CN107142310B - 一种靶向Ang-2基因抑制肺癌细胞的特异性shRNA的筛选方法 - Google Patents

一种靶向Ang-2基因抑制肺癌细胞的特异性shRNA的筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了特异性shRNA筛选及其靶向Ang‑2基因抑制肺癌细胞的验证方法，经细胞复苏、细胞培养、细胞转染、干扰前后实时荧光定量PCR检测Ang‑2表达、干扰前后细胞中蛋白表达分析、CCK‑8方法检测干扰Ang‑2基因前后的肺癌细胞增殖能力及干扰前后细胞侵袭、迁移能力改变的检测的步骤完成对特异性shRNA的筛选及其靶向Ang‑2基因抑制肺癌细胞的验证；本发明实现筛选对Ang‑2基因转录干扰具有特异性Ang‑2‑shRNA1有效质粒转染肺癌细胞，同时能够验证了特异性shRNA靶向干扰Ang‑2能够有效抑制癌细胞的增殖、侵袭、迁移等生物学能力，为治疗肺癌提供一种新的治疗方向，抑制Ang‑2弥补抗VEGFR单一疗法的局限性。

Description

一种靶向Ang-2基因抑制肺癌细胞的特异性shRNA的筛选方法
技术领域
本发明属于医学领域，具体涉及一种靶向Ang-2基因抑制肺癌细胞的特异性shRNA的筛选方法。
背景技术
肺癌在当今世界仍然是一种最常见的人类恶性肿瘤以及癌症相关死亡的主要原因，肺癌5年生存率低，术后复发率高，预后差，即使手术后的I期肺癌患者10年生存率可达90%。治疗方法以手术为主，放疗化疗为辅的综合治疗，但由于转移和耐药等原因，使多种化疗药物疗效降低甚至无效。虽然已有多种靶向药物能延长肺癌患者的生存时间，但仍然不能降低肺癌死亡率，仍需探索新的分子标记和分子靶点作为肺癌新的治疗策略。肺癌的发生发展是一个多阶段的复杂病理过程，涉及基因突变、表观遗传学改变及多种信号通路调节异常。对于肿瘤生物学的理解只强化了血管生成在肿瘤发展中的作用，它提供正常生理需求的氧气和营养物质。肿瘤微环境中，肿瘤动态平衡利于促成持续促血管生成状态；没有足够的血管支持，肿瘤的大小将被限制在直径几毫米。
随着肿瘤体积增大，耗氧量增加，使组织缺氧诱导因子-1α (HIF-1α)过表达，诱导血管生成相关蛋白血管内皮生长因子(VEGF)与血管生成素-2(Angiopoietin, Ang-2)过表达从而影响放化疗，并促使癌细胞更具侵袭性。肺癌组织和细胞中Ang-2表达的生物学特征值得探讨，有可能是影响肺癌患者预后的重要因素。而肿瘤新生血管是为肿瘤细胞输送氧及营养物质的通道，也是实现肿瘤转移的重要通道之一。Ang-2通过竞争性的抑制Ang-1的生物功能，降低了血管的稳定性，继而导致血管的高度不稳定性、不成熟性，在肿瘤的血管生成中起着至关重要的作用。Ang-2介导血管生成和肿瘤进展的详细机制仍有争议。
RNA干扰（RNA interference, RNAi）是目前日趋发展和逐渐成熟的一门新兴的基因沉默技术。Ang-2是调节肿瘤血管生成的关键因子，有研究表明，Ang-2高表达可导致血管内皮细胞和周细胞之间的干扰被持续中断。此外，内皮细胞中高浓度Ang-2通过激活磷脂酰肌醇3′激酶/ Akt信号通路阻断细胞凋亡。在肿瘤转移(如口腔鳞癌)的初始步骤是通过EMT诱导的血管生成，这可通过血管生成的关键因子Ang-2介导。因此可以推测Ang-2过表达与目前肺癌的血管生成侵袭、迁移及转移密切相关，干扰Ang-2表达可能成为肺癌治疗的突破点，因此Ang-2作为预后相关的新靶点，具有开发与应用前景。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，现提供一种具有开发与应用前景的一种靶向Ang-2基因抑制肺癌细胞的特异性shRNA的筛选方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种靶向Ang-2基因抑制肺癌细胞的特异性shRNA的筛选方法，其创新点在于：经细胞复苏、细胞培养、细胞转染、干扰前后实时荧光定量PCR检测Ang-2表达、干扰前后细胞中蛋白表达分析、CCK-8方法检测干扰Ang-2基因前后的肺癌细胞增殖能力及干扰前后细胞侵袭、迁移能力改变的检测的步骤完成对特异性shRNA的筛选及其靶向Ang-2基因抑制肺癌细胞的验证；
所述干扰前后实时荧光定量PCR检测Ang-2表达的具体步骤包括Total RNA提取、逆转录cDNA和荧光定量RT-PCR。
进一步的，所述细胞复苏的具体步骤为：
从-80℃冰箱将细胞Beas-2B、SPCA-1、NCI-H1650、A549和NCI-H1975的冻存管取出，立即放入37℃恒温水浴锅中快速震荡解冻；
完全解冻情况下，用75%酒精消毒擦拭冻存管后置于超净台；
将细胞转移至10ml RPMI-1640完全培养基中混匀后在1000 rpm环境下离心5min；
弃上清液后加3mL RPMI-1640完全培养液轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移至培养瓶，置37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养，次日观察细胞生长情况，酌情换液继续培养。
进一步的，所述细胞培养的具体步骤为：
