CN111643516A - LncRNA XIST及与其结合的miR-132作为抑制胃癌细胞增殖、侵袭与转移的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种长链非编码RNA XIST和与之结合的miR‑132在抑制胃癌细胞增殖、侵袭与转移的用途。本发明的长链非编码RNA XIST的si‑XIST，能够沉默LncRNA XIST，导致LncRNA XIST对miR‑132的吸附能力下降，而miR‑132能与CUL4B的基因结合，最终下调CUL4B的表达，从而抑制胃癌细胞的增殖、侵袭转移及成瘤能力，促进胃癌细胞的凋亡。本发明公开的LncRNA XIST和miR‑132的应用可能有助于胃癌的靶向治疗和临床治疗。

Description

LncRNA XIST及与其结合的miR-132作为抑制胃癌细胞增殖、 侵袭与转移的用途
技术领域
本发明涉及一种与胃癌相关的长链非编码RNA和与其结合的microRNA在抑制胃癌细胞增殖、侵袭与转移中的用途，所述的长链非编码RNA为LncRNA XIST，所述的microRNA为miR-132，属于生物医药领域，具体属于分子生物学技术领域。
背景技术
胃癌(gastric carcinoma,GC)是一种常见的恶性肿瘤，在我国各种恶性肿瘤中发病率居首位。由于绝大多数胃癌早期无明显症状或特异性症状，因此容易被忽略，导致目前胃癌的早期诊断率较低。一旦发现，其已经发展至中晚期，导致其病死率很高，能达到75％。造成胃癌发生发展的原因主要有4种，一是地域环境及饮食生活因素，二是幽门螺杆菌(helicobacter pylori，Hp)感染，三是癌前病变，四是遗传和基因因素；其中，幽门螺杆菌感染。有是胃癌最主要的危险因素。目前已出现许多针对胃癌的先进的检查和诊断方法。其中，诊断方法有：X线钡餐检查、纤维胃镜检查、腹部超声、螺旋CT与正电子发射成像检查；或针对肿瘤标志物进行检测(如CEA、CA50、CA72-4、CA19-9等)；治疗方法有标准治疗，如手术治疗、化疗或靶向药物治疗。化疗药物常采用伊立替康(irinotecan)、紫杉烷(taxanes)、氟嘧啶(fluoropyrimidine)和铂碱(platinum base)等；靶向治疗药物有细胞凋亡促进剂、表皮生长因子受体抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、血管生成抑制剂、细胞周期抑制剂等。但胃癌患者的平均生存期仍然很低，只有约8-10个月，且预后很差，造成该现象的主要原因可能是胃癌的早期检测困难以及缺乏有效的治疗靶点。因此，研究者们将胃癌防控与治疗的方向的重点集中于针对胃癌的早期诊断和有效治疗靶点的研究。
进入21世纪后，随着现代生物技术突风猛进的发展，尤其是基因测序技术和基因组分析技术的成熟，科学家们发现大部分基因被转录为非编码RNA(non-coding RNA，ncRNAs)。根据RNA编码长度的不同，非编码RNA分为两种。一种为长度小于200个核苷酸的RNA，主要有微小RNA(miRNAs)，小干扰RNA(siRNAs)等。其中，miRNAs是一种小的(约22个核苷酸) 非编码RNA，在细胞增殖、分化、凋亡和癌变等多种生物学和病理过程中起着重要作用； miRNAs参与了肿瘤发展的各个阶段，表明在肿瘤发展过程中，miRNA的异常表达对已知癌基因或抑癌基因的表达起着重要的调节作用。有文献报道，在胃癌发生发展过程中，miRNA 可以发挥促进肿瘤发生发展或抑制肿瘤发生发展的作用，其在胃癌的诊断、预后、检测和治疗中有着巨大的研究和应用前景。另外一种非编码RNA由于长度超过200个核苷酸，因此被称为长链非编码RNA(long non-codingRNA,LncRNA)。长链非编码RNA的长度一般在200-100000 个核苷酸之间，位于细胞核或胞质内，按照其来源可分为反义长非编码RNA(Antisense LncRNA)，内含子非编码RNA(Intronic tran)，Long intergenc noncodingRNA(lincRNA)，启动子相关LncRNA(Promoter-associated LncRNA)，非翻译区LncRNA(UTRassociated LncRNA) 五种类型。LncRNA功能繁多，与人类疾病的发生、发展和防治息息相关。例如LncRNA可以参与调控表观遗传、转录及转录后水平上基因的表达；参与X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程。另外，也有文献报道，长链非编码RNA参与胃癌细胞的侵袭、迁移和淋巴结转移的过程中，其在胃癌的诊断、预后、检测和治疗中可能有着很好的研究价值和应用前景。因此，针对胃癌的早期诊断和/或治疗，筛选和进一步研究与胃癌发生发展相关的miRNAs和/或LncRNA是一个非常有前景的方向。
