CN113549679A - LncRNA ANRIL在儿童急性淋巴细胞白血病中的临床应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因技术领域，公开了一种LncRNA ANRIL在儿童急性淋巴细胞白血病中的临床应用，调控基因的表达体为LncRNAANRIL；所述确定LncRNA ANRIL在ALL细胞系中的表达模式的方法包括：进行RNA提取及qRT‑PCR；进行细胞培养；进行RNAi实验；进行细胞增殖及凋亡测定；进行统计学分析。本发明采用qPCR分析ANRIL在儿童ALL中的表达模式及其在该病的临床诊断、分型、治疗等方面潜在的应用价值，并进行体外实验验证其异常表达对白血病细胞增殖及凋亡的影响，验证其重要的调控功能和生物学机制，为阐明ANRIL的调控机制及临床转化和应用提供指导，并进一步进行体外实验为ANRIL的临床转化和应用提供指导。

Description

LncRNA ANRIL在儿童急性淋巴细胞白血病中的临床应用
技术领域
本发明属于基因技术领域，尤其涉及一种LncRNA ANRIL在儿童急性淋巴细胞白血病中的临床应用。
背景技术
目前，急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia，ALL)是14岁以下儿童最常见的血液肿瘤。尽管随着诊断和分型水平的提高以及治疗方案的改进，5年生存率达到85％，但是难治和复发的ALL依然是儿童肿瘤死亡的首要因素。儿童ALL是一种包括多种亚型的复杂疾病，其发病机制涉及多种不同的遗传变异，如：染色体数目异常、重排以及点突变等。不同的变异通过影响细胞正常增殖、分化以及凋亡等多种关键的调控过程导致白血病的发生。因此，进一步探究儿童ALL发生发展过程的分子机制、寻找新的诊断及预后标志物是非常有必要的，具有重要的临床意义。
有研究发现一些基因的表达可以有效区分儿童ALL的亚型，从而调整治疗方案提高疗效。但是以上研究主要集中在蛋白基因，特别是一些疾病相关的代谢及信号转导通路相关基因。长链非编码RNA(LncRNA)是一类长度超过200nt且无蛋白编码能力的功能性RNA分子，近年来受到很多学者的关注，是RNA研究领域的热点。LncRNA能与多种生物分子结合，可调控染色质修饰、DNA甲基化、组蛋白修饰、转录激活或抑制等生物学过程，在表观、转录以及转录后等不同水平影响、调控基因表达。LncRNA不仅与蛋白基因相互作用，也与miRNA存在相互作用，形成复杂的调控网络，发挥复杂的调控功能。
LncRNA不仅与细胞生长、发育、代谢及凋亡等正常生理过程相关，而且在肿瘤发生、发展、侵袭及转移过程中起重要调控作用。目前已经发现大量肿瘤相关的lncRNA，其中一部分lncRNA可作为肿瘤诊断、分型、预后的标志物以及治疗靶标，有着重要的临床价值。如HOTAIR可与PRC复合体结合调控基因表达，在多种肿瘤中异常表达，其高表达与白血病、乳腺癌、肝癌、结直肠癌、胃癌等多种癌症的侵袭、转移及不良预后相关。最近基于pre-BcALL样本的研究，发现部分lncRNA表达可以准确分类疾病亚型，并且和预后相关。Dimitrios Papaioannou等人研究发现24个lncRNA可以作为AML的预后标志物，其表达模式与患者无事件生存率以及无病生存率显著相关，具有重要的临床价值，并且关联分析结果显示，lncRNA参与调控肿瘤相关的信号转导通路。Manon Ouimet等人在preB-cALL病例中发现5个显著上调的lncRNA，并且发现RP11-137H2.4与泼尼松龙耐药性相关。以上研究表明lncRNA不仅与白血病发病相关，还有可能作为白血病潜在的诊断及预后的标志物，但是其调控机制尚需要进一步深入研究。因此，筛选儿童ALL特异的lncRNA不仅有利于阐明其相关的调控机制，更有利于发现特异性高的诊断和治疗的分子标记物，对儿童ALL的早期诊断、指导治疗有重要的临床意义。
