CN111454949A - 长链非编码rna linc00702作为诊断和治疗膀胱癌标志物的应用 - Google Patents

Abstract

长链非编码RNA LINC00702作为诊断和治疗膀胱癌标志物的应用。本发明公开了一种用于治疗膀胱癌的长链非编码RNA，具体的所述长链非编码RNA为LINC00702。本发明公开了LINC00702在制备治疗膀胱癌的产品中的用途。本发明同时公开了一种治疗膀胱癌的药物组合物和一种评价LINC00702的试剂盒。本发明的药物组合物对膀胱癌有较好的抑制作用，在膀胱癌治疗中具有重要的参考和现实意义。本发明的试剂盒能够LINC00702的表达水平的评价手段之一，对LINC00702作为药物组合物应用时具有较好的衡量和指导作用。

Description

长链非编码RNA LINC00702作为诊断和治疗膀胱癌标志物的 应用

技术领域

本发明涉及一种与膀胱癌相关的长链非编码RNA及其在膀胱癌中应用，所述的长链非编码RNA为LncRNA LINC00702。属于生物医药领域，具体属于分子生物学技术领域。

背景技术

膀胱癌是全球第九大最常见的癌症，男性发病率极高，数据显示男性占所有膀胱癌病例的四分之三，男性占主导地位。分析比较在疾病的病因学和膀胱癌控制治疗的报告中的特定问题，发现导致膀胱癌发病的主要原因有两种，一种是内部遗传导致的，另一种是外部环境诱发的，如处于芳香胺类化学物质环境中或长期吸烟。调查结果显示，约有三成至五成的患者是由于吸烟引发的膀胱癌。此外，与长期与苯胺、二氨基联苯、2-萘胺、1-萘胺等芳胺类化学物质接触更易患膀胱癌。

研究发现约有90％以上的膀胱癌患者起初的临床表现是血尿。但这种症状与肿瘤发病程度并不完全出现正相关。血尿的出现是由于肿瘤出现坏死、溃疡、膀胱内肿瘤较大或数目较多、或膀胱肿瘤弥漫浸润膀胱壁等现象，压迫膀胱使膀胱容量减少或发生并发感染引起的。然而，无痛性血尿的出现仅能作为初步判断是否患有泌尿系肿瘤(特别是膀胱癌)的指标。其确诊还需要更精确的判断方法，其中最常用的诊断方法为膀胱镜检察。目前，膀胱癌的治疗方式较为单一，即采用手术治疗的同时辅以化疗(如膀胱内灌注化疗、根治手术术前化疗和术后辅助系统化疗)。

近年来的研究结果发现，膀胱癌虽的发病与进展与多种类固醇激素及其受体密切相关。有研究指出,长期使用糖皮质激素可引起膀胱癌发病率升高,这可能是由于糖皮质激素导致的免疫抑制。NF-kB、转录因子AP-1、Nrf2和STAT3、缺氧诱导因子HIF-1α等转录因子在膀胱癌患者细胞中的活性均发生了变化。

转录因子NFKB家族是免疫发育、免疫应答、炎症和癌症的关键调节因子。NF-κB信号系统对多种刺激都有反应，在配体-受体结合时，与特定信号相适应的不同的细胞信号通路被启动。NF-κB调控许多在肿瘤发生、发展过程中起关键作用的基因的表达，如增殖、迁移和凋亡等。在许多人类恶性肿瘤中已经发现了异常或构成性NF-κB激活。近年来，大量的研究集中于阐明NF-kB激活的功能后果及其信号机制。NF-kB已成为治疗癌症的一个有趣的治疗靶点。

研究发现它与人类癌症的发生、发展和对治疗的抗药性有着密切联系。有报道NF-kB信号在子宫颈癌发生发展中起着重要作用。NF-kB作为信号通路网络的一部分，它与其他基因的表达与功能的发挥有着重要作用(如与活性氧、p53、STAT3和miRNAs的交叉)。人乳头瘤病毒(HPV)感染引起的NF-κB活化在宿主的先天免疫和适应性免疫反应中起着重要作用。病毒通过诱导NF-kB的调节来清除由免疫系统触发的抑制其复制的活性，从而导致持续HPV感染的状态。严重的皮内瘤变和宫颈癌的发病过程中，NF-KB将会再次被激活。虽然NF-kB基因突变在实体肿瘤中很少见，但上游信号分子如RAS、EGFR、PGF、HER2的突变都与NF-kB信号增强有关。NF-κB能刺激突变基因的增殖并调节基因的转录。NF-kB活化还可诱导活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)和APOBEC蛋白的表达，为NF-kB通路与致癌基因突变提供了机制联系。抑制NF-kB具有逆转放疗和全身抗肿瘤药物的潜力，但目前尚无临床活性的NF-kB靶向策略。

miR-130a参与了肝细胞癌、子宫颈癌、卵巢癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、白血病等多种肿瘤的发病过程。证据表明miR-130a与耐药相关，在PI3K/Akt/PTEN/mTOR、Wnt/β-catenin和NF-kB/PTEN耐药信号通路中起中介作用。有文章报道，炎症因子激活可能是导致肿瘤的耐药与复发的重要原因，抑制NFκB信号通路可以降低膀胱癌细胞对顺铂的获得性耐药。

目前，国际上对于膀胱癌的研究越来越多，对其治愈方案也越来越深入。膀胱癌的相关致病基因的陆续发现研究，为膀胱癌的治疗提供科学基础。NF-kB、Nrf2和STAT3、缺氧诱导因子HIF-1α等转录因子与膀胱癌之间关系研究在持续深入，其对与膀胱癌的临床治疗提供科学的理论基础与指导。随着研究的不断深入，距离攻克膀胱癌这一癌症也将越来越近。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种长链非编码RNA标志物在筛选治疗膀胱癌的候选药物中的应用；本发明的目的之二在于提供一种评价该长链非编码RNA表达水平的试剂盒。

为了研究与膀胱癌相关的长链非编码RNA在膀胱癌中的作用，从而筛选合适的长链非编码RNA。我们通过生物信息学技术及现代分子生物学技术从膀胱癌组织中找到了可以作为膀胱癌标志物的LINC00702。