长链非编码RNA起到miRNA的海绵作用，能够调控靶基因的表达。LncRNA XIST(lncRNA X-inactive specific transcript，LncRNA XIST)是一种长链非编码RNA，该长链非编码 RNA在人类细胞基因维护、增殖和分化中具有重要作用，可对X染色体在转录水平上进行调控。科学家们发现LncRNA XIST在非小细胞肺癌(NSCLC)表达上调，而miR-137在非小细胞肺癌中表达异常下调。这说明LncRNA XIST是miR-137的竞争性内源性RNA(ceRNA)，可以促进NSCLC细胞的存活和侵袭；而miR-137靶向paxillin(PXN)的3'UTR，则可以抑制非小细胞肺癌细胞的活力和侵袭；同时，miR-137与PXN表达呈负相关，即LncRNA XIST 与PXN表达呈正相关。Paxillin(PXN)作为一种具有多种功能的局灶性粘附适配蛋白，在局灶性粘附、肿瘤进展和迁移、内皮细胞屏障功能障碍、炎症反应和氧化应激等方面发挥重要作用。PXN在人类癌症进展中也经常出现异常表达，有报道称PXN与胃癌细胞系AGS的细胞侵袭性相关。同时，有研究发现，PXN基因敲除或miR-137异常表达可明显抑制结直肠癌细胞体外增殖、迁移和侵袭，抑制肿瘤生长和转移。因此抑制miR-137诱导的PXN过表达促进了结直肠癌肿瘤的转移和发展，其可作为结直肠癌患者独立的预后指标。此外，miR-132在胃癌组织中的表达水平明显高于相应的正常组织，其与更多的淋巴结转移、更多的淋巴管癌栓和更多的胃癌晚期有关，因此，miR-132也可作为胃癌患者的有效预后因素，成为胃癌的另一个有希望的诊断和/或治疗靶标。在胃癌的发生和发展中，miR-132和/或LncRNA XIST 可能通过PXN或者其他的靶点起着重要作用，为科学家们在胃癌的诊断和/或治疗中提供成为一个新的研究方向。
发明内容
为了研究与胃癌相关的miRNA和相关的长链非编码RNA在胃癌中的作用，从而筛选合适的可以作为抑制胃癌细胞增殖、侵袭与转移的用途的相关的长链非编码RNA或miRNA。我们从医院收集了手术切除的65例胃癌及癌旁组织，通过相关的技术手段，从中找到了可以作为抑制胃癌细胞增殖、侵袭与转移中的用途的LncRNA XIST和与其能够直接结合的miR-132。
因此，本发明一方面提供了一种LncRNA XIST，所述的LncRNA XIST的si-XIST作为抑制胃癌细胞增殖、侵袭与转移的用途。
优选地，本发明所述的LncRNA XIST的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
优选地，本发明所述的si-XIST的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
优选地，本发明所述的si-XIST的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
另一方面，本发明还提供了一种能与LncRNAXIST直接结合的miR-132作为抑制胃癌细胞增殖、侵袭与转移的用途。
优选地，本发明所述的miR-132的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
优选地，本发明所述的miR-132的靶基因为CUL4B。
优选地，本发明所述的miR-132在胃癌细胞中与CUL4B基因的3’UTR结合。
本发明的si-XIST，能够沉默LncRNA XIST，导致LncRNA XIST对miR-132的吸附能力下降，最终下调CUL4B的表达，从而抑制胃癌细胞的增殖、侵袭转移及成瘤能力，促进胃癌细胞的凋亡。另外，本发明的miR-132能够与CUL4B的基因结合，下调CUL4B的表达，从而抑制胃癌细胞的增殖、侵袭转移及成瘤能力，促进胃癌细胞的凋亡。本发明公开的 LncRNA XIST和miR-132的应用可能有助于胃癌的靶向治疗和临床治疗。
附图说明
其中，*表示P<0.05，表示有显著性差异。
图1LncRNA XIST在胃癌组织和细胞系中的表达及定位：
图1A：RT-PCR检测LncRNA XIST在胃癌组织及癌旁正常组织中的相对表达水平，其中 Adjacent normal tissues表示癌旁正常组织，GC tissues表示胃癌组织；
图1B：RT-PCR检测LncRNA XIST在无转移的胃癌组织中和有转移的胃癌组织中的相对表达水平，其中without metastasis表示无转移的胃癌组织，with metastasis表示有转移的胃癌组织；
图1C：RT-PCR检测LncRNA XIST在不同胃癌细胞系中的相对表达水平；
图1D：FISH实验，LncRNA XIST表示长链非编码RNA XIST的定位，merge with DAPI表示长链非编码RNA XIST与细胞核的共同定位，图中红色部分代表LncRNA XIST，蓝色部分代表细胞核，×200。