INK4区域反义链RNA(ANRIL或CDKN2B-AS1)由p15INK4b-p14ARF-p16INK4a簇转录，该区域与原癌基因诱导的细胞衰老相关。ANRIL缺失可以破坏SUZ12的结合，促进p15(INK4b)表达，抑制细胞增殖。全基因组关联分析(GWAS)揭示ANRIL所在区间与冠心病、动脉粥样硬化、II型糖尿病以及癌症等多种疾病的遗传易感性相关，部分SNP可改变ANRIL的结构和表达。CDKN2B、KLF2及P21在多种肿瘤中下调，作为抑癌基因调控肿瘤细胞周期、增殖、分化及转移，与多种肿瘤发生相关。CDKN2B基因是定位于染色体9p21区域的肿瘤抑制基因，属于p15/p20家族，通过抑制细胞周期素依赖激酶4/6(CDK4/6)阻止细胞由G1期进入S期，从而减少细胞的异常生长及变异，阻止肿瘤发生和发展。ANRIL为CDKN2B反义链转录本，可调控CDKN2B基因的表达。Wenqiang Yu等人研究显示ANRIL在白血病细胞系KG-1及Kasumi-1中表达显著上升，并且可调控CDKN2B的表达。此外，ANRIL还可以与PRC2复合体结合调控下游基因表达。P21基因是近年来发现的细胞周期蛋白依靠性激酶抑制剂家族中的重要成员，既与肿瘤抑制作用密切相关，又能通过抑制周期素依赖激酶(Cyclin-dependent kinasesCDKs)复合物活性，协调细胞周期、DNA复制与修复之间的关系，从而将肿瘤抑制作用与细胞周期控制过程紧密相连。KLF2为Krüppel样转录因子，受EZH2调控，EZH2为PRC2复合体核心成员，因此，ANRIL可以通过PRC2调控KLF2及P21基因的表达。在非小细胞肺癌中(ANRIL)还可以调节KLF2及P21的表达，影响细胞凋亡。以上研究均表明ANRIL在不同疾病中具有重要的调控功能，与ALL的发生发展可能存在联系。但是ANRIL在儿童急淋中的表达模式、是否可作为此病诊断、治疗及预后的分子标志物目前尚无相关的研究和报道。LncRNA是近年比较热门的一种RNA，ANRIL是其中一种。根据检索，目前国内研究ANRIL的研究很少，ANRIL在儿童白血病方面的研究未见。一方面是ANRIL比较新，另一方面大多数医疗机构无法获得足够数量的儿童ALL病例。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：ANRIL在儿童急淋中的表达模式、是否可作为此病诊断、治疗及预后的分子标志物目前尚无相关的研究和报道。
解决以上问题及缺陷的难度为：因为没有报道，所以没有参考资料，难度较大。
解决以上问题及缺陷的意义为：若能研究出ANRIL这一特异的lncRNA在儿童ALL中的表达模式，不仅有利于阐明其相关的调控机制，更有利于发现特异性高的诊断和治疗的分子标记物，对儿童ALL的早期诊断、指导治疗有重要的临床意义。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种LncRNA ANRIL在儿童急性淋巴细胞白血病中的临床应用。
本发明是这样实现的，一种调控基因的表达体，所述调控基因的表达体为LncRNAANRIL。ANRIL：F：5’-TGACGCGACATCTGGACACG-3’，R：5’-CCACAC CTTAACTACCACAAAG-3’。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述的调控基因的表达体的确定LncRNAANRIL在ALL细胞系中的表达模式的方法，所述确定LncRNA ANRIL在ALL细胞系中的表达模式的方法包括以下步骤：
步骤一，进行RNA提取及qRT-PCR；
步骤二，进行细胞培养；
步骤三，进行RNAi实验；
步骤四，进行细胞增殖及凋亡测定；
步骤五，进行统计学分析。
进一步，步骤一中，所述RNA提取及qRT-PCR，包括：
(1)使用Trizol试剂提取细胞中的总RNA，对提取的总RNA使用Nanodrop检测仪进行RNA浓度检测和纯度鉴定；
(2)利用反转录试剂盒反转总RNA成单链cDNA，利用PCR扩增仪进行cDNA扩增，根据GeneBank数据库中序列设计引物；
(3)使用SYBR Green染料法于StepOnePlusTMReal-Time PCR Systems定量PCR仪检测基因的表达，采用2-△△CT方法计算基因表达的相对比值，其中GAPDH为内参基因，每个样本至少重复3次。
进一步，所述引物ANRIL的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，引物KLF2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，引物p21的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，引物INK4B的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
进一步，步骤二中，所述细胞培养，包括：
在5％CO2的37℃的潮湿培养箱中，采用含有10％胎牛血清、1μg/mL嘌呤霉素的RPMI-1640培养基培养细胞，每隔2天更换培养液。
