CN111269987A - 甲状腺癌的诊断预后标志物mapk8ip1p2及其用途 - Google Patents

甲状腺癌的诊断预后标志物mapk8ip1p2及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明首次发现在甲状腺癌组织中下调，并且在有淋巴结转移的甲状腺癌组织中下调更明显，MAPK8IP1P2下调预示甲状腺癌患者差的预后，并且过表达MAPK8IP1P2能抑制甲状腺癌细胞的体内成瘤。基于这些新的发现，本发明提出检测MAPK8IP1P2可用于诊断受试者是否患有甲状腺癌、甲状腺癌的淋巴结转移及生存预后，并且利用过表达MAPK8IP1P2的药物抑制甲状腺癌成瘤，为甲状腺癌的诊断预后和治疗提供新的策略。

Description

甲状腺癌的诊断预后标志物MAPK8IP1P2及其用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，更具体地涉及甲状腺癌的诊断预后标志物及其用途。
背景技术
甲状腺癌是最常见的内分泌系统肿瘤，女性患者居多，男女比例约为1:3。根据病理类型区分，甲状腺癌主要分为甲状腺乳头状癌(papillary thyroid cancer，PTC)、甲状腺滤泡癌(follicular thyroid cancer，FTC)、未分化甲状腺癌(anaplastic thyroidcancer,ATC)和甲状腺髓样癌(medullary thyroid cancer,MTC)。其中，约80-90％的甲状腺癌为PTC，是最常见的病理类型。近年来在我国，随着营养结构改变及老龄化趋势，甲状腺癌的发生率有显著增长的趋势，我国也已成为甲状腺癌的高发国家。其中，我国女性甲状腺癌发病年增长率(Annual percentagechange,APC)高达20.1％，位居各类肿瘤发病年增长率的首位。近些年，随着医疗技术水平的不断提高，甲状腺癌患者的5年生存率超过95％。然而，术后局部复发及淋巴结转移仍是手术治疗失败的主要原因，也是影响甲状腺癌患者预后的关键因素。因此，寻找新的甲状腺癌及其转移复发相关的诊断、预后标志物，对于疾病的早期诊断及治疗将提供重要的科学根据与指导，具有重大的科学意义及市场应用价值。
近年来，长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)在肿瘤发生发展、复发及转移中的作用逐渐成为研究热点。在哺乳动物基因组中，约98％的转录产物不具有蛋白编码功能，称之为非编码RNA(Noncoding RNA,ncRNA)。根据核苷酸序列长度，一般将长度大于200核苷酸的ncRNA定义为lncRNA。lncRNA在生物学过程中通过转录调控、转录后表观遗传调控及翻译水平调控，多层面参与基因表达的调控。大量的研究报道lncRNA在肿瘤淋巴结转移过程中发挥着重要作用。在甲状腺癌中，多个lncRNA被证实在甲状腺癌的发生和恶性进展中发挥着重要的作用。丝裂原活化蛋白激酶8相互作用蛋1伪基因2(Mitogen-Activated Protein Kinase 8 Interacting Protein 1 Pseudogene 2,MAPK8IP1P2)是一种lncRNA，至今未见任何关于MAPK8IP1P2在甲状腺癌中临床意义、生物学功能相关的研究报道。
发明内容
本发明提供了MAPK8IP1P2作为甲状腺癌的诊断预后标志物及其用途。
本发明的技术方案是：
试剂在制备鉴别受试者是否患有甲状腺癌试剂盒的用途，所述试剂用于对从受试者获得的生物样本进行MAPK8IP1P2的检测。
进一步的，检测MAPK8IP1P2 RNA水平的试剂包括与MAPK8IP1P2杂交的探针或特异性检测MAPK8IP1P2的引物。
