CN109777831A - 一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1 - Google Patents

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张伟伟
张珍珠
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Abstract

一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN‑1，属于基因工程技术领域，其特征在于：设计最优靶向CREB1的干扰片段，其核苷酸序列如Seq ID No:1所示，构建靶向CREB1的shRNA干扰表达载体，命名为pFYJN‑1，转染肺癌细胞，通过qRT‑PCR、Western blot和Odyssey双红外激光成像系统检测RNAi后的CREB1和MRP1基因mRNA、蛋白的表达水平和蛋白条带变化并分析结果；流式细胞术检测细胞Rho123外排，结果显示：敲低CREB1的表达能下调MRP1基因的表达，且肺癌细胞Rho123外排减弱，药物潴留量增加，逆转肺癌细胞MDR。

Description

一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载 体pFYJN-1
技术领域
本发明涉及一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1，属于基因工程技术领域。
背景技术
多药耐药(muhidrug resistance,MDR)是指肿瘤细胞长期通过某一化疗药物治疗，对此药物产生耐药现象,而且不仅对此种化疗药物产生耐药性，对其他结构和功能不同的抗肿瘤药物也产生交叉耐药现象，这是造成化疗失败的主要原因(Ullah et al.,2014)。因此，探索MDR机制是解决耐药问题、改善化疗效果的关键。相关研究表明，MDR通过几种机制发生，其中MDR的经典细胞机制涉及通过各种膜转运蛋白流出药物。ATP结合盒(ABC)转运蛋白是一类蛋白质，通过ATP依赖性药物外排泵介导MDR。已经表征了ABC超家族的几种转运蛋白，包括P-糖蛋白(P-gp，MDR-1；ABCB-1)，多药耐药相关蛋白-1(MRP-1；ABCC-1)，(BCRP；ABCG-2)在化学抗性细胞中过表达(Kim et al.,2015)。MDR的主要机制是由于MDR相关蛋白(例如多药耐药相关蛋白1(MRP1))通过质膜从治疗的癌细胞中主动流出多种抗癌药物(Luet al.,2015)。cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)，是核转录因子。该基因的交替剪接导致编码不同种型的几种转录物变体；作为转录激活因子，CREB1与启动子上的保守cAMP反应元件(CRE)结合，并介导对多种刺激的转录反应，包括激素，膜去极化，生长和神经营养因子，从而充当不同信号通路之间的介质(Xie etal.,2015)。近期研究发现，CREB蛋白水平在部分癌组织和细胞中呈高表达(Tan et al.,2012)，如果阻断CREB与细胞增殖相关基因的结合能显著性抑制肿瘤细胞的生长。由此可见，CREB作为在多种肿瘤中高表达并发挥重要作用的转录因子，参与到肿瘤细胞的增殖、存活及转移等各个方面的调节。因此如何发明一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1成为急需解决的一大难题，所以首先复苏和培养A549/DDP细胞，接着根据NCBI中人CREB1基因(NM号：134442.4)的mRNA序列，按照RNAi设计原则，设计最优靶向CREB1的干扰片段：GCCGGGTACTACCATTCTACA。分析质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP的多克隆位点，在5’端加上BamHⅠ酶切位点，3’端加上HindⅢ酶切位点，经NCBI Blast比对同源性确定与其他基因无同源性，送至上海生工合成，命名为pFYJN-1。在上述序列的基础上，加上序列为CGAA的LOOP环，反向互补序列及酶切位点，组成完整的RNAi干扰序列，以合成上下游引物的方式分别合成，用T4DNA连接酶连接酶切载体与目的片段，连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中；挑取单个菌落并进行富集培养，提取重组载体质粒，构建靶向CREB1的shRNA干扰表达载体，利用shRNA干扰表达载体转染A549/DDP细胞，通过qRT-PCR检测RNAi后的CREB1和MRP1基因mRNA的表达水平，通过Western blot检测RNAi后的CREB1和MRP1蛋白表达水平，发明一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1是必要的。