进一步，步骤三中，所述RNAi实验，包括：
(1)根据ANRIL的核苷酸序列设计靶向ANRIL的特异siRNA，包括Si-ANRIL-1和Si-ANRIL-2，同时设计一组scrambled nucleotide序列作为阴性对照，细胞系在相应培养基中培养；
(2)使用
Figure BDA0003153335920000051
将siRNA转染至细胞内；
(3)Amaxa Nucleofector细胞核转染系统综合应用电穿孔技术及细胞特异性细胞核转染液，直接把外源基因导入原代细胞及细胞系的细胞浆及细胞核中；
(4)转染完成后，细胞继续培养48h，测定转染效率后收集细胞用于后续qRT-PCR实验。
进一步，所述Si-ANRIL-1的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述Si-ANRIL-2的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
进一步，步骤四中，所述细胞增殖及凋亡测定，包括：
(1)采用CCK-8试剂盒检测细胞的增殖能力；
96孔板中接种2×103数量的NALM-6细胞，在转染siRNA后分别培养24h，48h，72h和96h后，每个孔再加入20μl的CCK-8试剂并在培养箱中37℃培养2h，使用酶标仪Envision于450nm波长下读取OD值，450nm波长，依据测得的吸光度值判断细胞增殖的能力，每个样本至少重复3次实验；
(2)转染48h后，取对数生长期细胞，PBS清洗后使用Annexin V-FITC ApoptosisDetection Kit试剂盒来检测细胞凋亡情况；试剂盒和碘化丙啶染色的处理均按指导文件在黑暗低温条件下进行，处理完立即上机到流式细胞仪检测；
(3)检测结果使用Cell Quest software分析，每个样本至少重复3次实验；进行细胞周期分析前，细胞使用70％的乙醇-20℃过夜处理，然后使用PI和核糖体酶A在室温下处理30min，随后上机分析。
进一步，步骤五中，所述统计学分析，包括：
疾病组及健康对照组间ARNIL表达水平差异显著性分析采用t检验，p值进行Benjamini&Hochberg校正；采用卡方检验χ2比较两组样本临床指标的差异显著性；ANRIL表达与结直肠癌患者临床病理资料之间的差异检验，两组比较采用两独立样本秩和检验；采用R程序计算出灵敏度和特异性；ROC曲线采用R包进行绘制。
本发明的另一目的在于提供一种所述的调控基因的表达体LncRNAARNIL在儿童急性淋巴细胞白血病All调控中的应用。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的LncRNA ANRIL在儿童急性淋巴细胞白血病中的临床应用，采用qPCR分析ANRIL在儿童ALL中的表达模式及其在该病的临床诊断、分型、治疗等方面潜在的应用价值，并进一步进行体外实验验证其异常表达对白血病细胞增殖及凋亡的影响，为阐明ANRIL的调控机制及临床转化和应用提供指导。本发明在之前的研究基础上，进一步研究ANRIL在儿童ALL中的表达模式，寻找其在该疾病的临床诊断、治疗等方面潜在的应用价值，并进一步进行体外实验验证其重要的调控功能和生物学机制，为ANRIL的临床转化和应用提供指导。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的确定LncRNA ANRIL在ALL细胞系中的表达模式的方法流程图。
图2是本发明实施例提供的技术路线图。
图3是本发明实施例提供的ALL细胞系中ANRIL表达模式分析示意图。
图4是本发明实施例提供的ALL样本中ANRIL表达模式及其临床潜在应用价值研究示意图。
图5是本发明实施例提供的ANRIL潜在的调控机制及其对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响及相关机制研究示意图。
图6是本发明实施例提供的ANRIL基因在CLL中高表达示意图。
图7和图8是本发明实施例提供的选择109例儿童急性淋巴细胞白血病和121例体检正常儿童的外周血单个核细胞(PBMC)的示意图。
图9是本发明实施例提供的人ALL及其他白血病细胞中ANRIL的表达示意图。
图10和图11是本发明实施例提供的选择儿童ALL细胞系CEM-CM3及MOLT-3作为细胞模型研究的示意图。