因此，本发明一方面本发明根据LINC00702基因的用途，提供了一种LINC00702在制备治疗膀胱癌的产品中的用途。

优选地，本发明所述的LINC00702如SEQ ID NO.1所示。

优选地，本发明所述的LINC00702的靶基因为NFKB1。

优选地，本发明所述的LINC00702通过招募NFKB1在DUSP1的启动子区富集，促进DUSP1基因的表达。

再一方面，本发明提供了一种治疗膀胱癌的药物组合物，所述药物组合物包括LINC00702。

优选地，本发明所述的药物组合物为含有LINC00702的质粒。

再一方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括检测LINC00702表达水平的试剂。

优选地，所述试剂为特异性扩增LINC00702的引物。

优选地，所述特异性扩增LINC00702的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

本发明通过生物信息学和现有的分子生物学的技术手段，从膀胱癌组织中筛选到用于膀胱癌治疗的标志物LINC00702(LINC00702在膀胱癌组织中低表达)。在此基础上，本发明一方面提供了一种LINC00702在制备治疗膀胱癌的产品中的用途；再一方面，本发明还提供了一种基于LINC00702的用于治疗膀胱癌的药物组合物；再一方面，本发明还提供了一种检测LINC00702的表达水平的试剂盒。本发明的LINC00702及其药物组合物对膀胱癌有较好的抑制作用，在膀胱癌治疗中具有重要的参考和现实意义。另外，本发明提供的检测LINC00702的试剂盒在LINC00702作为药物组合物应用于膀胱癌治疗时，对评价药物的持续作用时间和更准确的给药时间等提供了很好的帮助，对LINC00702作为药物组合物应用时具有较好的衡量和指导作用。

附图说明

图1 LINC00702参与膀胱癌的发生；图中A：膀胱癌芯片GSE7476中LINC00702的表达情况；B：starBase Pan-Cancer Analysis Platform中LINC00702在Bladder UrothelialCarcinoma肿瘤组织中低表达；C：qRT-PCR检测膀64例膀胱癌组织和癌旁组织中LINC00702的表达；D：Kaplan-Meier法分析LINC00702的表达水平与患者预后之间的关联；E：qRT-PCR检测4种膀胱癌细胞以及SV-HUC-1中的LINC00702的表达,*表示与SV-HUC-1细胞比较P<0.05；F：FISH检测HT1197细胞中LINC00702的表达定位，比例尺为25μm。采用均值±标准差表示计量资料(图中数值)，采用配对T检验进行两组间比较(图A)，采用单因素方差分析进行多组间比较(图C)，Tukey's进行事后检验。

图2 M2型TAM细胞在膀胱癌组织中的侵润状况。图中A:免疫组化方法检测膀胱癌组织和癌旁组织中M2型TAM细胞的侵润情况，200倍,*表示与Adjacent组相比P<0.05；B:免疫组化实验检测LINC00702的表达对膀胱癌组织中M2型TAM细胞侵润程度的影响，200倍，*表示与High LINC00702组相比P<0.05。图中数据均为计量数据，采用均值±标准差表示，两组间比较采用非配对样本T检验。

图3 LINC00702参与调控膀胱癌的增殖及其炎性微环境。图中A：qRT-PCR检测各组HT1197细胞中LINC00702的表达，*表示与oe-NC组相比P<0.05；B：CCK-8试剂检测细胞的增殖，*表示与oe-NC组相比P<0.05；C：EdU检测各组HT1197细胞的增殖情况，400倍，*表示与oe-NC组相比P<0.05；D：WB检测各组HT1197细胞增殖相关蛋白的表达情况；E：流式细胞术检测CD68的表达(实心图为同型对照，虚线为THP-1未用PMA激发的细胞，实线为THP-1细胞用PMA激发后的细胞)；F：RT-PCR实验检测THP-1细胞诱导分化后细胞中IL-10和IL-4mRNA的表达情况；G：qRT-PCR实验检测在M2型TAM细胞中过表达LINC00702的效率；H：ELISA检测各组M2型TAM细胞上清中IL-10、TNF-α、IL-4的表达,*表示与oe-NC组相比P<0.05。图中数据均为计量数据，采用均值±标准差表示，两组间比较采用非配对T检验(图A,C,D,F,G,H)，图B为重复测量方差分析，Tukey's进行事后检验。实验重复3次。

图4 LINC00702通过转录因子NFKB1调控DUSP1的表达。图中A：starBase Pan-Cancer Analysis Platform中LINC00702和DUSP1在Bladder Urothelial Carcinoma中表达正相关；B：GSE7476中DUSP1在膀胱癌中低表达；C：starBase Pan-Cancer AnalysisPlatform中DUSP1在Bladder Urothelial Carcinoma中低表达；D：qRT-PCR和WB检测DUSP1在膀胱癌组织中的表达，*表示与Normal组相比P<0.05；E：qRT-PCR和WB检测DUSP1在膀胱癌细胞中的表达，*表示与SV-HUC-1细胞相比P<0.05；F：64例膀胱癌组织中LINC00702和DUSP1表达的Pearson相关性分析；G：在HT1197细胞中进行双荧光素酶报告实验检测LINC00702对DUSP1启动子活性的影响，*表示与oe-NC组相比P<0.05，#表示与sh-NC组相比P<0.05；H：在HT1197和M2型TAM细胞中通过RIP实验验证LINC00702与转录因子NFKB1结合情况，*表示与lgG组相比P<0.05；I：RNA pull-down实验验证LINC00702与转录因子NFKB1结合情况；J：LINC00702与NFKB1具体结合位点的预测图；K：在HT1197和M2型TAM细胞中通过RNA pull-down实验验证转录因子NFKB1与mut-LINC00702的结合情况；L：网站分析得出NFKB1蛋白最有可能结合DUSP1启动子区域的3个位点；M：构建截短DUSP1重组荧光素酶报告基因载体与NFKB1表达载体共转染到HT1197和M2型TAM细胞中进行双荧光素酶报告实验，*表示与oe-NC组比较P<0.05；N：构建突变的DUSP1重组荧光素酶报告基因载体与NFKB1表达载体共转染到HT1197和M2型TAM细胞中进行双荧光素酶报告实验，*表示与oe-NC组比较P<0.05；O：HT1197和M2型TAM细胞中通过ChIP实验检测NFKB1在DUSP1启动子区域的结合位点2的结合能力，*表示与lgG组相比P<0.05；P：ChIP实验检测在HT1197和M2型TAM细胞中沉默LINC00702后NFKB1对DUSP1的富集情况，*表示与sh-NC组相比P<0.05；Q：HT1197和M2型TAM细胞中qRT-PCR和WB实验检测各组中DUSP1的表达，*表示与oe-NC+sh-NC组比较P<0.05，#表示与oe-LINC00702+sh-NC组比较P<0.05。