发明内容
为了克服如何通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的难题，本发明提供了一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1，该一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的方法，首先复苏和培养A549/DDP细胞，接着根据NCBI中人CREB1基因(NM号：134442.4)的mRNA序列，按照RNAi设计原则，设计最优靶向CREB1的干扰片段：GCCGGGTACTACCATTCTACA。分析质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP的多克隆位点，在5’端加上BamHⅠ酶切位点，3’端加上HindⅢ酶切位点，经NCBI Blast比对同源性确定与其他基因无同源性，送至上海生工合成，命名为pFYJN-1。在上述序列的基础上，加上序列为CGAA的LOOP环，反向互补序列及酶切位点，组成完整的RNAi干扰序列，以合成上下游引物的方式分别合成，用T4DNA连接酶连接酶切载体与目的片段，连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中；挑取单个菌落并进行富集培养，提取重组载体质粒，构建靶向CREB1的shRNA干扰表达载体，待细胞生长至汇合度为60％左右时开始转染A549/DDP细胞，通过qRT-PCR检测RNAi后的CREB1和MRP1基因mRNA的表达水平，通过Western blot检测RNAi后的CREB1和MRP1蛋白表达水平，使用Odyssey双红外激光成像系统检测蛋白条带变化并分析结果。结果显示，敲低CREB1的表达Rho123药物外排减弱，药物潴留量增加，逆转肺癌细胞MDR。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
本发明一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1，具体方案如下：
1.A549/DDP细胞复苏和培养
1.1细胞复苏:(1)液氮中取出冻存细胞，在37℃水浴锅内快速摇晃；(2)待其全部融化，缓慢注入含5mL 1640培养基的离心管中，1000g离心5min弃上清；(3)5mL 1640培养基悬浮沉淀，移至细胞瓶，37℃、5％CO2培养箱内培养细胞。
1.2A549/DDP细胞传代培养:(1)弃原瓶内培养基，用5mL PBS轻轻洗涤细胞2遍；(2)加入1mL胰酶，镜下观察，待细胞形态发生改变；(3)加入5mL培养基终止消化，反复轻微吹打细胞，吹下所有贴壁细胞；(4)再加入10mL培养基混合均匀后，分别取出5mL培养基加入两个新瓶中，37℃、5％CO2培养箱内培养细胞。
1.3A549/DDP细胞正常形态图：肺癌A549/DDP细胞复苏及传代培养之后，其生长状态如图2所示，可见细胞贴壁生长，折光率良好，生长状态良好。
2.通过RNAi沉默CREB1影响肺癌细胞的MDR
2.1靶向CREB1的shRNA干扰表达载体的构建：设计shCREB1：根据NCBI中人CREB1基因(NM号：134442.4)的mRNA序列，按照RNAi设计原则，设计最优靶向CREB1的干扰片段：GCCGGGTACTACCATTCTACA。分析质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP的多克隆位点，在5’端加上BamHⅠ酶切位点，3’端加上HindⅢ酶切位点，经NCBI Blast比对同源性确定与其他基因无同源性，送至上海生工合成，命名为pFYJN-1。在上述序列的基础上，加上序列为CGAA的LOOP环，反向互补序列及酶切位点，组成完整的RNAi干扰序列，以合成上下游引物的方式分别合成的序列见表2。(1)合成的上下游序列退火反应，反应体系为：上游引物，2μL；下游引物，2μL；10×PCR buffer，5μL；dd H2O，41uL；(2)用HindⅢ、BamHⅠ双酶切pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP载体，琼脂糖凝胶电泳检测载体是否切开，使用T4DNA连接酶，按照表4连接体系进行连接。双酶切回收后的线性与退火后的shCREB1片段的摩尔比为1：5，按照表5体系进行连接；(3)用T4DNA连接酶连接酶切载体与目的片段，连接体系为：PCR产物，1.0μL；10×buffer，1.0μL；回收的双切载体，2.0μL；dd H2O，5.0μL；T4DNA连接酶，1.0μL；(4)连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中；(5)挑取单个菌落并进行富集培养，提取重组载体质粒；(6)双酶切验证及送至上海生工生物技术服务有限公司测序鉴定测序验证。