图2LncRNA XIST参与调控胃癌细胞生物学功能【si-NC组(不进行任何处理)、si-XIST-1 组(转染干扰XIST-1质粒)、si-XIST-2(转染干扰XIST-2质粒)】：
图2A：qRT-PCR检测LncRNA XIST的表达；
图2B：EdU检测各组细胞增殖能力(×400)，其中EDU表示增殖的细胞，DAPI染细胞核，表示全部的活细胞，Merge表示EDU和DAPI重合的细胞；
图2C：细胞划痕实验检测各组细胞的迁移能力(×40)；
图2D：Transwell检测各组细胞侵袭能力(×200)；
图2E：流式细胞术检测各组细胞凋亡能力；
图2F：小鼠体内成瘤实验检测LncRNA XIST对肿瘤形成生长的影响。
图3XIST与miR-132的结合关系预测及其对胃癌细胞生物学功能的影响【mimic-NC组(不进行任何处理)、miR-132 mimic组(转染miR-132 mimic质粒)、inhibitor-NC组(不进行任何处理)、miR-132 inhibitor组(转染miR-132 inhibitor质粒)、miR-132 mimic+si-XIST组(同时转染miR-132 mimic和si-LncRNA XIST质粒)】：
图3A：miR-132 与LncRNA XIST的结合位点，其中Lnc RNA XIST-WT表示野生型，Lnc RNA XIST-MUT表示突变型；
图3B：miR-132与LncRNA XIST的荧光活性检测结果；
图3C：RIP检测LncRNA XIST、miR-132与Ago2结合；
图3D：RNA-pull down分析LncRNA XIST与miR-132的结合，其中NC-miR-132表示不处理对照组，WT-miR-132表示野生型组，MUT-miR-132表示突变组；
图3E：EdU检测各组细胞增殖能力(×400)，其中EDU表示增殖的细胞，DAPI染细胞核，表示全部的活细胞，Merge表示EDU和DAPI重合的细胞；
图3F：细胞划痕实验检测各组细胞的迁移能力(×40)；
图3G：Transwell检测各组细胞侵袭能力(×200)；
图3H：流式细胞术检测各组细胞凋亡能力；
图3I：小鼠体内成瘤实验检测miR-132对肿瘤形成生长的影响。
图4miR-132与CUL4B(Cullin-4B)的靶向预测及XIST、miR-132与CUL4B的相关表达统计【mimic-NC组(不进行任何处理)、miR-132 mimic组(转染miR-132 mimic质粒)、inhibitor-NC 组(不进行任何处理)、miR-132 inhibitor组(转染miR-132 inhibitor质粒)、miR-132 mimic+si-XIST组(同时转染miR-132 mimic和si-LncRNA XIST质粒)】：
图4A：miR-132与CUL4B的结合位点；
图4B：miR-132与CUL4B的荧光活性检测结果；
图4C：WB检测CUL4B蛋白表达灰色显影图；
图4D：WB检测CUL4B蛋白表达柱形统计。
图5 CUL4B的表达对胃癌细胞生物学功能的影响【oe-NC组(不进行任何处理)、oe-CUL4B 组(转染CUL4B过表达质粒)、oe-CUL4B+si-XIST组(同时转染oe-CUL4B和si-LncRNAXIST 质粒)】：
图5A：qRT-PCR检测LncRNA XIST的表达；
图5B：EdU检测各组细胞增殖能力(×400)，其中EDU表示增殖的细胞，DAPI染细胞核，表示全部的活细胞，Merge表示EDU和DAPI重合的细胞；
图5C：细胞划痕实验检测各组细胞的迁移能力(×40)；
图5D：Transwell检测各组细胞侵袭能力(×200)；
图5E：流式细胞术检测各组细胞凋亡能力；
图5F：小鼠体内成瘤实验检测CUL4B对肿瘤形成生长的影响。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步阐述本发明。下述实施例中所涉及各种原料，如无特别说明，均为市售。
实验方法：
1.1样本收集
收集我院2015年2月1日至2017年2月1日手术切除并经病理证实为胃癌及癌旁组织(距癌变部位5cm以上，病理检查无癌组织)标本65例，标本来源患者中男42例、女23例，年龄29～82岁，平均(57.35±17.74)岁。所有患者术前均未接受任何放化疗。其中无区域淋巴结转移(N0)有13例，有1～6个区域淋巴结转移(N1)有16例，有6～15个区域淋巴结转移(N2)有17例，有15个以上区域淋巴结转移(N3)的有19例。将收集的样本组织分为两类，其中一部分组织收集后立即存放于液氮罐中，另一部分用于后续实验的组织用多聚甲醛固定后进行石蜡包埋。本研究已通过我院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。