图5 LINC00702通过招募转录因子NFKB1调控DUSP1参与膀胱癌的增殖与炎性微环境。图中A：CCK-8检测各组HT1197细胞的增殖情况；B：EdU检测各组HT1197细胞的增殖情况，400倍；C：WB检测各组HT1197细胞增殖相关蛋白表达情况；D:ELISA检测各组M2型TAM细胞培养基上清液中后L-10、TNF-α、IL-4的表达。图中数据均为计量数据，采用均值±标准差表示，图A为重复测量方差分析，Tukey's进行事后检验，多组间比较采用单因素方差分析，*表示与oe-NC+sh-NC组相比P<0.05，#表示与oe-LINC00702+oe-NFKB1+sh-NC组相比P<0.05。实验重复三次。

图6 LINC00702在体内抑制膀胱癌细胞的致瘤性。图中A：裸鼠移植瘤直观图；B：裸鼠移植瘤平均体积；C裸鼠移植瘤平均质量；D：免疫组化检测各组裸鼠移植瘤中DUSP1的表达，400倍。图中数值均为计量资料，n＝10，采用均值±标准差表示，两组间比较采用非配对T测验(图C,D)，图B为重复测量方差分析，Tukey's进行事后检验。*表示与oe-NC组比较P<0.05。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。实施例中未进行详细说明的实验方法，通常按照本技术领域常规操作或按照厂商建议的条件进行。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品。

本发明经过广泛而深入的研究，通过生物信息学技术和分子生物学技术，检测膀胱癌组织中长链非编码RNA的表达水平，发现其中具有明显表达差异的长链非编码RNA片段，探讨其与膀胱癌的发生之间的关系，从而为膀胱癌的靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过实验，本发明发现膀胱癌组织中LINC00702显著性下调，进一步的实验证明，改变LINC00702的表达水平可以影响膀胱癌SC的生长，提示LINC00702可以作为药物靶标用于膀胱癌的精准治疗。

“生物标志物”与“标志物”可以等同替代，指代具有特异性生物学特性、生物化学特征或者方面的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度。在本发明中，“标志物”指与一个或多个生物分子相关的参数(即“生物标志物”)，例如天然或人工合成产生的核酸(即个体基因，以及编码和非编码DNA和RNA)。本发明中的“标志物”还包括指可通过考虑来自两个或多个不同标志物的表达数据计算或以其他方式获得的单个参数。在本发明中，术语“生物标志物”指代与膀胱癌相关联的基因、基因的片段或变体。

基于发明人的发现，本发明提供了一种LINC00702在制备治疗膀胱癌的产品中的用途以及由此制备的药物组合物和该药物组合物在治疗膀胱癌的应用，所述药物组合物的性质对本发明来说并不重要，只要它含有LINC00702基因的功能性即可，举例来说，本发明的药物组合物可以是以LINC00702基因的合成序列构建的重组质粒、其能抑制膀胱癌SC的自我更新(本发明的优先实施例中有详细介绍)。在此基础上，本发明根据LINC00702的核苷酸序列，以及LINC00702在膀胱癌的作用机制(LINC00702通过招募转录因子NFKB1在DUSP1的启动子区富集，促进DUSP1基因的表达。)从而设计出的针对提高LINC00702的基因表达的试剂或者其他组分，另外还可以设计直接提高DUSP1的基因表达的试剂或其他组分，这些试剂或组分都能起到治疗膀胱癌的作用，都应属于本发明的保护范围之内。例如，本发明提供的可以上调LINC00702的质粒或上调DUSP1的质粒。当然，人工直接合成的LINC00702或DUSP1也属于本专利的范围之内。

本发明的LINC00702或DUSP1可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

当然，本发明的药物组合物还可与其他治疗膀胱癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

在本发明的实施例中，一种代表性的人LINC00702基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1所示。本发明的LINC00702核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。

通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNAISH可用于确定染色体的结构。RNAISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测LINC00702的表达。

在某些实施方案中，所述试剂盒包含与一种或多种生物标志物的mRNA特异性结合的一种或多种探针。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含洗涤溶液。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含进行杂交试验的试剂、mRNA分离或纯化工具、检测工具以及阳性和阴性对照。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含使用该试剂盒的说明书。所述试剂盒可以定制供在家使用、临床使用或研究使用。举例说明，本发明提供的试剂盒是基于qRT-PCR实验来源的，本发明不仅提供了一种检测LINC00702的引物，还提供了具体的检测方法，在此基础上，本发明可以提炼出一种用于检测LINC00702表达水平的qRT-PCR检测试剂盒。该试剂盒在LINC00702作为药物组合物应用于膀胱癌治疗时，用于评价LINC00702的表达水平，从而对评价药物的持续作用时间和更准确的给药时间等提供帮助，这对LINC00702作为药物组合物应用时具有较好的衡量和指导作用。

一、实验方法

1.生物信息学方法分析

膀胱癌芯片GSE7476数据从National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库的子数据库Gene Expression Omnibus(GEO)数据库下载，运用R语言affy包对芯片表达数据进行标准化预处理，limma包进行差异基因筛选。

2.研究对象及膀胱癌组织的获取处理

获取膀胱癌组织和与其匹配的癌旁组织。64例膀胱癌患者癌组织及配对癌旁组织来源于2017年5月至2019年2月期间在我院因诊断为膀胱癌而接受部分切除术的患者，男44例、女20例，依据TNM分期：I期21例、II期19例、IIIa期24例。所取癌旁组织为术中切除的病变组织，经病理确诊不含癌细胞。对于所有标本的使用，病人已同意并签署了知情同意书，亦获得了我院伦理委员会批准。所有患者均进行临床随访,从初始手术日期到患者死亡日期计算患者的总生存期。四个膀胱癌细胞系(HT1197、HT1376、T24、UMUC3)以及正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1均购于美国模式培养物集存库(ATCC),用含有10％胎牛血清(FBS)、100ug/mL链霉素、100U/mL青霉素的DMEM(Gibco)完全培养基于37℃、5％CO2浓度和95％饱和湿度条件下的培养箱中进行培养(90％DMEM(高糖)+10％FBS+1％双抗)，待细胞生长密度为80％左右时进行细胞传代。