2.2PEI转染法转染肺癌A549/DDP细胞：(1)待细胞生长至汇合度为60％左右时开始转染；(2)在1.5EP管中，加入300μL Opti-DMEM与12μg重组质粒混合，再另一个1.5EP管中每管加入300μL Opti-DMEM与24μL PEI混合，静置孵育8min；(3)将上述两管充分混匀，静置孵育15min；(4)吸取细胞瓶内培养基，用PBS洗一次，加入不含双抗和血清的1640培养基培养；(5)将上述混好的混合液600μL加入细胞瓶内的无血培养基中，上下左右轻晃混匀。置于37℃，5％CO2培养箱中培养4h后，将原培养基吸掉，换成完全培养基继续培养。
2.3qRT-PCR检测CREB1及MRP1mRNA表达水平
2.3.1肺癌A549/DDP细胞总RNA提取：(1)弃原瓶内培养基，用5mL PBS轻轻洗涤细胞2遍；(2)加入1mL胰酶，镜下观察，待细胞形态发生改变；(3)加入5mL培养基终止消化，反复轻微吹打细胞，吹下所有贴壁细胞；(4)移至离心管中，1000g离心5min，弃上清；(5)1mLPBS悬浮细胞，移至1.5Ep管中，5000g离心2min，弃上清；(6)每个Ep管中加入1mL Trizol，悬浮细胞室温静置10min；(7)加入0.2mL氯仿，剧烈震荡30s，室温放置3min，12000r/min 4℃离心10min；(8)将上层转移至干净的1.5Ep管中，加入无水乙醇1/2倍体积，充分混匀；(9)将上述混合液转移至吸附柱中，静置2min，12000r/min 4℃离心3min，倒掉收集管中液体；(10)加入500μL RPE Solution，静止2min，10000r/min 4℃离心30s，倒掉收集管中液体，重复一次；(11)把吸附柱放入收集管中，10000r/min 4℃离心2min；(12)将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入30μL DEPC-treated ddH2O，静止5min，12000r/min 4℃离心2min。
2.3.2反转录反应根据反转录试剂盒说明书，采用两步法将已获得的Total RNA反转录为cDNA。(1)按反转录反应体系Ⅰ：Total RNA or Poly(A)RNA，0.2—2μL；Oligo dT orRandom Primer(50μM)，1μL；Dntp Mixture(10mM each)，1μL；Rnase Free H2O，Up to 14μL，配制反转录反应液；(2)在PCR仪上进行以下反应：65℃，5min，然后置于冰上急冷；(3)在上述PCR管中加入按反转录反应体系Ⅱ：上述变性、退火后反应液，14μL；5Xfirst-strandBuffer，4μL；M-MuLV Reverse Transcriptase(200U/μL)，1μL；Rnase Inhibitor，1μL配制的反转录反应液(20μL体系)；(4)在PCR仪上按以下条件进行反转录反应：42-50℃，45-60min；70℃，10min；-20℃保存。
2.3.3qRT-PCR反应体系：(1)将所得cDNA用Power 2×SYBR Real-Time PCRPremixture试剂盒进行Real Time PCR，反应体系为20μL，qRT-PCR反应体系：cDNA，1μL；Sense primer，0.4μL；Anti-sense primer，0.4μL；2×Mix，10μL；Rox，0.4μL；ddH2O，7.8μL；(2)反应条件为：95℃2min，40×(95℃15s，60℃40s)，95℃15s，60℃1min；循环结束后进行溶解曲线检测；(3)数据以2-ΔΔCt法进行计算；(4)各基因qRT-PCR上下游引物序列见表8。
2.4Western blot检测CREB1及MRP1蛋白表达水平