图12是本发明实施例提供的通过CCK8实验检测不同表达水平的ANRIL对于细胞增殖水平的影响示意图。
图13是本发明实施例提供的三种基因型的两株ALL细胞的细胞周期分析结果示意图。
图14是本发明实施例提供的利用2mM过氧化氢诱导细胞凋亡的结果示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种LncRNA ANRIL在儿童急性淋巴细胞白血病中的临床应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的调控基因的表达体为LncRNA ANRIL。
如图1所示，本发明实施例提供的确定LncRNA ANRIL在ALL细胞系中的表达模式的方法包括以下步骤：
S101，进行RNA提取及qRT-PCR；
S102，进行细胞培养；
S103，进行RNAi实验；
S104，进行细胞增殖及凋亡测定；
S105，进行统计学分析。
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
实施例1
1、儿童的急性淋巴细胞白血病(ALL)是儿童时期最常见的恶性肿瘤，难治和复发的ALL是儿童肿瘤死亡的首要因素，也是目前临床治疗的一个挑战。进一步探究儿童ALL发生发展过程的分子机制、免疫分型、寻找新的治疗策略及预后标志物具有重要的临床意义。LncRNA不仅与细胞生长、发育、代谢及凋亡等正常生理过程相关，还可作为肿瘤诊断、分型、预后的标志物以及治疗靶标。LncRNA ANRIL与多种癌症相关，但在儿童ALL中研究较少。本发明采用qPCR分析ANRIL在儿童ALL中的表达模式及其在该病的临床诊断、分型、治疗等方面潜在的应用价值，并进一步进行体外实验验证其异常表达对白血病细胞增殖及凋亡的影响，为阐明ANRIL的调控机制及临床转化和应用提供指导。
2、目标、内容、采取的方案及可行性分析
2.1目标
(1)明确ANRIL在儿童ALL样本中的表达模式；
(2)分析ANRIL表达水平与儿童ALL的初诊白细胞数、免疫分型、治疗反应、预后等相关临床因素的相关性；
(3)体外实验研究ANRIL表达对白血病细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响及其可能的调控机制；
(4)明确ANRIL表达作为儿童ALL诊断、免疫分型及治疗预后标志物的潜在价值
2.2内容
(1)ANRIL在ALL细胞系中表达模式研究
采用qRT-PCR分析ANRIL在白血病细胞系MOLT-4(急性T淋巴细胞性白血病细胞株)、Reh(急性非B非T淋巴细胞白血病细胞株)及NALM-6(急性B淋巴细胞白血病细胞株)中的表达水平，对照组为正常淋巴细胞，分析差异显著性。
(2)ANRIL在ALL病例样本中的表达模式
收集我院ALL病人血液样本以及对应的临床相关信息，包括初诊时白细胞数、免疫分型、治疗反应、预后等信息。所有入组病人均签署知情同意书。疾病分型至少通过两位检验师检验。分离血液中白细胞，采用液氮冻存后置于-190℃保存备用。疾病组120例样本，对照组为普通外科择期手术患者，共收集40例样本，其年龄、性别与疾病组无明显差异。采用qRT-PCR分析ANRIL在疾病组和对照组中的表达水平，分析其差异显著性。疾病组入选标准：严格按照中华医学会儿科学分会血液学组2014年制定的《儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议(第四次修订)》版之诊断标准筛选入组病人。对照组入选标准：随机选择我院普外科择期手术的疝气病人，患者近期无感染性疾病，未服用抗生素，没有进行免疫治疗，各项检查指标正常。
(3)ANRIL异常表达对白血病细胞系增殖、凋亡的影响及调控机制研究
设计特定的siRNA在NALM-6细胞系中沉默ANRIL的表达，进一步分别采用CCK-8实验以及流式细胞实验，研究ANRIL沉默后，对癌细胞增殖、迁移以及凋亡的影响。采用qPCR技术分析抑癌基因INK4B、KLF2和P21基因的表达，分析ANRIL沉默对上述基因的影响，阐明其可能的调控机制。
(4)ANRIL表达与ALL临床指标相关性基于收集的有入选病例相关信息如：性别、年龄、白细胞数、免疫分型、以及治疗反应、预后等相关临床指标及信息。统计分析ANRIL表达与以上述相关临床因素是否存在显著相关性。
(5)ANRIL作为ALL诊断、分型及预后标志物价值研究
分别统计分析采用ANRIL表达水平区分ALL与健康对照、ALL不同分型以及预后效果的灵敏度及特异性，绘制ROC曲线，评估其临床价值。