细胞密度 >80% 时对细胞进行消化和传代，弃去旧培养液后，使用PBS洗涤两次，加入2ml含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液；
将培养瓶置于显微镜下观察细胞形态变化，当细胞形态变圆、胞质回缩及细胞间隙增大时，吸弃胰蛋白酶消化液，加入6-8ml RPMI-1640完全培养基吹打重悬细胞得到细胞悬液；
将细胞悬液按1:2或1:3分装于两个新的培养瓶中，再加入RPMI-1640完全培养基使培养瓶中总量达3ml，将培养瓶置于培养箱中继续培养。
进一步的，所述细胞转染的具体步骤为：
将A549细胞接种于六孔板中，加入2ml RPMI-1640无抗培养基，接种数量为5×105-8×105；
当细胞密度长至全孔60%后，在两份170μl RPMI-1640基础培养基中分别加入2.5μg shRNA和NC-shRNA，柔和混匀，得到shRNA稀释液和NC-shRNA稀释液；
用50μl RPMI-1640基础培养基稀释6μl Engreen转染试剂，轻轻吹打3-5次，室温静置5min，得到转染试剂稀释液；
混匀shRNA稀释液和转染试剂稀释液得到shRNA混合液，室温静置15-20min；
分别在shRNA混合液和NC-shRNA稀释液中转入A549细胞形成shRNA实验组和阴性对照组，并设置空白对照组，24h后荧光显微镜观察转染效率。
进一步的，所述干扰前后实时荧光定量PCR检测Ang-2表达的Total RNA提取具体步骤：
收集细胞至1.5ml RNA-free离心管中，离心管加入1ml Trizol总RNA提取液并充分混匀，室温静置5min；
在静置后的离心管分别加入0.2ml三氯甲烷后剧烈震荡15s，室温静置2min；
在4℃，12000r/min的环境下离心15min，吸取上清至新1.5ml离心管中；加入与上清液等量的异丙醇轻轻混匀，室温静置10min；
在4℃，12000r/min的环境下离心10min后弃上清，加入1ml预冷的75%乙醇，所述75%乙醇由DEPC水配置，轻轻洗涤沉淀，在4℃，7500r/min的环境下离心5min，弃上清并晾干；
加入20ul DEPC水，所述DEPC水为在65℃环境下促溶10-15min所得；使用紫外分光光度仪测定提取RNA的浓度和纯度，DEPC水调零。
进一步的，所述干扰前后实时荧光定量PCR检测Ang-2表达的逆转录cDNA的具体步骤包括：
取oligo dT 18 primer 1μl，5xReaction Buffer 4μl，RibolockTMRibonucleaseinhibitor 1μl，10mM dNTP Mix 2μl，Total RNA 5μl，RevertAidTM ReverseTranscriptase 1μl，加入RNase Free dH2O 至总体积为20μl，混匀后离心，42℃环境下孵育1h，在70℃ 环境下保持5min后终止反应，转录为cDNA溶液，-20℃保存备用。
进一步的，所述干扰前后实时荧光定量PCR检测Ang-2表达中荧光定量RT-PCR的具体步骤为：取SYBR Green/ROX Master Mix 12.5μl，Forward primer 0.3μM，Reverseprimer 0.3μM，Water 10.5μl，cDNA 溶液 1μl，总体积为 25μl，经Applied Biosystems7500Real Time PCR System仪反应；经过95℃ 10min预变性后进入PCR循环，95℃ 15s变性，60℃ 1min退火延伸，反应40个循环。
进一步的，所述干扰前后细胞中蛋白表达分析的具体步骤为：
a.蛋白抽提和浓度测定：PBS冲洗贴壁细胞两遍后，加适量含1%的PMSF及磷酸酶抑制剂的裂解液，冰上裂解15min，用刮板收集细胞，在4℃ 12000r/min环境下离心20min，以BCA法测定浓度，稀释到最佳上样量；按SDS-PAGE蛋白上样缓冲液体积：蛋白体积=1：4的比例加入蛋白上样缓冲液，并于100℃煮5min，使蛋白变性；所收集到的变性蛋白立即使用或-80℃保存待用；
b.Western blotting免疫印迹试验：
制备10%SDS聚丙烯酰胺凝胶分离胶和5%浓缩胶，所述分离胶的配方为：ddH2O 1.3mL，1mol/L PH8.8 Tris-HCl 1.9 mL，30% Arc- Bis 1.7 mL，10% SDS 50 μl，TEMED 2 μl及10%过硫酸铵 50 μl；所述浓缩胶的配方为：ddH2O 1.4 mL，1 mol/L pH 6.8 Tris-HCl0.25 mL，30% Arc-Bis 0.33 mL，10% SDS 20 μl，TEMED 2 μl及10%过硫酸铵AP 20 μl；
向电泳槽内加入足量电泳缓冲液，所述电泳缓冲液的配方为：SDS 1g，Tris 3.02g，甘氨酸 14.4 g，ddH2O 1 000 mL；
调节所收集的变性蛋白浓度和每个孔上样体积，使每孔上样总量达200μg进行电泳；电泳恒压80 V×40 min，后100 V×1h；
电泳结束后将切好的SDS聚丙烯酰胺凝胶分离胶放入转膜槽内，加入800ml转膜缓冲液进行转膜，恒流300 mA×2h；所述转膜缓冲液的配方为Tris 3.02 g，甘氨酸 14.4 g，ddH2O 600 mL，100%甲醇200 mL；