1.2细胞培养
培养人胃癌细胞株BGC-823、SGC7901、MKN45、MKN28、HGC-27、AGS和人正常胃粘膜上皮细胞株GES-1。除AGS细胞株外的上述细胞均使用含10％胎牛血清，100U/ml青链霉素溶液的RPMI-1640培养基，AGS细胞株使用含10％胎牛血清，100U/ml青链霉素溶液的F12培养基。所有细胞均置于条件为37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。当细胞密度达到 90％左右时，对细胞进行传代，将细胞瓶中的培养基吸弃掉，加1ml无菌PBS溶液洗一遍后加入1ml0.25％胰酶进行消化。在显微镜下观察，当细胞呈现出椭圆形时，加入4ml培养基终止消化，用移液管轻轻吹打混匀，将细胞计数后按一定的比例进行传代，并通过qRT-PCR 进行最终筛选。上述细胞系均购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
1.3细胞分组与转染
收集上述筛选得到的胃癌细胞SGC7901分为11组：si-NC组(不进行任何处理)、si-XIST-1 组(转染干扰XIST-1质粒)、si-XIST-2(转染干扰XIST-2质粒)、mimic-NC组(不进行任何处理)、miR-132 mimic组(转染miR-132 mimic质粒)、inhibitor-NC组(不进行任何处理)、miR-132 inhibitor组(转染miR-132 inhibitor质粒)、miR-132 mimic+si-XIST组(同时转染 miR-132 mimic和si-LncRNAXIST质粒)、oe-NC组(不进行任何处理)、oe-CUL4B组(转染CUL4B过表达质粒)、oe-CUL4B+si-XIST组(同时转染oe-CUL4B和si-LncRNA XIST质粒)。si-XIST、miR-132 mimic、miR-132 inhibitor、oe-CUL4B均购自广州锐博公司。细胞转染步骤如下：接种适量细胞至24孔板中并培养，当细胞密度为50％-60％时，按LipofectamineTM(美国Invitrogen公司)说明书操作对胃癌细胞进行转染。分别两个在无菌的EP管中配好lipofectamine 2000及待转RNA：1μL lipofectamine 2000+50μL无血清培养液，室温放置5min，待转RNA(20pmlo)+50μL无血清培养液；混合两EP管中液体使RNA与脂质体形成复合体，室温静置20min；最后将混合物加入到待转染的培养皿细胞中；置于37℃，5％CO2培养箱中继续培养，6～8h后换液加入完全培养基。
1.4FISH(Fluorescence in situ hybridization,FISH)
使用Flourescent in Situ Hybridization Kit(C10910,锐博生物，广州)在胃癌细胞中原位检测LncRNA XIST的表达。将细胞爬片置于24孔板孔底，取对数期生长的细胞消化至爬片上(约 6×104/孔)，使用4％多聚甲醛室温下固定10min；PBS清洗后，每孔加入1mL预冷的通透液， 4℃静置5min；弃去通透液后，加入1×PBS清洗细胞3次，每孔加入200μL预杂交液，37℃封闭30min；避光条件下，把2.5μL 20Μm FISH Probe Mix储存液加入到杂交液中；弃去每孔细胞中的预杂交液，加入适量含有探针的探针杂交液，避光，37℃杂交过夜；避光，42℃，洗液Ⅰ清洗每孔细胞，以降低背景信号，避光，42℃，洗液Ⅱ清洗细胞1次；避光，42℃，洗液Ⅲ清洗细胞1次；避光，1×PBS清洗细胞n。DNA染色：避光，DAPI染色液染色10min；避光，1×PBS清洗细胞3次。封片：避光条件下，从孔中小心取出细胞爬片，用封片剂将其固定于载玻片上，进行荧光检测。LncRNA XIST的特异性探针由锐博生物有限公司合成。
1.5双荧光素酶报告检测
使用生物学预测网站进行LncRNA XIST、miR-132与CUL4B的结合位点分析，并获取含有作用位点的片段序列。分别克隆扩增LncRNA XIST全长、CUL4B的3’UTR区到pmirGLO(E1330，Promega，USA)Luciferase载体上，命名为pLncRNA XIST-Wt和pCUL4B-Wt。分别构建pLncRNA XIST-Mut和pCUL4B-Mut载体，内参为表达海肾荧光素酶的pRL-TK载体 (E2241，Promega，USA),miR-132 mimic组与mimic-NC组分别与荧光素酶报告载体共转染 SGC7901细胞(CRL-1415，ATCC，USA),Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit (GM-040502A，前尘生物，中国)于560nm(萤火虫RLU)和465nm(海肾RLU)下检测荧光强度，萤火虫RLU/海肾RLU比值判断结合强度。
