示序列，其反义链为SEQ ID No.5所示序列；
所述第二对siRNA的正义链和反义链的3’末端都具有T碱基粘性末端，其正义链为SEQID No.6所示序列，其反义链为SEQ ID No.7所示序列；
所述第三对siRNA的正义链和反义链的3’末端都具有T碱基粘性末端，其正义链为SEQID No.8所示序列，其反义链为SEQ ID No.9所示序列；
SEQ ID No.4：5’-GGAAUUCCAACUCUUCCAATT-3’
SEQ ID No.5：5’-UUGGAAGAGUUGGAAUUCCTT-3’
SEQ ID No.6：5’-CCAUGAUGUUGAUGAGUAUTT-3’
SEQ ID No.7：5’-AUACUCAUCAACAUCAUGGTT-3’
SEQ ID No.8：5’-GCAGCCGGAACUCUAGCAUTT-3’
SEQ ID No.9：5’-AUGCUAGAGUUCCGGCUGCTT-3’。
10.一种用于非小细胞肺癌细胞中FTSJ1基因检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求7或8所述的试剂和/或权利要求9所述的干扰RNA。
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