待蛋白转移至PVDF膜后拿出，使用TBST缓冲液漂洗5 min，共漂洗4次，所述TBST缓冲液的配方为：NaCl 8.0 g，Tris 2.42 g，Tween-20 0.5 mL，ddH2O 1000 mL；室温下，封闭液脱色摇床封闭1 h；
TBST缓冲液漂洗5 min，共漂洗3次，加入1：1000的兔抗人Ang-2 、1：200倍的鼠抗人E-cadherin、1：2000倍的鼠抗人VIM、1：500倍的鼠抗人Snail、1：200倍的鼠抗人Twist 及1：2000倍的鼠抗人β-actin抗体作为内参，4℃环境下过夜，TBST缓冲液漂洗5 min，共漂洗4次，TBST 缓冲液按1:1000稀释辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗兔或羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育60min，洗涤后ECL显色并拍照。
进一步的，所述CCK-8方法检测干扰Ang-2基因前后的肺癌细胞增殖能力的具体步骤：
设置实验组：shRNA实验组，阴性对照组和空白对照组，在96孔板中接种对数生长期A549细胞，每孔约2000个，每孔100µl；
24小时后进行细胞转染，以CCK8实验，分别检测转染后0h、24h、48h、72h细胞增殖情况，每个时段设置3个复孔；
每孔加入10µl CCK8溶液继续培养120min，用多功能酶标仪在450nm波长测量各孔的吸光度A450值，取其均值。
进一步的，所述干扰前后细胞侵袭、迁移能力改变的检测的具体步骤：
将RPMI-1640无血清培养基与Matrigel基质胶按照4:1比例对Matrigel基质胶进行稀释形成基质胶稀释液；
取shRNA转染后的shRNA实验组、阴性对照组及空白对照组的细胞，用胰酶消化后离心，使用RPMI-1640基础培养基重悬并进行细胞计数，调整细胞密度为1 x 105/mL；
将调整细胞密度后的shRNA实验组，阴性对照组和空白对照组的细胞接种于3个Transwell小室，每个Transwell小室分别加50µl基质胶稀释液，在37℃环境下孵育2h，待胶凝固作为侵袭组；
将调整细胞密度后的shRNA实验组，阴性对照组和空白对照组的细胞接种于3个Transwell小室，作为迁移组；
每个小室加入200µl细胞悬液，24孔板加入600µl RPMI-1640完全培养基，将Transwell小室放入24孔板并在37℃、5%CO2 培养箱中孵育，迁移组12h，侵袭组24h；
取出培养箱中的Transwell小室，使用PBS清洗2遍，用棉签轻轻拭去小室内侧细胞，PBS再洗2遍；
将小室滤膜用4%多聚甲醛固定20min，弃固定液，每孔加入600µl结晶紫染液染色15min，PBS清洗3遍后将小室取出，自然干燥；
正置于载玻片，放于荧光显微镜下拍照，并计数每个小室外侧的中央部分及其周围随机3个视野。
本发明的有益效果如下：本发明实现筛选对Ang-2基因转录干扰具有特异性Ang-2-shRNA1有效质粒转染肺癌细胞，同时能够验证了特异性shRNA靶向干扰Ang-2能够有效抑制癌细胞的增殖、侵袭、迁移等生物学能力，为治疗肺癌提供一种新的治疗方向，抑制Ang-2弥补抗VEGFR单一疗法的局限性。
附图说明
图1A-图1E分别为SPCA-1、NCI-H1650、A549、NCI-H1975、Beas-2B中Ang-2表达的镜下观察图；
图2为Beas-2B、SPCA-1、NCI-H1650、A549、NCI-H1975中Ang-2蛋白表达的Westernblotting 分析图谱；
图3为Beas-2B、SPCA-1、NCI-H1650、A549、NCI-H1975细胞中Ang-2蛋白与β-actin的相对比率(n=3)；
图4为Beas-2B、SPCA-1、NCI-H1650、A549、NCI-H1975细胞株中Ang-2 mRNA表达水平(n=3)；
图5A-图5B分别为shRNA成功转染A549细胞转染平衡光图和shRNA成功转染A549细胞转染荧光图；
图6为shRNA实验组、阴性对照组和空白对照组时A549细胞中Ang-2蛋白表达的Western Blotting分析图谱；
图7为shRNA实验组、阴性对照组和空白对照组时A549细胞中Ang-2蛋白与β-actin的相对比率(n=3)；
图8为shRNA实验组、阴性对照组和空白对照组时A549细胞中Ang-2 mRNA表达水平(n=3)；
图9为shRNA实验组、阴性对照组和空白对照组分别干扰Ang-2后对A549细胞增殖能力影响的统计分析图；
图10中左边附图为shRNA实验组的A549细胞侵袭结晶紫染色图，中间附图为阴性对照组的A549细胞侵袭结晶紫染色图，右边附图为空白对照组的A549细胞侵袭结晶紫染色图；
图11为细胞迁移计数统计图；
图12为细胞侵袭计数统计图；
图13为干扰Ang-2后蛋白E-cadherin, Snail, Twist和vimentin表达的Westernblotting 分析图谱；
图14为shRNA实验组、阴性对照组和空白对照组中蛋白E-cadherin, Snail,Twist和vimentin与β-actin的相对比率(n=3)。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