2.3问题
(1)ANRIL在ALL细胞系及病例样本中的表达模式是本发明拟研究的科学问题之一。通过qPCR研究ANRIL在ALL细胞系及病例样本中的表达水平及其与对照组的差异。
(2)通过RNAi研究ANRIL对白血病癌细胞系增殖、凋亡的影响，这是本发明拟解决的关键科学问题之二。在NALM-6细胞系中，沉默ANRIL表达，通过CCK8及流式细胞仪测定癌细胞系增殖及凋亡的变化，研究其作为潜在的治疗靶标的价值。
(3)ANRIL作为ALL诊断、分型及预后标志物的潜在价值，是本发明拟解决的关键科学问题之三。本发明将评估ANRIL表达水平区分ALL与健康对照、ALL不同亚型以及预后效果的准确性及特异性。
2.4方法
(1)RNA提取及qRT-PCR
使用Trizol试剂提取细胞中的总RNA，对提取的总RNA使用Nanodrop检测仪(Thermo Scientific，USA)进行RNA浓度检测和纯度鉴定。用反转录试剂盒(AppliedBiosystems，Foster City，CA，USA)并按其提供的方法反转总RNA成单链cDNA，PCR扩增仪进行cDNA扩增。根据GeneBank数据库中序列设计引物，引物如下，
ANRIL：F：5’-TGACGCGACATCTGGACACG-3’，R：5’-CCACACCTTAACTACCACAAAG-3’，
KLF2：F：5’-CTGCACATGAAACGGCACAT-3’，R：5’-CAGTCACAGTTTGGGAGGGG-3’；
p21：F：5’-GGTGTCTAGGTGCTCCAGGT-3’，R:5’-GCACTCTCCAGGAGGACACA-3’，
INK4B：F：5’-GGGAGGGTAATGAAGCTGAG-3’，R:5’-GGCCGTAAACTTAACGACACT-3’，使用SYBR Green染料法于StepOnePlusTMReal-Time PCR Systems(Applied Bio-systems，Foster City，CA，USA)定量PCR仪检测基因的表达，采用2-△△CT方法计算基因表达的相对比值，其中GAPDH为内参基因，每个样本至少重复3次。
(2)细胞培养
白血病细胞系MOLT-4、Reh及NALM-6均购自中国科学院上海生命科学研究所。在5％CO2的37℃的潮湿培养箱中，采用含有10％胎牛血清、1μg/mL嘌呤霉素的RPMI-1640培养基培养细胞，每隔2天更换培养液。
(3)RNAi实验
根据ANRIL的核苷酸序列设计靶向ANRIL的特异siRNA(Si-ANRIL-1:5’-UGUCCUGUGUUAGGUCUAU-3’；Si-ANRIL-2:5’-UCUUAAACUCUCAUAUGAAUG-3’)，同时设计一组scrambled nucleotide序列作为阴性对照。细胞系在相应培养基中培养。参照Ouimet M描述的方法,使用
Figure BDA0003153335920000111
(Lonza)将siRNA转染至细胞内。AmaxaNucleofector细胞核转染系统综合应用电穿孔技术及细胞特异性细胞核转染液，直接把外源基因导入原代细胞及细胞系的细胞浆及细胞核中。转染完成后细胞继续培养48h，测定转染效率后收集细胞用于后续qRT-PCR实验。
(4)细胞增殖及凋亡测定
采用CCK-8试剂盒检测细胞的增殖能力。96孔板中接种2×103数量的NALM-6细胞，在转染siRNA后分别培养24h，48h，72h和96h后，每个孔再加入20μl的CCK-8试剂并在培养箱中37℃培养2h，使用酶标仪Envision(PerkinElmer)于450nm波长下读取OD值(450nm波长)，依据测得的吸光度值判断细胞增殖的能力。每个样本至少重复3次实验。
转染48h后，取对数生长期细胞，PBS清洗后使用Annexin V-FITC ApoptosisDetection Kit(BD，USA)试剂盒来检测细胞凋亡情况。试剂盒和碘化丙啶(PI，50ug/ul，Sigma)染色的处理均按指导文件在黑暗低温条件下进行，处理完立即上机到流式细胞仪(FACSCalibur，BD Biosciences)检测。检测结果使用Cell Quest software分析，每个样本至少重复3次实验。进行细胞周期分析前，细胞使用70％的乙醇-20℃过夜处理，然后使用PI和核糖体酶A(Takara biotechnology，Dalian，China)在室温下处理30min，随后上机分析。
(5)统计学分析