1.6RNA-pull down检测
将胃癌细胞SGC7901用0.25％胰蛋白酶(Gibco，USA)消化后，离心取沉淀并加入RIP 裂解液重悬，冰上裂解5min，将裂解液等分为若干份(其中一份作为input)，置于-80℃。采用Magnetic RNA-Protein Pull-Down试剂盒(Pierce，USA)，取1μg生物素标记的RNA与EP管中，加入500μL Structure Buffer，95℃水浴2min，后冰浴3min。充分重悬磁珠，取50μL磁珠悬液于EP管中，4℃过夜。3000rpm离心3min，弃上清。加入500μL RIP Wash Buffer冲洗3次，加10μL细胞裂解液，室温静置1h。将孵育好的磁珠-RNA-蛋白混合物中的蛋白洗脱下来。BCA 法测蛋白浓度后，Western-blotting检测蛋白表达。
1.7 RIP(RNA Immunoprecipitation，免疫共沉淀)检测
用含RNasin(Takara)和蛋白酶抑制剂混合物(B14001a，Roche，USA)的裂解缓冲液(25mM Tris-HCL pH7.4，150mM NaCl，0.5％NP-40，2Mm EDTA，1mM NaF和0.5mM二硫苏糖醇)裂解胃癌细胞。将裂解液在12000g下离心30min后取上清，然后加入抗人Ago-2 的磁珠(BMFA-1，百迈客生物，中国)，对照组则加入抗IgG的磁珠。4℃下孵育4h后，用洗涤缓冲液(50mM Tris-HCL，300Mm NaCl pH7.4,1mM MgCl2，0.1％NP-40)洗涤珠子3次。用TRIzol从磁珠中提取RNA,通过RT-PCR检测LncRNA XIST。
1.8 RT-PCR
取对数期生长的胃癌细胞SGC7901SGC7901进行转染，24h后收集细胞采用Trizol(15596026，Invitrogen，Car，Cal，USA)法进行总RNA的提取。按照PrimeScript RT reagentKit(RR047A，Takara，Japan)反转录试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA。反应条件为： 37℃，15min；85℃，5s，体系20μl。设计LncRNA XIST、miR-132、CUL4B、U6和GADPH 的引物，交由上海生工设计并合成(见表1)。逆转录实验体系20μl，参照EasyScript First-Strand cDNASynthesis SuperMix(目录号AE301-02，北京全式金，中国)说明书进行。取反应液进行实时荧光定量PCR操作，反应体系为20μl：10μl SYBR Premix、cDNA模板2μl，上下游引物各0.6μl及DEPC水6.8μl。应用美国ABI公司的7500型荧光定量PCR进行RT-PCR实验，反应设定条件为：95℃预变性30s，95℃变性30s，退火20s，72℃延伸30s，40个循环。 2-△△Ct表示实验组与对照组目的基因表达的倍比关系，公式如下：△Ct＝CT(目的基因) －CT(内参)、△△Ct＝△Ct实验组－△Ct对照组。Ct为反应的实时荧光强度达到设定的阈值时所经过的扩散循环数，此时扩散是呈对数期增长[PMID：16531770]。(此处实验重复3 次)计算细胞中LncRNAXIST、miR-132、CUL4B的表达量。
表1 RT-PCR引物序列
Figure BDA0002447830970000081
1.9 Western blotting
取处于对数生长期的胃癌细胞SGC7901按细胞分组情况进行转染，48h后移除细胞瓶中的细胞培养液，用预冷的PBS洗三遍，加入事先配好的RIPA裂解液于冰上裂解30min，14000g 离心10min取上清，用BCA法测定蛋白质浓度后保存于-20℃备用。然后使用SDS-PAGE凝胶试剂盒配制10％分离胶和5％积层胶，在聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离蛋白后采用湿转方法将蛋白转至NC膜上，5％BSA室温下封闭1h。滴加稀释的一抗鼠抗人CUL4B(ab32084，1:1000)，4℃过夜，次日用PBST洗膜3次，每次10min，用5％脱脂牛奶稀释二抗山羊抗鼠多克隆抗体 (ab6785,1:2000)后，室温置于摇床震荡1h，再次用PBST洗膜3次，每次15min。加入显影剂并通过bio-Rad凝胶成像系统显影(MG8600，北京托摩根生物科技有限公司，中国)，使用IPP7.0 软件(Media Cybernetics，Singapore)进行定量分析。CUL4B条带与内参GAPDH灰度值的比值代表各自的含量。以上抗体均来自Abcam，Cambridge，MA，USA。