特异性shRNA筛选及其靶向Ang-2基因抑制肺癌细胞的验证方法，经细胞复苏、细胞培养、细胞转染、干扰前后实时荧光定量PCR检测Ang-2表达、干扰前后细胞中蛋白表达分析、CCK-8方法检测干扰Ang-2基因前后的肺癌细胞增殖能力及干扰前后细胞侵袭、迁移能力改变的检测的步骤完成对特异性shRNA的筛选及其靶向Ang-2基因抑制肺癌细胞的验证；
实时荧光定量PCR检测Ang-2表达的具体步骤包括Total RNA提取、逆转录cDNA和荧光定量RT-PCR。
其中，细胞复苏的具体步骤为：
从-80℃冰箱将细胞Beas-2B、SPCA-1、NCI-H1650、A549和NCI-H1975的冻存管取出，立即放入37℃恒温水浴锅中快速震荡解冻；
完全解冻情况下，用75%酒精消毒擦拭冻存管后置于超净台；
将细胞转移至10ml RPMI-1640完全培养基中混匀后在1000 rpm环境下离心5min；
弃上清液后加3mL RPMI-1640完全培养液轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移至培养瓶，置37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养，次日观察细胞生长情况，酌情换液继续培养。
其中，细胞培养的具体步骤为：
细胞密度 >80% 时对细胞进行消化和传代，弃去旧培养液后，使用PBS洗涤两次，加入2ml含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液；
将培养瓶置于显微镜下观察细胞形态变化，当细胞形态变圆、胞质回缩及细胞间隙增大时，吸弃胰蛋白酶消化液，加入6-8ml RPMI-1640完全培养基吹打重悬细胞得到细胞悬液；
将细胞悬液按1:2或1:3分装于两个新的培养瓶中，再加入RPMI-1640完全培养基使培养瓶中总量达3ml，将培养瓶置于培养箱中继续培养。
其中，细胞转染的具体步骤为：
将A549细胞接种于六孔板中，加入2ml RPMI-1640无抗培养基，接种数量为5×105-8×105；
当细胞密度长至全孔60%后，在两份170μl RPMI-1640基础培养基中分别加入2.5μg shRNA和NC-shRNA，柔和混匀，得到shRNA稀释液和NC-shRNA稀释液；
用50μl RPMI-1640基础培养基稀释6μl Engreen转染试剂，轻轻吹打3-5次，室温静置5min，得到转染试剂稀释液；
混匀shRNA稀释液和转染试剂稀释液得到shRNA混合液，室温静置15-20min；
分别在shRNA混合液和NC-shRNA稀释液中转入A549细胞形成shRNA实验组和阴性对照组，并设置空白对照组，24h后荧光显微镜观察转染效率。
其中，干扰前后实时荧光定量PCR检测Ang-2表达的Total RNA提取具体步骤：
收集细胞至1.5ml RNA-free离心管中，离心管加入1ml Trizol总RNA提取液并充分混匀，室温静置5min；
在静置后的离心管分别加入0.2ml三氯甲烷后剧烈震荡15s，室温静置2min；
在4℃，12000r/min的环境下离心15min，吸取上清至新1.5ml离心管中；加入与上清液等量的异丙醇轻轻混匀，室温静置10min；
在4℃，12000r/min的环境下离心10min后弃上清，加入1ml预冷的75%乙醇，所述75%乙醇由DEPC水配置，轻轻洗涤沉淀，在4℃，7500r/min的环境下离心5min，弃上清并晾干；
加入20ul DEPC水，所述DEPC水为在65℃环境下促溶10-15min所得；使用紫外分光光度仪测定提取RNA的浓度和纯度，DEPC水调零。
其中，干扰前后实时荧光定量PCR检测Ang-2表达的逆转录cDNA的具体步骤包括：
取oligo dT 18 primer 1μl，5xReaction Buffer 4μl，RibolockTMRibonucleaseinhibitor 1μl，10mM dNTP Mix 2μl，Total RNA 5μl，RevertAidTM ReverseTranscriptase 1μl，加入RNase Free dH2O 至总体积为20μl，混匀后离心，42℃环境下孵育1h，在70℃ 环境下保持5min后终止反应，转录为cDNA溶液，-20℃保存备用。
其中，干扰前后实时荧光定量PCR检测Ang-2表达中荧光定量RT-PCR的具体步骤为：取SYBR Green/ROX Master Mix 12.5μl，Forward primer 0.3μM，Reverse primer 0.3μM，Water 10.5μl，cDNA 溶液 1μl，总体积为 25μl，经Applied Biosystems 7500RealTime PCR System仪反应；经过95℃ 10min预变性后进入PCR循环，95℃ 15s变性，60℃1min退火延伸，反应40个循环。
其中，干扰前后细胞中蛋白表达分析的具体步骤为：