试剂在制备鉴别甲状腺癌患者是否发生淋巴结转移试剂盒的用途，所述试剂用于对从甲状腺癌患者获得的生物样本进行MAPK8IP1P2的检测。
进一步的，检测MAPK8IP1P2 RNA水平的试剂包括与MAPK8IP1P2杂交的探针或特异性检测MAPK8IP1P2的引物。
试剂在制备预测甲状腺癌患者生存预后试剂盒的用途，所述试剂用于对从甲状腺癌患者获得的生物样本进行MAPK8IP1P2的检测。
进一步的，检测MAPK8IP1P2 RNA水平的试剂包括与MAPK8IP1P2杂交的探针或特异性检测MAPK8IP1P2的引物。
药物在制备预防或治疗甲状腺癌的用途，所述药物能够上调MAPK8IP1P2表达量。
进一步的，所述药物能靶向抑制HIF-1α；和/或抑制NF-κB信号通路。
进一步的，所述药物包括含MAPK8IP1P2基因的载体或MAPK8IP1P2的模拟物。
本发明通过对临床数据相似的甲状腺癌患者样本进行分析，包括对测序获得的信息进行mRNA表达谱分析，主成分因子、差异表达分析等研究，并通过功能性预测和实验摸索，最终获得本发明的技术方案。
关于技术方案一，本发明发现MAPK8IP1P2在甲状腺癌组织中下调。为此提出技术方案：试剂在制备鉴别受试者是否患有甲状腺癌试剂盒的用途，所述试剂用于对从受试者获得的生物样本进行MAPK8IP1P2的检测。
在一些技术方案中，从受试者获得的生物样本为甲状腺上皮组织。在一些技术方案中，当检测到甲状腺上皮组织出现MAPK8IP1P2低于设定阈值，可以判定组织发生癌变。在一些技术方案中，本技术方案所述阈值可以根据大量未患甲状腺癌的正常人群的甲状腺上皮组织MAPK8IP1P2的表达水平设定，用于区分是否患甲状腺癌。
关于技术方案二，本发明发现MAPK8IP1P2在有淋巴结转移的甲状腺癌组织中下调更明显。为此提出技术方案：试剂在制备鉴别甲状腺癌患者是否发生淋巴结转移试剂盒的用途，所述试剂用于对从甲状腺癌患者获得的生物样本进行MAPK8IP1P2的检测。
在一些技术方案中，从甲状腺癌患者获得的生物样本为甲状腺癌组织，在一些技术方案中，当检测到甲状腺癌组织出现MAPK8IP1P2低于设定阈值，可以判定组织发生淋巴结转移。在一些技术方案中，本技术方案所述阈值可以根据大量未发生淋巴结转移的甲状腺癌患者的甲状腺癌组织MAPK8IP1P2的表达水平与大量发生淋巴结转移的甲状腺癌患者的甲状腺癌组织MAPK8IP1P2的表达水平设定，用于区分是否患甲状腺癌淋巴结转移。
关于技术方案三，本发明意外地发现MAPK8IP1P2下调预示甲状腺癌患者差的预后，无进展生存时间更短。为此提出技术方案：试剂在制备预测甲状腺癌患者生存预后试剂盒的用途，所述试剂用于对从甲状腺癌患者获得的生物样本进行MAPK8IP1P2的检测。
在一些技术方案中，从甲状腺癌患者获得的生物样本为甲状腺癌组织，在一些技术方案中，当检测到甲状腺癌组织出现MAPK8IP1P2低于设定阈值，可以判定组织发生淋巴结转移。在一些技术方案中，本技术方案所述阈值可以根据大量未发生淋巴结转移的甲状腺癌患者的甲状腺癌组织MAPK8IP1P2的表达水平与大量发生淋巴结转移的甲状腺癌患者的甲状腺癌组织MAPK8IP1P2的表达水平的中位水平进行设定，用于预测甲状腺癌生存预后，比如无进展生存时间。
以上技术方案优选的方案中，检测MAPK8IP1P2水平的试剂为与MAPK8IP1P2杂交的探针，探针的形式包括但不限于单一探针、微阵列。在一些技术方案中，检测MAPK8IP1P2水平的试剂为特异性检测MAPK8IP1P2的引物，引物的形式包括但不限于单链核酸、带二级结构(如环、茎)核酸、修饰的核酸(如锁核酸修饰)。
关于技术方案四，本发明发现过表达MAPK8IP1P2能抑制甲状腺癌细胞的体内成瘤。为此提出技术方案：药物在制备预防或治疗甲状腺癌的用途，所述药物能够上调MAPK8IP1P2表达量。