疾病组及健康对照组间ARNIL表达水平差异显著性分析采用t检验，p值进行Benjamini&Hochberg(BH)校正。采用卡方检验(χ2)比较两组样本临床指标的差异显著性。ANRIL表达与结直肠癌患者临床病理资料之间的差异检验，两组比较采用两独立样本秩和检验。采用R程序计算出灵敏度和特异性。ROC曲线采用R包进行绘制。
2.5技术路线
本发明的技术路线见图2。
2.6实验方案
研究显示ANRIL与多种在多种肿瘤中表达上调，与肿瘤细胞增殖、分化、转移等过程相关，且可作为临床诊断及预后潜在的靶标，并且本发明前期的数据分析显示在CLL样本中表达上调，表明其可能与白血病发生相关，但是在ALL中其表达模式及调控机制尚无相关报道，因此，拟对ANRIL在ALL中的表达及调控进行研究。
(1)ALL细胞系中ANRIL表达模式分析
如图3所示，采用qPCR技术分析lncRNA ANRIL在MOLT-4、Reh及NALM-6三种细胞系中的表达情况，并与正常淋巴细胞比较，分析其差异表达情况。
(2)ALL样本中ANRIL表达模式及其临床潜在应用价值研究
进一步收集ALL病例样本，qPCR分析ANRIL在疾病样本中的表达模式，基于定量结果分析病例组与健康对照组的差异，有无统计学意义。进一步分析ANRIL表达与疾病组临床指标的相关性，研究其作为诊断、分型、预后标志物的临床价值(见图4)。
(3)ANRIL潜在的调控机制及其对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响及相关机制研究
文献调研及前期转录组测序数据分析均显示ANRIL在肿瘤包括白血病中表达上调，行使原癌基因功能。因此，在NALM-6细胞系中采用RNAi技术沉默ANRIL的表达来研究其调控机制。qPCR分析ANRIL沉默后，INK4B、KLF2和P21基因的表达情况，研究ANRIL的调控机制。同时采用CCK-8及流式细胞技术分析ANRIL沉默后白血病细胞的增殖及凋亡变化情况，分析其是否可作为潜在的治疗靶标(见图5)。
2.7可行性分析
(1)LncRNA在白血病等多种癌症的发生、转移等过程中起着关键调控作用，但是关于ANRIL在ALL中的调控作用、具体分子机制目前尚不清楚，本课题拟通过体外实验研究ANRIL在儿童ALL中的调控作用及其在临床诊断、分型及预后的潜在应用价值。选题新颖，有临床意义。
(2)本发明前期查阅了大量的LncRNA文献且对ANRIL有较深的认识，为本课题的实施奠定了良好的基础。此外，结合近期国内外大量文献，使本发明具有充分的立项依据，确保了研究目标切实可行。
2.8本发明的创新之处
LncRNAs在肿瘤中的调控机制，是当前基因调控方面的研究热点。通过对lncRNAs在ALL中调控机制的深入研究，有望使其成为ALL新的诊断、分型及预后的标志物，甚至成为潜在的新治疗靶点。本课题立足于这一国际前沿，具有以下特色和创新之处：
1)本发明在前期研究的基础上，首次研究ANRIL在儿童ALL病例样本及细胞系中的表达模式，并进一步通过体外实验研究ANRIL表达与肿瘤细胞的增殖及凋亡的影响，具有新颖性。
2)本发明首次研究ANRIL表达水平与ALL临床指标的相关性及其作为ALL断、分型以及预后标志物的潜在价值。为阐明ANRIL在ALL中的调控机制以及临床应用提供理论依据，具有重要的临床价值。
2.9现有研究基础与工作条件
本发明＝围绕ANRIL在白血病中的表达进行了大量前期研究，不仅积累了lncRNA研究的相关经验，同时也拓展了研究思路，为后续的研究打下坚实的基础。本发明下载了GEO数据库白血病相关RNA-Seq测序数据(GSE66167)进行差异lncRNA鉴定及筛选。数据共包括47个慢性淋巴细胞白血病样本，3个正常CD19+B细胞；通过比对定量及差异分析发现，ANRIL在癌症样本中显著高表达(padj<0.01)，在正常样本中低表达或不表达。表明ANRIL在CLL中可能有重要的调控功能，其异常表达可能与CLL的发病相关(见图6)。
实施例2
本发明选择了109例儿童急性淋巴细胞白血病和121例体检正常儿童的外周血单个核细胞(PBMC)，通过RNA提取，逆转录，Real-time PCR的手段对于PBMC中的ANSIL，p21以及KLF2的转录进行了比较。结果表明ANSIL在儿童ALL中呈显著高表达(P<0.05)，p21及KLF2呈显著低表达(P<0.05)。进一步将ALL中ANSIL的表达与p21以及KLF2的表达进行线性相关性分析，结果表明ANSIL的表达与p21以及KLF2呈良好的线性相关(见图7和图8)。