1.10 EdU(5-ethynyl-2’-deoxyuridine)检测
EdU检测试剂盒购自于锐博生物有限公司，中国。Triton X购自于索莱宝公司，中国。取对数期生长细胞按5×104孔接种于96孔板中，等贴壁正常生长后，每孔中加入500μl，50μmol/l EdU培养基，37℃孵育2h，。用40g/l多聚甲醛固定20min后，2mg/ml的甘氨酸孵育10min，PBS 清洗两次。然后加入500μl0.5％Triton X透化细胞，再加入Apollo染色反应液温室避光孵育 30min，PBS清洗两次，加入Hoechst33342反应液避光室温孵育30min，0.5％Triton X清洗两次，倒置荧光显微镜下观察。Image-Pro Plus6.0专业图像分析软件(IPP)细胞数目进行计数。
1.11划痕实验
将胃癌细胞SGC7901种在6孔板的每孔中，每孔5×105个细胞。贴壁后进行转染，24h 后用200μL无菌枪头比着直尺在细胞表面划出一条直线，PBS清洗3次之后置于倒置显微镜 (奥林巴斯CX23)下拍照(×100)，48h后再次取出六孔板进行拍照并测量划痕愈合率。
1.12Transwell实验
用预冷的无血清DMEM培养基以1:10稀释Matrigel(BD，美国)，吸取充分混匀的Matrigel，每上室加入100μL稀释后的Matrigel，室温放置2h；使用前加入200μL无血清1640培养基冲洗，将上述各组转染24h后的干细胞消化后用无血清DMEM培养基重悬，计数并稀释至3×105个/mL，取100μL加入Transwell(Corning，美国)上室中，同时往下室中加入600μL10％血清的DMEM培养基(血清作为趋化因子)，按照Transwell小室说明书操作，结晶紫染色，随机选取三个视野并计数跨膜的细胞数。
1.13流式细胞术检测
采用AnnexinV-FITC/PI双染法试剂盒(556547，上海硕嘉生物技术有限公司，中国)检测培养转染48h后的SGC7901干细胞凋亡情况，实验步骤如下：用去离子水10×Binding Buffer 稀释成1×Binding Buffer，各组细胞温室2000rpm离心5min，收集细胞。随后预冷1×PBS重悬，200rpm离心5-10min，洗涤细胞。之后加入300μL 1×Binding Buffer悬浮细胞。加入 5μLAnnexin V-FITC(异硫氰酸荧光素)混匀后，避光室温温育15min。上机流式细胞仪(Cube6， Partec，Germany)前5min加入5μL的PI(碘化丙啶)，冰浴避光5min，激发波长为480nm， 530nm检测FITC和大于575nm检测PI。
1.14裸鼠成瘤
BALB/C裸鼠，4周龄，体重18-22g，雌雄不限，共66只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，于SPF环境下饲养，每组6只。将1×106个胃癌细胞SGC7901接种于裸鼠皮下，肿瘤体积每一周监测1次。肿瘤体积使用V＝π/6(高度×长度×宽度)公式计算。第三周末处死裸鼠，取出肿瘤后收集，测量肿瘤的质量。所有实验操作均遵循国际实验动物伦理公约，符合国家相关规定。
实施例1 LncRNA XIST在胃癌组织和细胞系中显著上调
通过RT-PCR实验检测，发现LncRNA XIST在胃癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织(P ＜0.001)(图1A)；同时，在65例胃癌组织样本中，经过数据统计发现，无转移的胃癌组织(n＝20)中LncRNA XIST的相对表达水平比有转移的胃癌组织(n＝45)中的相对表达水平也明显降低(P＝0.001)(图1B)；与正常胃组织上皮细胞GSE-1相比，各胃癌细胞系中LncRNA XIS表达均显著升高,(图1C)，其中，SGC7901胃癌细胞中的表达相对最高，故后续选择此细胞系进行敲低处理，进行相关实验。既往文献表明LncRNA XIST作为ceRNA在细胞质中行使功能，为验证此功能，我们通过FISH实验(图1D)表明LncRNA XIST在细胞质中表达，表明 LncRNA XIST可能细胞质中行使功能。
实施例2 LncRNA XIST对胃癌细胞生物学功能的影响
为评价LncRNA XIST是否对胃癌细胞生物学功能产生影响，我们选择上述筛选得到的SGC7901胃癌细胞系，对其进行干扰处理，结果表明，相比于si-NC组，si-XIST-1和si-XIST-2 组中LncRNA XIST表达显著降低，表明转染成功(图2A)。