在一些技术方案中，所述药物能靶向抑制HIF-1α；和/或抑制NF-κB信号通路。在一些技术方案中，所述药物包括含MAPK8IP1P2基因的载体或MAPK8IP1P2的模拟物。其中，lncRNA模拟物是lncRNA过表达的常见方式。
关于无/非淋巴结转移的解释，是指甲状腺癌患者不存在淋巴结转移，至于是否还有其他转移(如骨转移、肺转移等)都不考虑，换言之，无淋巴结转移的患者通常包括未发生任何转移的患者以及发生其他非淋巴结转移的患者。
本发明的有益效果是：
本发明首次发现在甲状腺癌组织中下调，并且在有淋巴结转移的甲状腺癌组织中下调更明显，MAPK8IP1P2下调预示甲状腺癌患者差的预后，并且过表达MAPK8IP1P2能抑制甲状腺癌细胞的体内成瘤。基于这些新的发现，本发明提出检测MAPK8IP1P2可用于诊断受试者是否患有甲状腺癌、甲状腺癌的淋巴结转移及生存预后，并且利用过表达MAPK8IP1P2的药物抑制甲状腺癌成瘤，为甲状腺癌的诊断预后和治疗提供新的策略。
附图说明
图1：甲状腺癌组织的MAPK8IP1P2相对表达量下调，图A为10例配对的甲状腺癌组织及其癌旁组织MAPK8IP1P2相对表达量；图B为扩大样品量后甲状腺癌组织(Malignancy)、良性甲状腺上皮组织(Beign)和癌旁正常组织(ANT)的MAPK8IP1P2相对表达量；图C为发生淋巴结转移(pN1)和未发生淋巴结转移(pN0)的患者甲状腺癌组织中的MAPK8IP1P2相对表达量；
图2：MAPK8IP1P2水平与甲状腺癌无进展生存时间的关系，其中L为低表达MAPK8IP1P2的甲状腺癌样本，H为高表达MAPK8IP1P2的甲状腺癌样本；
图3：上调或沉默MAPK8IP1P2的B-CPAP细胞或K1细胞的构建情况；图中，vector为对照质粒，MAPK8IP1P2为过表达MAPK8IP1P2的模型，sh#1为沉默MAPK8IP1P2的模型；
图4：上调或沉默MAPK8IP1P2的K1细胞构建的体内肿瘤模型情况，其中，图A为移植瘤的大小，图B为移植瘤的重量，图C为移植瘤的体积；图D为移植瘤组织中的脉管数量；图中，vector为对照质粒，MAPK8IP1P2为过表达MAPK8IP1P2的模型，sh#1为沉默MAPK8IP1P2的模型；
图5：上调或沉默MAPK8IP1P2的B-CPAP细胞或K1细胞中的信号通路的研究；图A为信号通路荧光素酶报告基因筛选体系结果图；图B为HIF-1α信号通路和NF-κB信号通路核蛋白的表达；图中，vector为对照质粒，MAPK8IP1P2为过表达MAPK8IP1P2的模型，sh#1为沉默MAPK8IP1P2的模型。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
下述实验例中所使用的实验方法或实验条件，如无特殊说明，均按常规方法或厂家说明书进行，下述实验例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
细胞培养
乳头状甲状腺癌细胞系，包括K1，B-CPAP，均购买自中科院上海细胞库。所有细胞均培养于二氧化碳浓度为5％，温度为37℃的细胞培养箱中。细胞生长于25cm2培养瓶中，加入5毫升RPMI 1640培养基(Invitrogen,USA)，培养基中加入终浓度为10％的胎牛血清(FBS,Life Technologies)。观察细胞状态及细胞密度，每隔1-2天更换培养基，待细胞密度长至80％时适宜实验使用。
组织标本和RNA提取