3.膀胱癌细胞培养、分组与转染

细胞转染分为9组：oe-NC、oe-LINC00702、sh-NC、sh-LINC00702、oe-NC+sh-NC、oe-LINC00702+sh-NC、oe-LINC00702+sh-NFKB1、oe-LINC00702+oe-NFKB1+sh-NC、oe-LINC00702+oe-NFKB1+sh-DUSP1。目的质粒均购于Dharmacon公司(Lafayette,CO,USA)。将细胞以密度3×105/孔接种于六孔板中，细胞生长密度达50％时候时即可使用lipofectamin 2000(Invitrogen)试剂盒进行转染。250μlOpti-MEM(Gibco)培养基分别稀释4μg目的质粒和10μl Lipfectamin2000，轻弹混匀。室温静置5min后将两液体均匀混合到一起，静置20min后滴加入细胞培养孔中，轻晃培养板混匀之后置于37℃，5％CO2细胞培养箱中继续培养，6h后更换培养基，转染后36-48h收集细胞。

4.巨噬细胞细胞导活化与鉴定

人单核细胞系THP-1

培养于含10％FBS的RPMI1640培养基中，于37℃、5％CO2的培养箱中传代培养。THP-1细胞经800g离心3min后换液或传代，须维持细胞圆、亮、单个的悬浮状态。悬浮的THP-1按照1×106/mL接种，PMA 60nmol/L诱导24h后细胞贴壁，加入IL-420nmol/L，继续培养18h即可获得M2型TAM细胞。

鉴定方法：悬浮的人THP-1单核细胞用PMA处理后，增殖停止并贴壁，流式细胞术检测CD68的表达，若CD68明显升高则表明其被成功诱导为了巨噬细胞。加入IL-4处理后可进一步诱导为M2型TAM细胞，M2型TAM细胞可高表达IL-10和IL-4。

5.qRT-PCR

采用Trizol(15596026，Invitrogen,Car，USA)提取总RNA,使用逆转录试剂盒(RR047A，Takara，Japan)将RNA反转录成cDNA，体系20ul，反应条件为：37℃，15min；85℃，5s；使用SYBR Premix EX Taq试剂盒(RR420A,Takara)进行加样，样品在实时荧光定量PCR仪(ABI7500,ABI,Foster City，CA，USA)中进行qRT-PCR反应，反应体系：SYBR Mix 9ul，正引物0.5ul，负引物0.5ul，cDNA 2ul，RNase Free dH2O 8ul。反应条件：95℃ 10min，95℃15s，60℃ 1min，连续进行40个循环。每个样品设置三个重复孔。LINC00702、GAPDH、DUSP1的引物由上海生工合成(引物序列见表1)。记录各孔Ct值，以GAPDH为内参，采用公式2-ΔΔCt法计算产物相对表达量。ΔΔCt＝(实验组目的基因平均Ct值-实验组管家基因平均Ct值)-(对照组目的基因平均Ct值-对照组管家基因平均Ct值)，实验重复三次。

表1引物序列

6.Westernblot

采用含有PMSF的RIPA裂解液提取组织或细胞中总蛋白,冰上孵育30min，4℃，8000g离心10min后取上清液。用BCA试剂盒(70-PQ0012，MultiSciences，中国杭州)检测总蛋白浓度。取50μg蛋白溶于2×SDS上样缓冲液中，100℃煮沸5min后，将上述各样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，湿转法将蛋白转移至PVDF膜，5％脱脂奶粉在室温下封闭1h，然后将PVDF膜与稀释的一抗兔抗Ki67(ab92742，1：1000，abcam，Cambridge，UK)，兔抗PCNA(ab92552，1：1000，abcam，Cambridge，UK)，兔抗DUSP1(ab61201，1：500，abcam，Cambridge，UK)，兔抗GAPDH(ab9485，1:2500，abcam，Cambridge，UK)为内参，4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次10min，将膜与HRP标记的二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab97051，1:2000，abcam，Cambridge，UK)孵育1h，TBST漂洗后，置于干净的玻璃平板上。取ECL荧光检测试剂盒(货号BB-3501，Ameshame公司，英国)中等量的A液和B液，暗室中混匀，将其滴加膜上，放入凝胶成像仪中曝光成像。用Bio-Rad图象分析系统(美国BIO-RAD公司)照相，用QuantityOnev4.6.2软件分析，以相应蛋白条带的灰度值/GAPDH蛋白条带的灰度值表示相对蛋白含量。实验重复三次取平均值。

7.RNA-FISH

采用FISH技术鉴定LINC00702的亚细胞定位。按照RiboTM lncRNAFISH Probe Mix(Red)(C10920，锐博生物，中国)说明书操作，具体方法如下：在24孔培养板中放入细胞爬片，取细胞按6×104/孔接种，使细胞融合率在60％-70％，1ml4％多聚甲醛室温固定10min，清洗，每孔加入1mL预冷的通透液(含0.5％TritonX-100的PBS)于4℃静置5min，清洗；每孔加入200uL预杂交液于37℃封闭30min；弃去每孔细胞中的预杂交液，加入250uL含有LINC00702探针(300ng/mL)(Eurogentec)的杂交液避光37℃杂交过夜；接下来的步骤直到结束也都要在避光条件下进行。42℃洗液I(4×SSC，0.1％Tween-20)、洗液II(2×SSC)、洗液III(1×SSC)、1×PBS依次清洗细胞3次，每次5min；DAPI染色液(1：800)染色10min，清洗，指甲油封片，荧光显微镜下(Olympus,Japan)，选取5个不同视野进行观察并拍照。

8.RIP

采用RIP试剂盒(millipore，USA)检测LINC00702与NFKB1蛋白的结合情况。用预冷PBS洗一遍细胞。用等体积的裂解液冰浴5min裂解细胞，14000g，4℃离心10min取上清。细胞提取液与抗体孵育进行共沉淀，具体步骤为：每一个共沉淀反应体系取50μL磁珠清洗后重旋与100μL RIP Wash Buffer中，依据实验分组加入1μg抗体孵育以便结合。磁珠-抗体复合物经清洗后与重悬于900μL RIP Wash Buffer，加入100μL细胞提取液4℃孵育过夜。样品置于磁座上收集磁珠-蛋白复合物。样品经蛋白酶K消化后提取RNA,用于后续PCR检测。RIP所用的抗体为：兔单克隆抗体anti-NFKB1(1：1000，ab28837,Abcam，Cambridg e，UK)温室混匀30min，以兔单克隆抗体IgG(ab2410，1：100，Abcam，Cambridge，UK)作为阴性对照。

9.RNApull-down

将生物素化的LINC00702和U6RNA与来自癌细胞的核提取物的蛋白质混合。使用链霉抗生物素蛋白-琼脂糖珠(ThermoScientific)纯化生物素标记的LINC00702和蛋白质的复合物。然后从RNA-蛋白质复合物中洗脱蛋白质，并使用NFKB1抗体进行免疫印迹检测。