然后通过EdU、划痕、Transwell、流式细胞术分别检测各组胃癌细胞增殖(图2B)、迁移(图2C)、侵袭(图2D)及凋亡(图2E)情况，结果表明，与si-NC组相比，si-XIST-1 组与si-XIST-2组的细胞增殖能力明显下降、迁移侵袭能力显著降低，同时si-XIST-1组与 si-XIST-2组的细胞凋亡率显著上升，而si-XIST-1组与si-XIST-2组无明显差异(P<0.05)；裸鼠成瘤实验结果表明(图2F)，随着时间的延长，肿瘤体积逐渐增加，与si-NC组相比，同一时间点si-XIST-1组与si-XIST-2组的肿瘤体积与质量明显下降，si-XIST-1组与si-XIST-2组无明显差异(P<0.05)。以上结果表明敲低LncRNAXIST的表达抑制胃癌细胞增殖、侵袭转移及成瘤能力，促进胃癌细胞的凋亡。
实施例3 LncRNA XIST可竞争性吸附miR-132
既往文献中表明LncRNA XIST作为ceRNA的机制存在，故我们首先通过在线预测软件分析LncRNA XIST与miR-132的结合位点(图3A)。然后通过双荧光素酶报告基因验证，结果显示(图3B)，与NC组相比，Wt-LncRNA XIST的miR-132结合区域的荧光素酶活性被 miR-132抑制，而LncRNA XIST突变型未受到抑制，说明miR-132能特异性结合LncRNA XIST。免疫共沉淀实验表明(图3C)，与IgG相比，Ago2结合的LncRNA XIST与miR-132 明显增加(P<0.05)，表明LncRNAXIST与miR-132可以结合Ago2蛋白。RNA-pull down实验表明(图3D)，与MUT-miR-132对比，WT-miR-132结合的Ago蛋白明显增加(P<0.05)，表明miR-132和LncRNAXIST可以直接结合。
我们进一步在细胞中转染miR-132和LncRNA XIST，并通过EdU、划痕、Transwell、流式细胞术分别检测各组胃癌细胞增殖(图3E)、迁移(图3F)、侵袭(图3G)及凋亡(图3H) 情况，与mimic NC组以及inhibitor NC组相比，miR-132 mimic组的胃癌细胞增殖能力显著下降，且迁移侵袭能力均显著降低；同时，miR-132 inhibitor组胃癌细胞增殖能力显著增加，且迁移侵袭能力均显著上升，而且miR-132 mimic组的细胞凋亡率显著上升，miR-132inhibitor 组的细胞凋亡率则显著降低，miR-132 inhibitor+si-XIST组无明显差异(P<0.05)，但相比 miR-132 inhibitor组,miR-132 inhibitor+si-XIST组的增殖能力显著下降，迁移侵袭能力均显著降低，细胞凋亡率上升(P<0.01)；裸鼠成瘤实验结果表明(图3I)，随着时间的延长，肿瘤体积逐渐增加；与mimic NC组以及inhibitor NC组相比，同一时间点，miR-132 mimic组的肿瘤体积与质量明显下降，miR-132 inhibitor组的肿瘤体积与质量显著上升，miR-132 inhibitor+si-XIST组的肿瘤体积与质量无明显差异(P<0.05)。以上结果表明过表达miR-132 可负向调节LncRNA XIST的表达抑制胃癌细胞增殖、侵袭转移及成瘤能力，促进胃癌细胞的凋亡。
实施例4 LncRNA XIST调节miR-132的靶基因CUL4B
通过在线预测软件分析(图4A)，miR-132与CUL4B 3’UTR区存在结合位点，CUL4B是miR-132的靶基因。双荧光素酶报告基因预测结果显示(图4B)，与NC组相比，CUL4B 野生型3’UTR的荧光素酶活性能被miR-132抑制(P<0.05)，而CUL4B突变型3’UTR的荧光素酶活性没有被抑制(P<0.05)。说明miR-132能特异性结合CUL4B 3’UTR区并在转录后水平下调CUL4B基因表达。Western blotting实验结果表明(图4C、图4D)，与mimic NC组以及inhibitor NC组相比，miR-132 mimic组中CUL4B的蛋白表达量显著降低，而miR-132inhibitor组中CUL4B的蛋白表达量显著增加(P<0.05),miR-132 inhibitor+si-XIST组中CUL4B 的蛋白表达无明显差异(P<0.05)；同时，相比miR-132 inhibitor组，miR-132inhibitor+si-XIST 组中CUL4B的蛋白表达量显著降低(P<0.05)。以上结果表明，LncRNAXIST可能通过竞争性结合miR-132参与CUL4B的调控。
实施例5 CUL4B对胃癌细胞生物学功能的影响
为评价CUL4B是否对胃癌细胞生物学功能产生影响，我们选择上述筛选得到的SGC7901 胃癌细胞系，对其进行过表达处理，结果表明，相比于oe-NC组，oe-CUL4B-1和oe-CUL4B-2 组中CUL4B表达显著升高，表明转染成功(图5A)。