2.4.1肺癌A549/DDP细胞全蛋白提取：(1)弃原瓶内培养基，用5mL PBS轻轻洗涤细胞2遍；(2)加入1mL胰酶，镜下观察，待细胞形态发生改变；(3)加入5mL培养基终止消化，反复轻微吹打细胞，吹下所有贴壁细胞；(4)移至离心管中，1000g离心5min，弃上清；(5)1mLPBS悬浮细胞，移至1.5Ep管中，5000g离心2min，弃上清；(6)加300μL蛋白裂解液，置于4℃摇床上30min；(7)12000g离心20min，取上清，-20℃保存。
2.4.2蛋白质变性：蛋白样品与上样缓冲液按4:1比例混匀，沸水浴加热5min～10min，待其将至室温，-20℃保存或继续实验。
2.4.3SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：(1)组合胶板；(2)按分离胶配方：水，8.2mL；30％丙烯酰胺，6.6mL；10％SDS，0.2mL；Tris-Cl(PH8.8)，5mL；10％APS，200μl；TEMED，20μl配制分离胶；(3)将分离胶注入两层玻璃板中，加入适当位置后，滑动枪头加入1mL异丙醇，待胶凝后，倒出异丙醇，吸净；(4)按浓缩胶配方：水，5.7mL；30％丙烯酰胺，1.7mL；10％SDS，0.1mL；Tris-Cl(PH6.8)，2.5mL；10％APS，100μl；TEMED，10μl配制浓缩胶，将浓缩胶注入两层玻璃板中，至液面溢出，插入梳子；(5)待胶凝后，拔出梳子，与电泳槽组装，加入电泳液；(6)点样，每孔加入30μl样品，Marker上样量为10μL；(7)恒流100mA，点击开始按钮，溴酚蓝到达胶的底端处附近停止电泳。
2.4.4转膜：(1)取出胶板，将胶置于转膜液中浸泡；(2)夹子黑面冲下，按海绵、滤纸、胶、PVDF膜、滤纸、海绵的顺序放好，夹紧夹子；(3)放到转膜槽中，黑对黑放好，放入冰壶，倒入转膜液；(4)组装转膜槽，恒压100V进行转膜。
2.4.5封闭：(1)丽春红染膜5min；(2)清水轻轻冲洗丽春红；(3)根据marker指示大小剪膜；(4)加入5％脱脂奶粉(封闭液)，常温摇床孵育1h。
2.4.6Western杂交：I.一抗孵育：(1)根据说明书，稀释抗体；(2)一抗孵育，置于4℃摇床摇过夜；(3)回收一抗，PBST洗膜10min，三次。II.二抗孵育(避光操作)：(1)根据说明书，稀释抗体；(2)二抗孵育，置于4℃摇床1h；(3)回收二抗，PBST洗膜10min，三次。
2.4.7蛋白上机检测：使用Odyssey双红外激光成像系统检测蛋白条带变化并分析结果。
2.5流式细胞术检测Rho123外排：(1)收集细胞至1.5EP管中，用预冷的1mL PBS洗涤细胞沉淀两次，2 000r/min离心10min；(2)避光将1μL Rho-123加入到500μL 37℃预热的1×Incubation Buffer配成Rho-123工作液；(3)吸取其中500μLRho-123工作液重悬细胞，于37℃、5％CO2培养箱中孵育30min；(4)2000r/min离心10min后收集细胞，再用500μL1×Incubation Buffer重悬清洗细胞2次；(5)最后再用500μL 1×Incubation Buffer重悬细胞，400目筛网过滤后，流式细胞仪检测。
结果显示，敲低CREB1的表达能下调MRP1基因的表达，且肺癌A549/DDP细胞Rho123外排减弱，药物潴留量增加，逆转肺癌细胞MDR。其可为逆转肿瘤细胞的多药耐药性方面提供新思路。
本发明的有益效果为，一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1，首先复苏和培养A549/DDP细胞，接着根据NCBI中人CREB1基因(NM号：134442.4)的mRNA序列，按照RNAi设计原则，设计最优靶向CREB1的干扰片段：GCCGGGTACTACCATTCTACA。分析质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP的多克隆位点，在5’端加上BamHⅠ酶切位点，3’端加上HindⅢ酶切位点，经NCBI Blast比对同源性确定与其他基因无同源性，送至上海生工合成，命名为pFYJN-1。在上述序列的基础上，加上序列为CGAA的LOOP环，反向互补序列及酶切位点，组成完整的RNAi干扰序列，以合成上下游引物的方式分别合成，用T4DNA连接酶连接酶切载体与目的片段，连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中；挑取单个菌落并进行富集培养，提取重组载体质粒，构建靶向CREB1的shRNA干扰表达载体，待细胞生长至汇合度为60％左右时开始转染A549/DDP细胞，通过qRT-PCR检测RNAi后的CREB1和MRP1基因mRNA的表达水平，通过Western blot检测RNAi后的CREB1和MRP1蛋白表达水平，使用Odyssey双红外激光成像系统检测蛋白条带变化并分析结果。结果显示，敲低CREB1的表达能下调MRP1基因的表达，且肺癌A549/DDP细胞Rho123外排减弱，药物潴留量增加，逆转肺癌细胞MDR。