同时，本发明还研究了人ALL及其他白血病细胞中ANRIL的表达，本发明选取了儿童ALL细胞系CEM-CM3，MOLT-3，TAL-104及8E5，成人T细胞白血病细胞系Jurkat及HL-60单核细胞白血病细胞系AML-193及THP1以及成人髓系白血病细胞系NCI-BL1395及NCI-BL1437；结果表明，ANRIL在儿童ALL中表达最高，同时在成人ALL中亦高表达，但在其他类型的白血病细胞中表达较ALL显著下降(见图9)。
本发明选择了儿童ALL细胞系CEM-CM3及MOLT-3作为细胞模型继续研究，首先，本发明利用ANRIL的特异性shRNA将两个细胞细胞系中的ANRIL表达敲低，同时利用外源性质粒在这两种细胞中高表达ANRIL，通过Real-time PCR检测，本发明发现ANRIL的特异性shRNA能够有效地降低ANRIL的表达，同时外源性质粒也能够有效地在两株细胞中高表达ANRIL。基于此实验，本发明分别检测了p21及KLF2基因及蛋白的表达，结果表明当ANRIL表达下调时p21及KLF2的基因及蛋白表达水平均显著上调，而当ANRIL在这两株ALL细胞中进一步高表达是p21及KLF2的基因及蛋白表达水平进一步下降(见图10和图11)。
通过CCK8实验检测不同表达水平的ANRIL对于细胞增殖水平的影响，本发明发现，高表达ANRIL时细胞的增值水平显著增加，而当该基因表达下调时，细胞增殖受到显著的影响(见图12)。
本发明对于这三种基因型的两株ALL细胞进行了细胞周期的分析，本发明发现当ANRIL表达被敲减后两株ALL细胞的G2/M期的比例显著上调，当ANRIL进一步高表达后G2/M期的比例显著下降，在CEM-CM3细胞中ANRIL的表达对S期细胞没有显著影响，而在MOLT-3细胞中当ANRIL敲减后s期细胞显著降低，而ANRIL高表达后对于S细胞的比例没有显著影响(见图13)。
利用2mM过氧化氢诱导细胞凋亡，当ANRIL被敲减后，两株细胞凋亡比例显著上调。而外源性表达的ANRIL对于细胞的抗调控水平没有显著的影响(见图14)。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京市儿童医院
<120> LncRNA ANRIL在儿童急性淋巴细胞白血病中的临床应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgacgcgaca tctggacacg ccacacctta actaccacaa ag 42
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgcacatga aacggcacat cagtcacagt ttgggagggg 40
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtgtctagg tgctccaggt gcactctcca ggaggacaca 40
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gggagggtaa tgaagctgag ggccgtaaac ttaacgacac t 41
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
uguccugugu uaggucuau 19
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ucuuaaacuc ucauaugaau g 21

Claims (10)

1.一种调控基因的表达体，其特征在于，所述调控基因的表达体为LncRNA ANRIL。
2.一种由权利要求1所述的调控基因的表达体的确定LncRNA ANRIL在ALL细胞系中的表达模式的方法，其特征在于，所述确定LncRNA ANRIL在ALL细胞系中的表达模式的方法包括以下步骤：
步骤一，进行RNA提取及qRT-PCR；
步骤二，进行细胞培养；
步骤三，进行RNAi实验；
步骤四，进行细胞增殖及凋亡测定；
步骤五，进行统计学分析。
3.如权利要求2所述的确定LncRNA ANRIL在ALL细胞系中的表达模式的方法，其特征在于，步骤一中，所述RNA提取及qRT-PCR，包括：
(1)使用Trizol试剂提取细胞中的总RNA，对提取的总RNA使用Nanodrop检测仪进行RNA浓度检测和纯度鉴定；
(2)利用反转录试剂盒反转总RNA成单链cDNA，利用PCR扩增仪进行cDNA扩增，根据GeneBank数据库中序列设计引物；