10.CHIP

用甲醛固定各组细胞10min以产生DNA-蛋白质交联，超声破碎仪设置为每次超声10s，间隔10s，循环15次来破碎细胞打断染色质成片段，之后4℃12000g离心10min收集上清分成两管，分别加入阴性对照兔IgG(ab2410，1：100，Abcam，Cambridge，UK)和NFKB1抗体(1：1000，ab28837,Abcam，Cambridge，UK),4℃下孵育过夜充分结合。用Prote in Agarose/Sepharose沉淀DNA-蛋白复合物，12000g离心5min后丢弃上清，洗涤非特异性复合物，65℃过夜解交联，酚/氯仿抽提纯化回收DNA片段。设计能扩增出包含有NFKB1与DUSP1 DNA启动子结合的site3的引物(F：5'-GCAGGCGAAAACACACAAGC-3'，R：5'-GCCGAAAGCAAAATCCAATC-3')，扩增产物长338bp，包含NFKB1与DUSP1DNA启动子结合的site3的序列(759-769bp)，距离转录起始位点(TSS)1132bp。再设计一条能扩增出远离DUSP1 DNA启动子区域的序列的引物作为site3的引物的阴性对照(F：5'-ATTCT TCTTTTGATTTTTTTCCC-3',R：5'-CTAACCGTAGTCAGCATTGTGTG-3'),扩增产物长491bp，距离转录起始位点(TSS)4602bp。以回收纯化的DNA片段为扩增模版，分别加入sit e2引物和Distal引物(对照)进行qRT-PCR实验验证DUSP1 DNA的位点2是否是转录因子NFKB1结合的位点。

沉默LINC00702后最终得到含纯化的DNA片段的样品进行ChIP实验(方法同上)，sh-NC组作为对照，用site3的引物检测在DUSP1启动子位点3结合NFKB1抗体后的富集量的变化。

11.双荧光素酶报告基因实验

oe-NC、oe-LINC00702、sh-NC、sh-LINC00702分别与DUSP1-2Kb荧光素酶报告质粒进行共转染入HT1197细胞以检测LINC00702对DUSP1启动子活性的影响。海肾荧光素酶作为内参，转染48h后收集并裂解细胞，使用荧光素酶检测试剂盒(K801-200，Biovision公司)，荧光素酶报告基因检测采用双荧光酶报告基因分析系统(Promega，Madison,WI,USA)。海肾荧光素酶作为内参基因，根据萤火虫荧光素酶测定值RLU除以海肾荧光素酶测定值RLU所得到的比值来比较目的报告基因的激活程度。

通过UCSC和JASPAR两个网站分析得出NFKB1蛋白最有可能结合DUSP1 DNA的两个位点,构建截短或突变结合位点的重组荧光素酶报告基因载体与NFKB1表达载体共转染到HT1197和M2型TAM细胞中进行双荧光素酶报告实验验证NFKB1蛋白结合DUSP1 DNA的具体位点，具体方法步骤同上。

12.Elisa

IL-10、IL-4、TNF-α的ELISA试剂盒购自美国R&D Systems，具体测定方法按说明书进行。

13.CCK-8实验

将细胞消化后铺96孔板,每孔约2500个细胞。第二天进行细胞转染，继续培养1Day、2D ay、3Day、Day，加入10ul CCK-8溶液，培养箱中放置2h后将培养板放入仪器检测各孔在450nm处的吸光值(OD值),每组取8孔测定值做统计分析后，绘制生长曲线

14.免疫组化

取10％的甲醛固定标本，石蜡包埋连续切片厚4μm。将组织切片放入60℃温箱烘lh，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水。用0.1M柠檬酸钠修复，加热沸腾20min，自然冷却，然后用0.2mol/L PBS3次，每次5min；3％的过氧化氢酶灭活15min；0.2mol/L PBS3次，每次5min。0.2mol/L PBS溶液(PH7.4)洗5min×3次，擦干切片，滴加5％ BSA封闭液，37℃孵育30min。滴加入兔多克隆抗体CD163(1：500，ab182422，Abcam，Cambridge，UK)，4℃孵育过夜，0.2mol/L PBS溶液(PH7.4)洗5min，共3次；擦干切片后，37℃孵育生物素化的羊抗兔IgG(1：1000，ab6721，Abcam，Cambridge，UK)30min；配制显色剂，将DAB(DA1010，索莱宝科技有限公司，北京)的A、B、C试剂各l滴后加入蒸馏水l mL中，混匀，置4℃冰箱保存；0.2mol/L PBS溶液(PH7.4)洗5min，共3次；DAB显色，室温暗室保存8min；用自来水充分冲洗后，用苏木紫衬染、脱水、透明、封片，光学显微镜(XSP-36,博视达光学仪器有限公司,深圳,中国)下观察并摄片：每张切片随机选取5个高倍镜视野(×200)，每个视野数100个细胞，阳性细胞数<5％为阴性，阳性细胞≥5％为阳性。免疫组化结果由两人独立进行双盲评分。

15.流式细胞细胞(FCM)

流式细胞术检测细胞膜蛋白CD68的表达：取5x10⁵将上述方法培养过的细胞预冷的PBS洗两遍，4000g离心单细胞悬液3min后弃上清，加入Alexa488标记的鼠单克隆抗体CD68(1：50，ab222914，Abcam，Cambridge，UK)，冰上避光孵育30min，PBS洗去游离的抗体，加鞘液上机检测。实验重复三次。

16.裸鼠成瘤实验

BALA/C裸鼠，4周龄，体重16-24克，雌雄不限，共20只，随机分成两组，每组10只。分别取1×10⁶个稳转LINC00702和空载体的HT1197膀胱癌细胞，用50μL生理盐水重悬，加入50μLMatrigelMatrix，混合均匀后进行皮下注射。之后观察并记录肿瘤的体积，移植瘤的体积计算公式为：V＝(A×B²)/2(A为长径，B为短径，单位为mm3)，绘制每个时间点的平均体积。20天后采用二氧化碳窒息法处死裸鼠，取出瘤体测量肿瘤质量并拍照。所有动物实验均按照国家研究院动物健康护理指南的原则和程序进行，下述实验动物均用于医学研究，所有操作均经我院动物委员会讨论批准后进行。

17.统计学分析

所有数据均采用SPSS21.0(SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA)统计软件进行处理，计量资料采用均值±标准差的形式表示，癌组织及癌旁组织的比较采用配对t检验，其他两组间比较为独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，相关性分析采用pearson相关性分析。P<0.05表示差异具有显著性统计学意义。