附图说明
下面结合附图对本发明进一步说明。
图1为本发明一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1的shRNA表达载体质粒pFYJN-1图。
图2为本发明一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1的普通光学显微镜下观察A549/DDP细胞(10×10)细胞状态图。
图3为本发明一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1的CREB1和MRP 1基因mRNA表达变化图。图中A为CREB1mRNA表达水平，B为MRP1mRNA表达水平(***p<0.001，**p<0.01)
图4为本发明一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1的Western blot检测结果。
图5为本发明一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1的CREB1和MRP 1基因蛋白表达变化图。图中A为CREB1基因mRNA表达水平；B为MRP1基因mRNA表达水平(***p<0.001)。
图6为本发明一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1的A549/DDP细胞中Rho-123荧光强度变化图。图中为转染pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP组；B为转染pFYJN-1组。
具体实施方式
实施例一：如图所示，本发明一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1实验方法及结果如下：
1.A549/DDP细胞复苏和培养
1.1细胞复苏
(1)液氮中取出冻存细胞，在37℃水浴锅内快速摇晃；
(2)待其全部融化，缓慢注入含5mL 1640培养基的离心管中，1000g离心5min弃上清；
(3)5mL 1640培养基悬浮沉淀，移至细胞瓶，37℃、5％CO2培养箱内培养细胞。
1.2A549/DDP细胞传代培养
(1)弃原瓶内培养基，用5mL PBS轻轻洗涤细胞2遍；
(2)加入1mL胰酶，镜下观察，待细胞形态发生改变；
(3)加入5mL培养基终止消化，反复轻微吹打细胞，吹下所有贴壁细胞；
(4)再加入10mL培养基混合均匀后，分别取出5mL培养基加入两个新瓶中，37℃、5％CO2培养箱内培养细胞。
1.3A549/DDP细胞正常形态图
肺癌A549/DDP细胞复苏及传代培养之后，其生长状态如图2所示，可见细胞贴壁生长，折光率良好，生长状态良好。
2.通过RNAi沉默CREB1影响肺癌细胞的MDR
2.1靶向CREB1的shRNA干扰表达载体的构建
设计shCREB1：根据NCBI中人CREB1基因(NM号：134442.4)的mRNA序列，按照RNAi设计原则，设计最优靶向CREB1的干扰片段见表1。分析质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP的多克隆位点，在5’端加上BamHⅠ酶切位点，3’端加上HindⅢ酶切位点，经NCBI Blast比对同源性确定与其他基因无同源性，送至上海生工合成，命名为pFYJN-1。在上述序列的基础上，加上序列为CGAA的LOOP环，反向互补序列及酶切位点，组成完整的RNAi干扰序列，以合成上下游引物的方式分别合成的序列见表2。
表1 shCREB 1靶点
表2 shCREB1oligo序列
(1)用HindⅢ、BamHⅠ双酶切pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP载体，琼脂糖凝胶电泳检测载体是否切开，双酶切回收后的线性与退火后的shCREB1片段的摩尔比为1：5，使用T4DNA连接酶，按照表4体系进行连接；
(2)合成上下游序列退火反应，反应体系见表3；
表3退火反应体系
(3)用T4DNA连接酶连接酶切载体与目的片段，连接体系见表4；
表4连接体系
(4)连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中；