9个新鲜成对PTC组织标本和1个新鲜成对ATC组织标本来自吉林大学中日联谊医院的手术样品。所有标本的使用及其临床数据的采集均征得患者的知情同意，并通过了吉林大学中日联谊医院学术伦理委员会的审核与批准。取少量标本组织放入1.5ml无核酸离心管中(Eppendorf)。所有组织浸泡在消化缓冲液中(20mM Tris-HCl,10mM EDTA,1％SDS)，缓冲液中需加入蛋白酶K(Merck)。为使组织充分消化，将组织置于55℃培养箱孵育过夜。随后，用Trizol裂解组织，并按照说明书提取RNA。RNA需用无RNA酶蒸馏水重悬。用光度适应计定量备用。
实时定量PCR
使用Trizol试剂提取RNA，将2μg RNA进行逆转录反应，反应完成后将cDNA保存于-20℃备用。按照检测试剂盒说明书准备DNA扩增所需要的SYBR Green mix(Roche)，及相关引物(委托广州市锐博生物科技有限公司设计和合成)。在Bio-rad实时定量PCR仪，根据试剂盒说明书要求设置扩增反应条件，进行40个循环反应。GAPDH基因作为内参，所有样本至少设置3个副孔。目的基因DNA相对表达量通过Schmittgen and Livak 2-ΔΔCt公式计算得出。
Western blot
预冷的PBS冲洗培养于六孔板中的细胞，用蛋白提取液(62.5mmol/l Tris-HCl(pH6.8),2％SDS,10％glycerol和5％β-mercaptoethanol)收获细胞蛋白，细胞密度以60-70％为宜。该操作在4℃冷室进行或将六孔板置于冰上操作。分别配制分离胶和积层胶，每条泳道中加入等量样品蛋白并做好记录。SDS聚丙烯酰胺电泳跑胶1小时，恒压100V。然后转膜1小时，恒流100mA，将蛋白转移至PVDF膜上(Millipore)。室温下摇床上5％脱脂牛奶封闭1小时。用5％脱脂牛奶按照抗体说明书分别稀释一抗和二抗。一抗4℃孵育过夜。次日用TBST洗膜三次，每次10分钟。二抗室温下孵育1小时，后用TBST洗膜三次，每次10分钟。随后压片，曝光显影，所用抗体：抗兔HIF-1α、p65、p84。
质粒构建和转染
MAPK8IP1P2(HGNC:52402)的基因从基因组DNA中扩增得到，并构建进pMSCV-puro逆转录病毒载体(Clontech)中。siRNA和质粒的转染均使用Lipofectamine 3000脂质体转染系统(Life Technologies)，操作按试剂说明书操作。具体操作如下：转染前，将生长于T25培养瓶中的细胞用胰蛋白酶消化并计数细胞。按照2×105密度将细胞接种于六孔板，培养18～24小时待细胞完全贴壁后进行转染。根据Lipofectamine 3000转染试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)说明书按步骤进行转染：准备两个高压灭菌1ml离心管，分别加250μl Opti-Mem medium(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)入离心管，标记为T1和T2。T1加入5μl lipofectamine 3000，室温下静置5分钟；T2加入1μl浓度为500mg/ml MAPK8IP1P2质粒，室温下静置5分钟。5分钟后，将T1中的液体小心移入T2，轻弹T2管壁使液体混匀。将混匀后的T2室温下静置20分钟使lipofectamine 3000和质粒或抑制剂充分结合以达到最佳转染效果。用1.5ml无血清培养基替换六孔板细胞中培养基，并将细胞放回培养箱。20分钟后，将T2中混合液体小心加入细胞并轻摇六孔板使与lipofectamine 3000充分结合的质粒与细胞充分接触。将细胞放入培养箱中培养4-6小时后移去六孔板中的培养基，并用完全培养基(Ham's F-12 medium，10％胎牛血清)替换，每孔2ml。继续将细胞置于培养箱培养48～36小时备用。
裸鼠皮下移植瘤实验模型