二、实验结果

1、LINC00702在膀胱癌组织和细胞内低表达

通过对膀胱癌芯片GSE7476差异表达分析发现，LINC00702在膀胱癌中表达明显低于正常对照组织(图1A)，另外在starBase Pan-Cancer Analysis Platform(http://starbase.sysu.edu.cn/panCancer.php)中查询到在Bladder Urothelial Carcinoma中显著低表达(图1B)。

通过qRT-PCR检测64例膀胱癌组织和癌旁组织中LINC00702的表达(图1C)，结果显示：相对于癌旁组织，膀胱癌组织中LINC00702表达显著下调(P<0.05)。Kaplan-Meier法分析LINC00702的表达水平与患者预后之间的关联(图1D)，以表达的中位数(0.242)将例膀胱癌患者分为高表达组(n＝32)和低表达组(n＝32)，结果表明：低表达LINC00702的患者比高表达LINC00702患者的总存活率显着降低(P<0.05)。用qRT-PCR检测4种膀胱癌细胞HT1197、HT1376、T24、UMUC3和人正常膀胱上皮细胞(SV-HUC-1)中LINC00702的表达(图1C)，由图1D可知低表达LINC00702与膀胱癌患者预后不良相关，结果显示：与SV-HUC-1细胞相比，4种膀胱癌细胞中LINC00702的表达均显著下调(P<0.05),其中HT1197细胞LINC00702表达下调最显著，因此选择该细胞系进行后续实验。通过荧光原位杂交实验检测HT1197细胞中LINC00702的表达定位(图1E)，结果显示LINC00702主要表达于细胞核中。

2、膀胱癌组织中LINC00702的表达与肿瘤相关巨噬细胞(TAM)侵润相关

TAM巨噬细胞是肿瘤炎性微环境中浸润的主要炎性细胞之一，在癌细胞的炎性环境内巨噬细胞可以被诱导为M2型TAM细胞，其分泌产物L-10、TNF-α、IL-4具有促进肿瘤的侵袭转移和血管形成等作用，还可以与肿瘤干细胞相互作用，促进肿瘤发生、转移和耐药。用免疫组化方法检测膀胱癌组织和癌旁组织中M2型TAM细胞的侵润情况(图2A)，结果癌旁组织中几乎无M2型TAM细胞的侵润，而膀胱癌组织中M2型TAM细胞侵润情况显著加剧。然后我们通过免疫组化实验亦证明了低表达LINC00702的患者膀胱癌切片中具有更多的M2型TAM细胞侵润(图2B)，表明LINC00702的表达与M2型TAM细胞侵润程度负相关。

3、LINC00702抑制膀胱癌细胞的增殖调控炎性微环境

通过前面实验已知LINC00702在膀胱癌细胞内低表达，为了探究LINC00702对膀胱癌细胞的影响，在HT1197细胞中设置oe-NC组和oe-LINC00702组，qRT-PCR对HT1197的转染效率进行检测(图3A)，结果显示相对于oe-NC组，oe-LINC00702组中LINC00702的表达显著升高(P<0.05)，这表明转染效率较好，达到进一步实验的要求。通过CCK-8、EDU、WB检测各组HT1197细胞的增殖或增殖相关蛋白表达情况(图3B、C、D),结果显示：相对于oe-NC组，oe-LINC00702组细胞的增殖显著下降(P<0.05)，其中增殖相关蛋白Ki67、PCNA表达亦显著下降(均P<0.05)，这表明LINC00702可抑制了膀胱癌的增殖。为了探究LINC00702对膀胱癌肿瘤炎性微环境的影响，现选取肿瘤相关巨噬细胞(TAM)为研究对象。将人单核细胞系THP-1通过PMA+IL-4处理，流式细胞术检测CD68的表达明显增高(图3E)，表明THP-1被成功诱导为了巨噬细胞。再加入IL-4处理进一步将巨噬细胞诱导为M2型TAM细胞。RT-PCR实验显示诱导分化后细胞高表达IL-10和IL-4(图3F)，符合M2型TAM细胞的特征。在M2型TAM细胞中设置oe-NC组和oe-LINC00702组检测过表达LINC00702对膀胱癌细胞微环境的影响；通过qRT-PCR实验检测在M2型TAM细胞中过表达LINC00702的效率(图3G)，结果显示与oe-NC组相比，oe-LINC00702组细胞中LINC00702的表达显著上升(P<0.05)，这表明细胞的转染效率较好，达到了进一步实验的要求；ELISA检测两组M2型TAM细胞上清中IL-10、TNF-α、IL-4的表达(图3H)，结果显示，与oe-NC组相比，oe-LINC00702组细胞分泌的IL-10、TNF-α、IL-4炎性因子显著减少(P<0.05)。上述结果综合表明了LINC00702的表达对膀胱癌细胞的增殖有抑制作用，同时也可以抑制炎性微环境的发展。

4、LINC00702通过转录因子NFKB1调控DUSP1的表达

为了研究LINC00702的作用机制，我们在LncMAP数据库(http://bio-bigdata.hrbmu.edu.cn/LncMAP/)中预测到LINC00702可能通过转录因子NFKB1调控DUSP1。在starBase Pan-Cancer Analysis Platform中分析LINC00702与DUSP1表达相关性，发现他们在BLCA中表达正相关(图4A)。在GSE7476(图4B)和starBase(图4C)中均显示DUSP1也在膀胱癌中低表达。

qRT-PCR和WB检测DUSP1在膀胱癌组织或细胞中的表达(图4D、E)，结果显示：DUSP1在膀胱癌组织或细胞中较相应的对照组高表达(均P<0.05)。接着分析64例膀胱癌组织中L INC00702和DUSP1的表达相关性(图4F)，结果显示：LINC00702和DUSP1在膀胱癌组织中的表达成正相关(P<0.05)。

为了验证生信和网站分析得到的三者之间的调控机制，将oe-NC、oe-LINC00702、sh-N C、sh-LINC00702分别与DUSP1-2Kb荧光素酶报告质粒共转染到HT1197细胞中进行双荧光素酶报告实验检测LINC00702对DUSP1启动子活性的影响(图4G)，结果显示：oe-LINC00702组较oe-NC组DUSP1启动子活性显著升高(P<0.05)，而sh-LINC00702组较sh-NC组DUSP1启动子活性显著降低(P<0.05)，说明LINC00702可正调控DUSP1基因的表达。