然后通过EdU、划痕、Transwell、流式细胞术分别检测各组胃癌细胞增殖(图5B)、迁移(图5C)、侵袭(图5D)及凋亡(图5E)情况，与oe-NC组相比，oe-CUL4B组的细胞增殖能力、迁移侵袭能力均显著上升，oe-CUL4B+si-XIST组无明显差异(P<0.05)，同时 oe-CUL4B的细胞凋亡率显著降低，而oe-CUL4B+si-XIST组无明显差异(P<0.05)；裸鼠成瘤实验结果表明(图5F)，随着时间的延长，肿瘤体积逐渐增加；与oe-NC组相比，同一时间点，oe-CUL4B的肿瘤体积与质量明显上升，oe-CUL4B+si-XIST组无明显差异(P<0.05)。以上结果表明过表达CUL4B促进胃癌细胞增殖、侵袭转移及肿瘤形成，抑制胃癌细胞的凋亡。
上述说明并非对发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
<110> 湖南省科域生物医药科技有限公司
<120> LncRNA XIST及与其结合的miR-132作为抑制胃癌细胞增殖、侵袭与转移的用途
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 448
<212> DNA
<213> LncRNA XIST
<400> 1
tagttccctt accaccatgc cttatggtgt gtttaagaaa atatatcaag gttccataat 60
gtttttgaag attttatgtg ttctggtagg cttttcttga cacgtctttc atattttgat 120
atttgtaata tttttggaca atttttcatt tttaatgaat atttccttgt caggcatttt 180
agttgccatc tctgttttgt ggacttttgc acttaccttt cttttattcc atctctgttt 240
ttgcccatgg ggctacagat gactgcatgt cctccttccc cgtcccttca ctccatgccc 300
agtggggctg tggatactta cctgctttta attcgttttg ttttttccct cctccttctc 360
ttttttttct tctaaatttg cccatctggg ctgtggatac ctgctctttt ttttccccct 420
tagcccatcg gggccatgga tacctgct 448
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> si-XIST-1
<400> 2
ccttaccacc atgccttat 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> si-XIST-2
<400> 3
ccatgcctta tggtgtgtt 19
<210> 4
<211> 101
<212> DNA
<213> miR-132
<400> 4
ccgcccccgc gtctccaggg caaccgtggc tttcgattgt tactgtggga actggaggta 60
acagtctaca gccatggtcg ccccgcagca cgcccacgcg c 101

Claims (8)

1.一种长链非编码RNA，所述长链非编码RNA为LncRNAXIST，其特征在于，所述的LncRNAXIST的si-XIST作为抑制胃癌细胞增殖、侵袭与转移的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的LncRNAXIST的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的si-XIST的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的si-XIST的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。
5.一种能与权利要求1所述的LncRNAXIST直接结合的miR-132作为抑制胃癌细胞增殖、侵袭与转移的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的miR-132的核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示。
7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的miR-132的靶基因为CUL4B。
8.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的miR-132在胃癌细胞中与CUL4B基因的3’UTR结合。
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