动物实验均通过了吉林大学实验动物伦理委员会的审核和批准。将6周龄的BALB/c-nu裸鼠随机分为3组(每组6只裸鼠)，将1×106个细胞分别接种在裸鼠背部的皮下组织中。同时使用IVIS活体成像系统观察(IVIS imagining system,Caliper)肿瘤形成的大小。待肿瘤生长4-5周，安乐死动物并取出肿瘤。肿瘤体积用游标卡尺测量，体积用(L×W2)/2计算，同时称量后保存在液氮中。
免疫组化染色
先将组织切片65℃热处理1h后，置二甲苯脱蜡2次每次5min；将切片依次用100％乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇和纯水水化，每次1min；取出后滴加3％过氧化氢室温孵育10min灭活内源性过氧化物酶；将切片置于盛有EDTA pH9.0修复液的容器中，高压锅高压修复10min；取出切片后用免疫组化笔包围组织并用PBS缓冲液漂洗3min，甩干后滴加山羊血清封闭液(试剂A)室温孵育20min；去除试剂A滴加用抗体稀释液稀释好的CD31或D2-40一抗工作液4℃孵育过夜；去除一抗后用PBST缓冲液漂洗3次每次5min，甩干后滴入生物素标记的二抗工作液(试剂B)，室温孵育20min；弃去试剂B后用PBST缓冲液漂洗3次每次5min，甩干后滴加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素工作液(试剂C)，室温孵育10min；弃去试剂C后用PBST缓冲液漂洗3次每次5min，甩干后滴加DAB显色液，室温孵育1min～5min；将切片浸入自来水中终止显色，苏木素染液复染1min，自来水清洗后用盐酸酒精分化5s；将切片用75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇、100％乙醇梯度脱水，每次3min，再置37℃干燥箱处理30min，环保树脂封片剂封片。
信号通路荧光素酶报告基因筛选体系
信号通路荧光素酶报告基因筛选体系购买自clontech。荧光素酶基因检测实验在甲状腺癌细胞中进行。将信号通路荧光素酶报告基因筛选体系和MAPK8IP1P2沉默或过表达的质粒分别导入荧光素酶报告系统pGL3质粒(Promega,Madison,Wis.,USA)KpnI/HindIII位点，培养48小时。48小时后收获并裂解细胞为荧光检测备用。具体步骤按照荧光素酶基因检测试剂盒(Promega)手册逐步进行。实验组与对照组分别至少设置三个副孔。
统计学方法
每组实验重复3次以上，所得数据用Excel 2010、SPSS 21和GraphPad 5进行统计学的分析；重复试验的计量资料用均值±标准差表示，动物实验等单次实验的计量资料用中位值±四分位差(median±IQR)表示；两组间采用T检验，多组间比较采用单因素方差分析。临床数据中，分析MAPK8IP1P2与其他临床指标的相关性用卡方检验，生存分析使用Kaplan-Meier分析方法、log-rank检验及COX回归单因素分析及多因素分析，检验水平α＝0.05。
实验例1、MAPK8IP1P2在甲状腺癌组织中下调，并且在有淋巴结转移的甲状腺癌组 织中下调更明显
如图1所示，利用Realtime PCR在10例(9例PTC，1例ATC)配对的癌(图示Tumor)与癌旁对照组织(图示ANT)中，验证了MAPK8IP1P2在癌组织中明显下调(8/10例下调，图1A)，进一步扩大样品量，验证了相对于癌旁对照组织(图示ANT)和良性病变组织(图示Beign)，MAPK8IP1P2在癌组织中明显下调(图1B)，有趣的是，与无淋巴结转移的癌组织(图示pN0)相比，发生淋巴结转移的癌组织(图示pN1)中MAPK8IP1P2下调更显著(图1C)。以上结果表明，检测MAPK8IP1P2的水平不仅能够鉴别是否患甲状腺癌，并且能够区分甲状腺癌患者是否发生淋巴结转移。
实验例2、MAPK8IP1P2下调预示甲状腺癌患者差的预后