a.蛋白抽提和浓度测定：PBS冲洗贴壁细胞两遍后，加适量含1%的PMSF及磷酸酶抑制剂的裂解液，冰上裂解15min，用刮板收集细胞，在4℃ 12000r/min环境下离心20min，以BCA法测定浓度，稀释到最佳上样量；按SDS-PAGE蛋白上样缓冲液体积：蛋白体积=1：4的比例加入蛋白上样缓冲液，并于100℃煮5min，使蛋白变性；所收集到的变性蛋白立即使用或-80℃保存待用；
b.Western blotting免疫印迹试验：
制备10%SDS聚丙烯酰胺凝胶分离胶和5%浓缩胶，所述分离胶的配方为：ddH2O 1.3mL，1mol/L PH8.8 Tris-HCl 1.9 mL，30% Arc- Bis 1.7 mL，10% SDS 50 μl，TEMED 2 μl及10%过硫酸铵 50 μl；所述浓缩胶的配方为：ddH2O 1.4 mL，1 mol/L pH 6.8 Tris-HCl0.25 mL，30% Arc-Bis 0.33 mL，10% SDS 20 μl，TEMED 2 μl及10%过硫酸铵AP 20 μl；
向电泳槽内加入足量电泳缓冲液，所述电泳缓冲液的配方为：SDS 1g，Tris 3.02g，甘氨酸 14.4 g，ddH2O 1 000 mL；
调节所收集的变性蛋白浓度和每个孔上样体积，使每孔上样总量达200μg进行电泳；电泳恒压80 V×40 min，后100 V×1h；
电泳结束后将切好的SDS聚丙烯酰胺凝胶分离胶放入转膜槽内，加入800ml转膜缓冲液进行转膜，恒流300 mA×2h；所述转膜缓冲液的配方为Tris 3.02 g，甘氨酸 14.4 g，ddH2O 600 mL，100%甲醇200 mL；
待蛋白转移至PVDF膜后拿出，使用TBST缓冲液漂洗5 min，共漂洗4次，所述TBST缓冲液的配方为：NaCl 8.0 g，Tris 2.42 g，Tween-20 0.5 mL，ddH2O 1000 mL；室温下，封闭液脱色摇床封闭1 h；
TBST缓冲液漂洗5 min，共漂洗3次，加入1：1000的兔抗人Ang-2 、1：200倍的鼠抗人E-cadherin、1：2000倍的鼠抗人VIM、1：500倍的鼠抗人Snail、1：200倍的鼠抗人Twist 及1：2000倍的鼠抗人β-actin抗体作为内参，4℃环境下过夜，TBST缓冲液漂洗5 min，共漂洗4次，TBST 缓冲液按1:1000稀释辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗兔或羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育60min，洗涤后ECL显色并拍照。
其中，CCK-8方法检测干扰Ang-2基因前后的肺癌细胞增殖能力的具体步骤：
设置实验组：shRNA实验组，阴性对照组和空白对照组，shRNA实验组包括shRNA1、shRNA2和shRNA3，shRNA1的序列为TTACTCA TTGTATGAACAT、shRNA2的序列为CTAATTCTACAGAAGAGAT和shRNA3的序列为CACGGTGAATAATTCAGTT；
在96孔板中接种对数生长期A549细胞，每孔约2000个，每孔100µl；
24小时后进行细胞转染，以CCK8实验，分别检测转染后0h、24h、48h、72h细胞增殖情况，每个时段设置3个复孔；
每孔加入10µl CCK8溶液继续培养120min，用多功能酶标仪在450nm波长测量各孔的吸光度A450值，取其均值。
其中，干扰前后细胞侵袭、迁移能力改变的检测的具体步骤：
将RPMI-1640无血清培养基与Matrigel基质胶按照4:1比例对Matrigel基质胶进行稀释形成基质胶稀释液；
取shRNA转染后的shRNA实验组、阴性对照组及空白对照组的细胞，用胰酶消化后离心，使用RPMI-1640基础培养基重悬并进行细胞计数，调整细胞密度为1 x 105/mL；
将调整细胞密度后的shRNA实验组，阴性对照组和空白对照组的细胞接种于3个Transwell小室，每个Transwell小室分别加50µl基质胶稀释液，在37℃环境下孵育2h，待胶凝固作为侵袭组；
将调整细胞密度后的shRNA实验组，阴性对照组和空白对照组的细胞接种于3个Transwell小室，作为迁移组；
每个小室加入200µl细胞悬液，24孔板加入600µl RPMI-1640完全培养基，将Transwell小室放入24孔板并在37℃、5%CO2 培养箱中孵育，迁移组12h，侵袭组24h；
取出培养箱中的Transwell小室，使用PBS清洗2遍，用棉签轻轻拭去小室内侧细胞，PBS再洗2遍；
将小室滤膜用4%多聚甲醛固定20min，弃固定液，每孔加入600µl结晶紫染液染色15min，PBS清洗3遍后将小室取出，自然干燥；
正置于载玻片，放于荧光显微镜下拍照，并计数每个小室外侧的中央部分及其周围随机3个视野。
图1A-图1E分别为肺癌细胞SPCA-1、NCI-H1650、A549、NCI-H1975及正常肺上皮细胞Beas-2B筛选高表达Ang-2细胞株，五株细胞在RPMI-1640完全培养基中贴壁生长，繁殖较快，其中Beas-2B，SPCA-1，A549，NCI-1650细胞2-3天传代一次，NCI-H1975细胞3-4天传代一次，各细胞生长状态良好。