(3)使用SYBR Green染料法于StepOnePlusTMReal-Time PCR Systems定量PCR仪检测基因的表达，采用
Figure FDA0003153335910000011
方法计算基因表达的相对比值，其中GAPDH为内参基因，每个样本至少重复3次。
4.如权利要求3所述的确定LncRNA ANRIL在ALL细胞系中的表达模式的方法，其特征在于，所述引物ANRIL的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，引物KLF2的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示，引物p21的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，引物INK4B的核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示。
5.如权利要求2所述的确定LncRNA ANRIL在ALL细胞系中的表达模式的方法，其特征在于，步骤二中，所述细胞培养，包括：
在5％CO2的37℃的潮湿培养箱中，采用含有10％胎牛血清、1μg/mL嘌呤霉素的RPMI-1640培养基培养细胞，每隔2天更换培养液。
6.如权利要求2所述的确定LncRNA ANRIL在ALL细胞系中的表达模式的方法，其特征在于，步骤三中，所述RNAi实验，包括：
(1)根据ANRIL的核苷酸序列设计靶向ANRIL的特异siRNA，包括Si-ANRIL-1和Si-ANRIL-2，同时设计一组scrambled nucleotide序列作为阴性对照，细胞系在相应培养基中培养；
(2)使用
Figure FDA0003153335910000021
将siRNA转染至细胞内；
(3)Amaxa Nucleofector细胞核转染系统综合应用电穿孔技术及细胞特异性细胞核转染液，直接把外源基因导入原代细胞及细胞系的细胞浆及细胞核中；
(4)转染完成后，细胞继续培养48h，测定转染效率后收集细胞用于后续qRT-PCR实验。
7.如权利要求6所述的确定LncRNA ANRIL在ALL细胞系中的表达模式的方法，其特征在于，所述Si-ANRIL-1的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述Si-ANRIL-2的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
8.如权利要求2所述的确定LncRNA ANRIL在ALL细胞系中的表达模式的方法，其特征在于，步骤四中，所述细胞增殖及凋亡测定，包括：
(1)采用CCK-8试剂盒检测细胞的增殖能力；
96孔板中接种2×103数量的NALM-6细胞，在转染siRNA后分别培养24h，48h，72h和96h后，每个孔再加入20μl的CCK-8试剂并在培养箱中37℃培养2h，使用酶标仪Envision于450nm波长下读取OD值，450nm波长，依据测得的吸光度值判断细胞增殖的能力，每个样本至少重复3次实验；
(2)转染48h后，取对数生长期细胞，PBS清洗后使用Annexin V-FITC ApoptosisDetection Kit试剂盒来检测细胞凋亡情况；试剂盒和碘化丙啶染色的处理均按指导文件在黑暗低温条件下进行，处理完立即上机到流式细胞仪检测；
(3)检测结果使用Cell Quest software分析，每个样本至少重复3次实验；进行细胞周期分析前，细胞使用70％的乙醇-20℃过夜处理，然后使用PI和核糖体酶A在室温下处理30min，随后上机分析。
9.如权利要求2所述的确定LncRNA ANRIL在ALL细胞系中的表达模式的方法，其特征在于，步骤五中，所述统计学分析，包括：
疾病组及健康对照组间ARNIL表达水平差异显著性分析采用t检验，p值进行Benjamini&Hochberg校正；采用卡方检验χ2比较两组样本临床指标的差异显著性；ANRIL表达与结直肠癌患者临床病理资料之间的差异检验，两组比较采用两独立样本秩和检验；采用R程序计算出灵敏度和特异性；ROC曲线采用R包进行绘制。
10.一种如权利要求1所述的调控基因的表达体LncRNA ARNIL在儿童急性淋巴细胞白血病All调控中的应用。
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