按MAPK8IP1P2的表达量中位值做区分，进一步分析MAPK8IP1P2表达水平与预后的关系，结果如图2所示，低表达组患者的无进展生存时间明显短于高表达组，表明MAPK8IP1P2在甲状腺癌组织中下调并预示患者差的预后。由此可见，检测MAPK8IP1P2的水平能够预测甲状腺癌患者的生存预后。
实验例3、过表达MAPK8IP1P2能抑制甲状腺癌细胞的体内成瘤
在B-CPAP和K1甲状腺癌细胞中，利用慢病毒构建了稳定表达MAPK8IP1P2及沉默MAPK8IP1P2的细胞模型，如图3所示，与各自的对照vector相比，稳定表达MAPK8IP1P2的细胞能够上调MAPK8IP1P2，而沉默MAPK8IP1P2(图示sh#1)的细胞能够下调MAPK8IP1P2。利用裸鼠皮下移植瘤模型，我们检测了K1细胞的体内成瘤情况，能观察到在甲状腺癌细胞中过表达MAPK8IP1P2能抑制其体内成瘤的大小，而沉默则促进(图4A)，分析移植瘤的肿瘤及生长曲线，也能明确，在甲状腺癌细胞中过表达MAPK8IP1P2能抑制其体内成瘤性，而沉默则促进(图4B和图4C)。重点分析了切片中脉管的密度，通过CD31及D2-40的免疫组化染色，我们能观察到单位面积的移植瘤切片中，过表达MAPK8IP1P2的脉管数量最少，而沉默则显著增加移植瘤组织中的脉管数量(图4D)，以上结果表明过表达MAPK8IP1P2能抑制甲状腺癌细胞的体内成瘤。
实验例4、过表达MAPK8IP1P2能抑制甲状腺癌细胞HIF-1α和NF-κB信号通路
利用信号通路荧光素酶报告基因筛选体系，我们观察了过表达或沉默MAPK8IP1P2对甲状腺癌细胞体内多条细胞通路的影响，发现过表达MAPK8IP1P2能抑制低氧反应(Hypoxia response)和NF-κB信号通路NF-κB pathway)，但促进抗氧化反应(Antioxidantresponse)，而沉默则作用相反(图5A)。进一步，利用免疫印迹检测了核内HIF-1α和p65的蛋白水平，可明确过表达MAPK8IP1P2能抑制核内HIF-1α和p65的蛋白水平，而沉默则作用相反(图5B)，表明过表达MAPK8IP1P2能抑制甲状腺癌细胞HIF-1α和NF-κB信号通路。

Claims (9)

1.试剂在制备鉴别受试者是否患有甲状腺癌试剂盒的用途，所述试剂用于对从受试者获得的生物样本进行MAPK8IP1P2的检测。
2.根据权利要求1的用途，其特征在于，检测MAPK8IP1P2的试剂包括与MAPK8IP1P2杂交的探针或特异性检测MAPK8IP1P2的引物。
3.试剂在制备鉴别甲状腺癌患者是否发生淋巴结转移试剂盒的用途，所述试剂用于对从甲状腺癌患者获得的生物样本进行MAPK8IP1P2的检测。
4.根据权利要求3的用途，其特征在于，检测MAPK8IP1P2的试剂包括与MAPK8IP1P2杂交的探针或特异性检测MAPK8IP1P2的引物。
5.试剂在制备预测甲状腺癌患者生存预后试剂盒的用途，所述试剂用于对从甲状腺癌患者获得的生物样本进行MAPK8IP1P2的检测。
6.根据权利要求5的用途，其特征在于，检测MAPK8IP1P2的试剂包括与MAPK8IP1P2杂交的探针或特异性检测MAPK8IP1P2的引物。
7.药物在制备预防或治疗甲状腺癌的用途，所述药物能够上调MAPK8IP1P2表达量。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述药物能靶向抑制HIF-1α；和/或抑制NF-κB信号通路。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述药物包括含MAPK8IP1P2基因的载体或MAPK8IP1P2的模拟物。
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