为了进一步探讨验证LINC00702正调控DUSP1基因表达的机制，在HT1197和M2型TAM细胞中通过RIP实验验证LINC00702是否能与转录因子NFKB1结合(图4H)，结果显示：较lgG对照组，NFKB1结合的LINC00702显著增多(P<0.05)，说明NFKB1蛋白可特异性结合LINC00702，RNA pull-down实验进一步验证了该结果(图4I)。通过进一步分析，我们从JASPAR(http://jaspar.genereg.net/)网站预测到了转录因子NFKB1结合RNA的基序，通过搜索LINC00702的序列发现其14nt-21nt可能与转录因子NFKB1该基序结合(图4J)，然后我们突变LINC00702 14nt-21nt上的位点后在HT1197和M2型TAM细胞中进行RIP实验检测转录因子NFKB1与mut-LINC00702的结合情况(图4K)，结果表明：突变LINC0070214nt-21nt上的位点后，转录因子NFKB1就不能结合LINC00702了，该结果表明LINC00702 14nt-21nt上的位点(AUGACUCA)是转录因子NFKB1结合的具体位点。为了得知NFKB1蛋白结合DUSP1DNA的具体位点，本研究通过UCSC(http://genome.ucsc.edu/)和JASPAR(http://jaspar.genereg.net/)两个网站分析得出NFKB1蛋白最有可能结合DUSP1启动子区域的3个位点(图4L)，接着本研究通过构建截短或突变的DUSP1重组荧光素酶报告基因载体与NFKB1表达载体共转染到HT1197细胞和M2型TAM细胞中进行双荧光素酶报告实验(图4M&4N)，结果显示位点3是NFKB1蛋白结合DUSP1启动子区域的具体位点。接下来在HT1197细胞和M2型TAM细胞中通过ChIP实验检测NFKB1在DUSP1启动子区域的结合位点2的结合能力(图4O)，结果显示：与IgG组相比，NFKB1组中site2引物得到的扩增产物量较Distal引物显著增多(P<0.05)，而IgG组中两对引物的扩增产物量并无明显差异(P>0.05)，表明DUSP1启动子区域的位点3(TGGGACTCAGG)是转录因子NFKB1结合的具体位点。为了验证LINC00702在转录因子NFKB1和DUSP1 DNA两者调控中的重要作用，我们在HT1197细胞和M2型TAM细胞中沉默LINC00702进行ChIP实验(图4P)，结果显示：与sh-NC组相比，sh-LINC00702组NFKB1抗体富集得到的样品中，使用DUSP1site2引物进行qRT-PCR实验得到的扩增产物显著减少(P<0.05)。

接下来为了进一步证明LINC00702确实是通过招募结合转录因子NFKB1来调控基因DUSP1的表达，本研究在HT1197细胞和M2型TAM细胞中设置oe-NC+sh-NC、oe-LINC00702+sh-NC、oe-LINC00702+sh-NFKB1三个实验组，通过qRT-PCR和WB实验检测各组中DUSP1的表达(图4Q)，结果显示：oe-LINC00702+sh-NC组较oe-NC+sh-NC组中DUSP1的表达显著增多(P<0.05)，oe-LINC00702+sh-NFKB1组oe-LINC00702+sh-NC组中DUSP1的表达显著减少(P<0.05)，表明DUSP1的表达需由LINC00702招募结合转录因子NFKB1才能调控其表达。

5、LINC00702/NFKB1/DUSP1调控膀胱癌细胞的增殖与肿瘤相关炎症

为了进一步研究LINC00702/NFKB1/DUSP1轴对膀胱癌细胞的影响，本研究在HT1197细胞中设置oe-NC+sh-NC组、oe-LINC00702+oe-NFKB1+sh-NC组和oe-LINC00702+oe-NFKB1+sh-DUSP1组，通过CCK-8、EDU、WB分别检测各组HT1197细胞的增殖或增殖相关蛋白表达情况(图5A、B、C)，结果显示：oe-LINC00702+oe-NFKB1+sh-NC组较oe-NC+sh-NC组细胞增殖数目显著减少以及增殖相关蛋白Ki67、PCNA的表达显著下降，oe-LINC00702+oe-NFKB1+sh-DUSP1组较oe-NC+sh-NC组细胞增殖数目显著增多以及增殖相关蛋白Ki67、PCNA的表达显著上升，LINC00702+oe-NFKB1+sh-DUSP1组较oe-LINC00702+oe-NFKB1+sh-NC组细胞增殖数目显著增多以及增殖相关蛋白Ki67、PCNA的表达显著上升(均P<0.05)。

然后在M2型TAM细胞中亦设置oe-NC+sh-NC组、oe-LINC00702+oe-NFKB1+sh-NC组和oe-LINC00702+oe-NFKB1+sh-DUSP1组，ELISA检测各组M2型TAM细胞培养基上清液中IL-10、TNF-α、IL-4的表达(图5D)，结果显示：oe-LINC00702+oe-NFKB1+sh-NC组较oe-NC+sh-NC组细胞分泌的炎症因子IL-10、TNF-α、IL-4显著减少，oe-LINC00702+oe-NFKB1+sh-DUSP1组较oe-NC+sh-NC组细胞分泌的炎症因子IL-10、TNF-α、IL-4显著增多，LINC00702+oe-NFKB1+sh-DUSP1组较oe-LINC00702+oe-NFKB1+sh-NC组细胞分泌的炎症因子IL-10、TNF-α、IL-4亦显著增多(P<0.05)。以上结果说明LINC00702通过募集转录因子NFKB1促进DUSP1的表达从而抑制膀胱癌细胞的增殖，同时抑制M2型肿瘤相关巨噬细胞分泌炎性因子调控炎性微环境。

6、LINC00702在体内抑制膀胱癌细胞的致瘤性

为了探究LINC00702对膀胱癌细胞成瘤能力的影响本研究进行了裸鼠成瘤实验，实验结果显示(图6A-C)：与oe-NC组相比，oe-LINC00702组中裸鼠移植瘤的平均体积显著减小、重量显著减轻(P<0.05)。免疫组化检测两组裸鼠移植瘤中DUSP1的表达(图6D)，结果表明oe-LINC00702组较oe-NC组移植瘤中DUSP1的表达显著升高(P<0.05)。综上所述：在体内过表达LINC00702能够抑制膀胱癌细胞的致瘤能力。

综上所述，LINC00702在膀胱癌细胞里低表达，并可通过LINC00702-NFKB1-DUSP1轴导致膀胱癌细胞里NFKB1和DUSP1表达水平下降，而LINC00702可通过招募转录因子NFKB1促进DUSP1表达，进而上调DUSP1达到抑制癌细胞的增殖以及调控炎性微环境，表明在膀胱癌中LINC00702是潜在的治疗靶点，一种新的膀胱癌分子标记物，在制备治疗膀胱癌靶向药物中具有重要意义。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 湖南医睿通生物医药科技有限公司