如图2-图4所示为用Western Blot检测SPCA-1、NCI-H1650、A549、NCI-H1975及正常肺上皮细胞Beas-2B这五株细胞中Ang-2蛋白表达及基因水平表达。正常肺上皮细胞Beas-2B中Ang-2表达量最少，癌细胞中A549及NCI-H1975表达量高，qRT-PCR以正常肺上皮细胞作为对照组，结果与Western Blot一致。
图5A与图5B所示分别为shRNA成功转染A549细胞转染平衡光图和shRNA成功转染A549细胞转染荧光图。
如图6-图7所示，Western blotting结果显示shRNA实验组与阴性对照组和空白对照组之间Ang-2表达差异明显，其中以序列为TTACTCA- TTGTATGAACAT的shRNA-1抑制最显著。RT-PCR结果显示阴性对照组和空白对照组中Ang-2表达比shRNA实验组高。如图8所示，实验组中的shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3对Ang-2-mRNA抑制效率分别为63.44%，10.81%，8.19%，RT-PCR以空白对照组为对照，结果与Western blotting相一致，同样显示shRNA-1对Ang-2表达的抑制作用最明显。Western blotting和RT-PCR均表明序列为TTACTCA-TTGTATGAACAT的shRNA-1对Ang-2的抑制作用最明显，筛选出抑制效果最好的shRNA-1序列为特异性shRNA。
如图9所示，CCK-8方法检测干扰Ang-2基因对肺癌细胞增殖能力的影响，转染0h和24h，shRNA实验组与阴性对照组和空白对照组之间细胞增殖无明显差异（P>0.05），转染48h和72h后，shRNA实验组细胞增殖速度明显低于阴性对照组和空白对照组，随着时间的延长，抑制效果越明显。
Ang-2在肿瘤中通过促进血管形成而促进癌细胞的侵袭和转移。对Ang-2干扰前后细胞侵袭、迁移能力改变的检测；收集转染shRNA干扰Ang-2的shRNA实验组细胞、阴性对照组细胞及空白对照组接种于Transwell小室，24小时后固定染色空气干燥，如图10所示，左边附图为shRNA实验组的A549细胞侵袭结晶紫染色图，中间附图为阴性对照组的A549细胞侵袭结晶紫染色图，右边附图为空白对照组的A549细胞侵袭结晶紫染色图；如表1所示为shRNA实验组、阴性对照组和空白对照组中肺癌细胞侵袭、迁移数据统计显示，shRNA实验组与阴性对照组和空白对照组相比细胞侵袭、迁移数据明显减少，差异有统计学意义，如图11阴性对照组未见明显统计学意义。侵袭组数据统计显示，如图12所示，shRNA实验组细胞量明显少于阴性对照组和空白对照组，差异有统计学意义，而阴性对照组和空白对照组间差异未见统计学意义，由上表明shRNA靶向Ang-2基因能够有效抑制肺癌细胞侵袭、迁移能力。
表1为肺癌细胞侵袭、迁移结晶紫染色细胞计数
Figure 198773DEST_PATH_IMAGE001
shRNA实验组、阴性对照组与空白对照组三组进行比较*P<0.05.
间充质细胞参与组织修复，尤其是肿瘤侵袭和迁移，EMT是间充质细胞的一个重要来源。对Ang-2干扰后，EMT各蛋白表达如图13和图14所示，shRNA实验组中细胞的E-cadherin蛋白量表达增加，Snail、VIM和Twist蛋白表达降低，EMT蛋白E-cadherin表达升高，Snail，VIM与Twist表达降低，使其上皮间质转化能力下降。
E-cadherin, Snail, Twist和vimentin是调节EMT的关键蛋白，E-cadherin是一个重要的经典钙黏蛋白，调节正常成熟上皮细胞损伤，E-cadherin表达缺失促进肿瘤侵袭和转移，可作为EMT标志。然而，vimentin是中间丝的一个组成部分，高表达时可使EMT相关基因高表达，是EMT正向表达的标志。 Snail, Twist也是EMT调节的重要标志，其异常表达影响EMT过程，增加肿瘤细胞的侵袭和迁移。通过转染Ang-2高表达细胞株筛选抑制效果最好的shRNA序列，观察干扰Ang-2以后对肺癌细胞生物学行为影响，细胞增殖、侵袭、迁移能力明显抑制。
上述实施例只是本发明的较佳实施例，并不是对本发明技术方案的限制，只要是不经过创造性劳动即可在上述实施例的基础上实现的技术方案，均应视为落入本发明专利的权利保护范围内。
序列表
<110> 南通市第一人民医院
<120> 特异性shRNA筛选及其靶向Ang-2基因抑制肺癌细胞的验证方法
<140> 2017103670687
<141> 2017-05-13
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> shRNA1的序列(shRNA1)
<400> 1
ttactcattg tatgaacat 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> shRNA2的序列(shRNA2)
<400> 2
ctaattctac agaagagat 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> shRNA3的序列(shRNA3)
<400> 3
cacggtgaat aattcagtt 19

Claims (8)

1.一种靶向Ang-2(血管生成素-2)基因抑制肺癌细胞的特异性shRNA的筛选方法，其特征在于：经细胞复苏、细胞培养、细胞转染、干扰前后实时荧光定量PCR检测Ang-2表达、干扰前后细胞中蛋白表达分析、CCK-8方法检测干扰Ang-2基因前后的肺癌细胞增殖能力及干扰前后细胞侵袭、迁移能力改变的检测的步骤完成对特异性shRNA的筛选；筛选出最优特异性shRNA的shRNA-1，所述shRNA-1的序列为：TTACTCA TTGTATGAACAT；
所述干扰前后实时荧光定量PCR检测Ang-2表达具体步骤包括Total RNA提取、逆转录cDNA和荧光定量RT-PCR；
其中，所述干扰前后细胞中蛋白表达分析的具体步骤为：
a.蛋白抽提和浓度测定：PBS冲洗贴壁细胞两遍后，加适量含1%的PMSF及磷酸酶抑制剂的裂解液，冰上裂解15min，用刮板收集细胞，在4℃ 12000r/min环境下离心20min，以BCA法测定浓度；按SDS-PAGE蛋白上样缓冲液体积：蛋白体积=1：4的比例加入蛋白上样缓冲液，并于100℃煮5min，使蛋白变性；所收集到的变性蛋白立即使用或-80℃保存待用；
b.Western blotting免疫印迹试验：
制备10%SDS聚丙烯酰胺凝胶分离胶和5%浓缩胶，所述分离胶的配方为：ddH2O 1.3 mL，1mol/L PH8.8 Tris-HCl 1.9 mL，30% Arc- Bis 1.7 mL，10% SDS 50 μl，TEMED 2 μl及10%过硫酸铵 50 μl；所述浓缩胶的配方为：ddH2O 1.4 mL，1 mol/L pH 6.8 Tris-HCl0.25 mL，30% Arc-Bis 0.33 mL，10% SDS 20 μl，TEMED 2 μl及10%过硫酸铵AP 20 μl；
向电泳槽内加入足量电泳缓冲液，所述电泳缓冲液的配方为：SDS 1g，Tris 3.02 g，甘氨酸 14.4 g，ddH2O 1 000 mL；
调节所收集的变性蛋白浓度和每个孔上样体积，使每孔上样总量达200μg进行电泳；电泳恒压80 V×40 min，后100 V×1h；
电泳结束后将切好的SDS聚丙烯酰胺凝胶分离胶放入转膜槽内，加入800ml转膜缓冲液进行转膜，恒流300 mA×2h；所述转膜缓冲液的配方为Tris 3.02 g，甘氨酸 14.4 g，ddH2O600 mL，100%甲醇200 mL；
待蛋白转移至PVDF膜后拿出，使用TBST缓冲液漂洗5 min，共漂洗4次，所述TBST缓冲液的配方为：NaCl 8.0 g，Tris 2.42 g，Tween-20 0.5 mL，ddH2O 1000 mL；室温下，封闭液脱色摇床封闭1 h；
TBST缓冲液漂洗5 min，共漂洗3次，加入1：1000的兔抗人Ang-2 、1：200倍的鼠抗人E-cadherin、1：2000倍的鼠抗人VIM、1：500倍的鼠抗人Snail、1：200倍的鼠抗人Twist 及1：2000倍的鼠抗人β-actin抗体作为内参，4℃环境下过夜，TBST缓冲液漂洗5 min，共漂洗4次，TBST 缓冲液按1:1000稀释辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗兔或羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育60min，洗涤后ECL显色并拍照；
其中，所述CCK-8方法检测干扰Ang-2基因前后的肺癌细胞增殖能力的具体步骤：
设置实验组：shRNA实验组，阴性对照组和空白对照组，在96孔板中接种对数生长期A549细胞，每孔2000个，每孔100µl；
24小时后进行细胞转染，以CCK8实验，分别检测转染后0h、24h、48h、72h细胞增殖情况，每个时段设置3个复孔；
每孔加入10µl CCK8溶液继续培养120min，用多功能酶标仪在450nm波长测量各孔的吸光度A450值，取其均值。
2.根据权利要求1所述的一种靶向Ang-2基因抑制肺癌细胞的特异性shRNA的筛选方法，其特征在于：所述细胞复苏的具体步骤为：
从-80℃冰箱将细胞Beas-2B、SPCA-1、NCI-H1650、A549和NCI-H1975的冻存管取出，立即放入37℃恒温水浴锅中快速震荡解冻；
完全解冻情况下，用75%酒精消毒擦拭冻存管后置于超净台；
将细胞转移至10ml RPMI-1640完全培养基中混匀后在1000 rpm环境下离心5 min；
弃上清液后加3mL RPMI-1640完全培养液轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移至培养瓶，置37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养，次日观察细胞生长情况，酌情换液继续培养。
3.根据权利要求1所述的一种靶向Ang-2基因抑制肺癌细胞的特异性shRNA的筛选方法，其特征在于：所述细胞培养的具体步骤为：
细胞密度 >80% 时对细胞进行消化和传代，弃去旧培养液后，使用PBS洗涤两次，加入2ml含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液；
将培养瓶置于显微镜下观察细胞形态变化，当细胞形态变圆、胞质回缩及细胞间隙增大时，吸弃胰蛋白酶消化液，加入6-8ml RPMI-1640完全培养基吹打重悬细胞得到细胞悬液；