<120> 长链非编码RNA LINC00702作为诊断和治疗膀胱癌标志物的应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 565

<212> DNA

<213> 长链非编码RNA LINC00702的核苷酸序列

<400> 1

gacacaactc cacatgactc agaagccctt cttaaaataa gaccagacca cattcatgga 60

ggctgagtca cctctaacct tccaaacttg tgtcttacca agaatgaaag gcaacctatg 120

taaaaactat gggctttcta gtataaataa aaactactca tctccagaaa ataaacaatg 180

actgctaaga tgattgaaaa aagaaaggag aagaaagtag cttgtaaaag cgtgtgaaat 240

gcattcacgt tggaatctcc tacaggcact tcagaagacg aagtgctcct gatggctgct 300

ttcaatcact ggaagaacca tgaaagtgcg agagattcct cccggtgaat gaagccagct 360

caccaccgtc aagggcaagg gatcagcgtg tgttcacatg gaggcctctc accgagggaa 420

cccaaggggg acagcacagg aattgcagag ccagcaccca tggaatgggc agggatttgg 480

gtttcatcca accagccagt tgatcaataa tcactgaatg tctgtcaccc attgcatcct 540

ctcctgagta gtgaggctag gccag 565

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcttcggcag cacatatact aaaat 25

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggccgaggca ggtggataac 20

<210> 4

<211> 2013

<212> DNA

<213> DUSP1的核苷酸序列

<400> 4

gcgaaggaca tttgggctgt gtgtgcgacg cgggtcggag gggcagtcgg gggaaccgcg 60

aagaagccga ggagcccgga gccccgcgtg acgctcctct ctcagtccaa aagcggcttt 120

tggttcggcg cagagagacc cgggggtcta gcttttcctc gaaaagcgcc gccctgccct 180

tggccccgag aacagacaaa gagcaccgca gggccgatca cgctgggggc gctgaggccg 240

gccatggtca tggaagtggg caccctggac gctggaggcc tgcgggcgct gctgggggag 300

cgagcggcgc aatgcctgct gctggactgc cgctccttct tcgctttcaa cgccggccac 360

atcgccggct ctgtcaacgt gcgcttcagc accatcgtgc ggcgccgggc caagggcgcc 420

atgggcctgg agcacatcgt gcccaacgcc gagctccgcg gccgcctgct ggccggcgcc 480

taccacgccg tggtgttgct ggacgagcgc agcgccgccc tggacggcgc caagcgcgac 540

ggcaccctgg ccctggcggc cggcgcgctc tgccgcgagg cgcgcgccgc gcaagtcttc 600

ttcctcaaag gaggatacga agcgttttcg gcttcctgcc cggagctgtg cagcaaacag 660

tcgaccccca tggggctcag ccttcccctg agtactagcg tccctgacag cgcggaatct 720

gggtgcagtt cctgcagtac cccactctac gatcagggtg gcccggtgga aatcctgccc 780

tttctgtacc tgggcagtgc gtatcacgct tcccgcaagg acatgctgga tgccttgggc 840

atcactgcct tgatcaacgt ctcagccaat tgtcccaacc attttgaggg tcactaccag 900

tacaagagca tccctgtgga ggacaaccac aaggcagaca tcagctcctg gttcaacgag 960

gccattgact tcatagactc catcaagaat gctggaggaa gggtgtttgt ccactgccag 1020

gcaggcattt cccggtcagc caccatctgc cttgcttacc ttatgaggac taatcgagtc 1080

aagctggacg aggcctttga gtttgtgaag cagaggcgaa gcatcatctc tcccaacttc 1140

agcttcatgg gccagctgct gcagtttgag tcccaggtgc tggctccgca ctgttcggca 1200

gaggctggga gccccgccat ggctgtgctc gaccgaggca cctccaccac caccgtgttc 1260

aacttccccg tctccatccc tgtccactcc acgaacagtg cgctgagcta ccttcagagc 1320

cccattacga cctctcccag ctgctgaaag gccacgggag gtgaggctct tcacatccca 1380

ttgggactcc atgctccttg agaggagaaa tgcaataact ctgggagggg ctcgagaggg 1440

ctggtcctta tttatttaac ttcacccgag ttcctctggg tttctaagca gttatggtga 1500

tgacttagcg tcaagacatt tgctgaactc agcacattcg ggaccaatat atagtgggta 1560

catcaagtcc atctgacaaa atggggcaga agagaaagga ctcagtgtgt gatccggttt 1620

ctttttgctc gcccctgttt tttgtagaat ctcttcatgc ttgacatacc taccagtatt 1680

attcccgacg acacatatac atatgagaat ataccttatt tatttttgtg taggtgtctg 1740

ccttcacaaa tgtcattgtc tactcctaga agaaccaaat acctcaattt ttgtttttga 1800

gtactgtact atcctgtaaa tatatcttaa gcaggtttgt tttcagcact gatggaaaat 1860

accagtgttg ggtttttttt tagttgccaa cagttgtatg tttgctgatt atttatgacc 1920

tgaaataata tatttcttct tctaagaaga cattttgtta cataaggatg acttttttat 1980

acaatggaat aaattatggc atttctattg aaa 2013

<210> 5

<211> 276

<212> DNA

<213> 内参基因GAPDH的核苷酸序列

<400> 5

gccgtcaacg accccttcat tgagaccaag tacgctgtga gtatcacccc cactttaccc 60

ctccataatg atatcacgtc tgctacaata acaccagctt catcggtaac cacgggaaaa 120

gagtcagagc tagtactctc gactctttgg acccaaggtt tcgattgggc tcgttgttgt 180

aatgatacga cgtgacacaa tcatgcagaa acagcccaaa caaaatttgc tgacagacaa 240

tcatcacagg cctacatgct caagtacgac tccacc 276

Claims (9)

1.一种长链非编码RNA，所述长链非编码RNA为LINC00702，其特征在于，LINC00702在制备治疗膀胱癌的产品中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的LINC00702如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的LINC00702的靶基因为NFKB1。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的LINC00702通过招募NFKB1在DUSP1的启动子区富集，促进DUSP1基因的表达。

5.一种治疗膀胱癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括LINC00702。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物为含有LINC00702的质粒。

7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测LINC00702表达水平的试剂。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂为特异性扩增LINC00702的引物。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增LINC00702的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

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