将细胞悬液按1:2或1:3分装于两个新的培养瓶中，再加入RPMI-1640完全培养基使培养瓶中总量达3ml，将培养瓶置于培养箱中继续培养。
4.根据权利要求1所述的一种靶向Ang-2基因抑制肺癌细胞的特异性shRNA的筛选方法，其特征在于：所述细胞转染的具体步骤为：
将A549细胞接种于六孔板中，加入2ml RPMI-1640无抗培养基，接种数量为5×105-8×105；
当细胞密度长至全孔60%后，在两份170μl RPMI-1640基础培养基中分别加入2.5μgshRNA和NC-shRNA，柔和混匀，得到shRNA稀释液和NC-shRNA稀释液；
用50μl RPMI-1640基础培养基稀释6μl Engreen转染试剂，轻轻吹打3-5次，室温静置5min，得到转染试剂稀释液；
混匀shRNA稀释液和转染试剂稀释液得到shRNA混合液，室温静置15-20min；
分别在shRNA混合液和NC-shRNA稀释液中转入A549细胞形成shRNA实验组和阴性对照组，并设置空白对照组，24h后荧光显微镜观察转染效率。
5.根据权利要求1所述的一种靶向Ang-2基因抑制肺癌细胞的特异性shRNA的筛选方法，其特征在于：所述干扰前后实时荧光定量PCR检测Ang-2表达的Total RNA提取具体步骤：
收集细胞至1.5ml RNA-free离心管中，离心管加入1ml Trizol总RNA提取液并充分混匀，室温静置5min；
在静置后的离心管分别加入0.2ml三氯甲烷后剧烈震荡15s，室温静置2min；
在4℃，12000r/min的环境下离心15min，吸取上清至新1.5ml离心管中；加入与上清液等量的异丙醇轻轻混匀，室温静置10min；
在4℃，12000r/min的环境下离心10min后弃上清，加入1ml预冷的75%乙醇，所述75%乙醇由DEPC水配置，轻轻洗涤沉淀，在4℃，7500r/min的环境下离心5min，弃上清并晾干；
加入20ul DEPC水，所述DEPC水为在65℃环境下促溶10-15min所得；使用紫外分光光度仪测定提取RNA的浓度和纯度，DEPC水调零。
6.根据权利要求1所述的一种靶向Ang-2基因抑制肺癌细胞的特异性shRNA的筛选方法，其特征在于：所述干扰前后实时荧光定量PCR检测Ang-2表达的逆转录cDNA的具体步骤包括：
取oligo dT 18 primer 1μl，5xReaction Buffer 4μl，RibolockTM Ribonucleaseinhibitor 1μl，10mM dNTP Mix 2μl，Total RNA 5μl，RevertAidTMReverse Transcriptase1μl，加入RNase Free dH2O 至总体积为20μl，混匀后离心，42℃环境下孵育1h，在70℃环境下保持5min后终止反应，转录为cDNA溶液，-20℃保存备用。
7.根据权利要求1所述的一种靶向Ang-2基因抑制肺癌细胞的特异性shRNA的筛选方法，其特征在于：所述干扰前后实时荧光定量PCR检测Ang-2表达中荧光定量RT-PCR的具体步骤为：取SYBR Green/ROX Master Mix 12.5μl，Forward primer 0.3μM，Reverse primer0.3μM，Water 10.5μl，cDNA溶液 1μl，总体积为 25μl，经Applied Biosystems 7500RealTime PCR System仪反应；经过95℃ 10min预变性后进入PCR循环，95℃ 15s变性，60℃1min退火延伸，反应40个循环。
8.根据权利要求1所述的一种靶向Ang-2基因抑制肺癌细胞的特异性shRNA的筛选方法，其特征在于：所述干扰前后细胞侵袭、迁移能力改变的检测的具体步骤：
将RPMI-1640无血清培养基与Matrigel基质胶按照4:1比例对Matrigel基质胶进行稀释形成基质胶稀释液；
取shRNA转染后的shRNA实验组、阴性对照组及空白对照组的细胞，用胰酶消化后离心，使用RPMI-1640基础培养基重悬并进行细胞计数，调整细胞密度为1 x 105/mL；
将调整细胞密度后的shRNA实验组，阴性对照组和空白对照组的细胞接种于3个Transwell小室，每个Transwell小室分别加50µl基质胶稀释液，在37℃环境下孵育2h，待胶凝固作为侵袭组；
将调整细胞密度后的shRNA实验组，阴性对照组和空白对照组的细胞接种于3个Transwell小室，作为迁移组；
每个小室加入200µl细胞悬液，24孔板加入600µl RPMI-1640完全培养基，将Transwell小室放入24孔板并在37℃、5%CO2培养箱中孵育，迁移组12h，侵袭组24h；
取出培养箱中的Transwell小室，使用PBS清洗2遍，用棉签轻轻拭去小室内侧细胞，PBS再洗2遍；
将小室滤膜用4%多聚甲醛固定20min，弃固定液，每孔加入600µl结晶紫染液染色15min，PBS清洗3遍后将小室取出，自然干燥；
正置于载玻片，放于荧光显微镜下拍照，并计数每个小室外侧的中央部分及其周围随机3个视野。
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