(5)挑取单个菌落并进行富集培养，提取重组载体质粒；
(6)双酶切验证及送至上海生工生物技术服务有限公司测序鉴定测序验证。
2.2PEI转染法转染肺癌A549/DDP细胞
(1)待细胞生长至汇合度为60％左右时开始转染
(2)在1.5EP管中，加入300μL Opti-DMEM与12μg重组质粒混合，再另一个1.5EP管中每管加入300μL Opti-DMEM与24μL PEI混合，静置孵育8min。
(3)将上述两管充分混匀，静置孵育15min
(4)吸取细胞瓶内培养基，用PBS洗一次，加入不含双抗和血清的1640培养基培养。
(5)将上述混好的混合液600μL加入细胞瓶内的无血培养基中，上下左右轻晃混匀。置于37℃，5％CO2培养箱中培养4h后，将原培养基吸掉，换成完全培养基继续培养。
2.3qRT-PCR检测CREB1及MRP1mRNA表达水平
2.3.1肺癌A549/DDP细胞总RNA提取
(1)弃原瓶内培养基，用5mL PBS轻轻洗涤细胞2遍；
(2)加入1mL胰酶，镜下观察，待细胞形态发生改变；
(3)加入5mL培养基终止消化，反复轻微吹打细胞，吹下所有贴壁细胞；
(4)移至离心管中，1000g离心5min，弃上清；
(5)1mL PBS悬浮细胞，移至1.5Ep管中，5000g离心2min，弃上清；
(6)每个Ep管中加入1mL Trizol，悬浮细胞室温静置10min；
(7)加入0.2mL氯仿，剧烈震荡30s，室温放置3min，12000r 4℃离心10min；
(8)将上层转移至干净的1.5Ep管中，加入无水乙醇1/2倍体积，充分混匀；
(9)将上述混合液转移至吸附柱中，静置2min，12000r/min4℃离心3min，倒掉收集管中液体；
(10)加入500μL RPE Solution，静止2min，10000r/min 4℃离心30s，倒掉收集管中液体，重复一次；
(11)把吸附柱放入收集管中，10000r/min 4℃离心2min；
(12)将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入30μL DEPC-treatedddH2O，静止5min，12000r/min 4℃离心2min。
2.3.2反转录反应根据反转录试剂盒说明书，采用两步法将已获得的Total RNA反转录为cDNA。
(1)按表5配制反转录反应液；
表5反转录反应体系Ⅰ
(2)在PCR仪上进行以下反应：65℃，5min，然后置于冰上急冷；
(3)在上述PCR管中加入表6反转录反应液(20μL体系)；
表6反转录反应体系Ⅱ
(4)在PCR仪上按以下条件进行反转录反应：42-50℃，45-60min；70℃，10min；-20℃保存。
2.3.3qRT-PCR反应体系
(1)将所得cDNA用Power 2×SYBR Real-Time PCR Premixture试剂盒进行RealTime PCR，反应体系为20μL，体系见表7；
表7 qRT-PCR反应体系
(2)反应条件为：95℃2min，40×(95℃15s，60℃40s)，95℃15s，60℃1min；循环结束后进行溶解曲线检测；
(3)数据以2-ΔΔCt法进行计算；
(4)各基因qRT-PCR上下游引物序列见表8：
表8 qRT-PCR上下游引物
2.4Western blot检测CREB1及MRP1蛋白表达水平
2.4.1肺癌A549/DDP细胞全蛋白提取
(1)弃原瓶内培养基，用5mL PBS轻轻洗涤细胞2遍；
(2)加入1mL胰酶，镜下观察，待细胞形态发生改变；
(3)加入5mL培养基终止消化，反复轻微吹打细胞，吹下所有贴壁细胞；
(4)移至离心管中，1000g离心5min，弃上清；
(5)1mL PBS悬浮细胞，移至1.5Ep管中，5000g离心2min，弃上清；
(6)加300μL蛋白裂解液，置于4℃摇床上30min；
(7)12000g离心20min，取上清，-20℃保存。
2.4.2蛋白质变性
蛋白样品与上样缓冲液按4:1比例混匀，沸水浴加热5min～10min，待其将至室温，-20℃保存或继续实验。
2.4.3SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
(1)组合胶板；
(2)按表9组分配制分离胶：
表9分离胶配方
(3)将分离胶注入两层玻璃板中，加入适当位置后，滑动枪头加入1mL异丙醇，待胶凝后，倒出异丙醇，将水吸净；
(4)按表10组分配制浓缩胶，将浓缩胶注入两层玻璃板中，至液面溢出，插入梳子。
表10浓缩胶配方
(5)待胶凝后，拔出梳子，与电泳槽组装，加入电泳液；
(6)点样，每孔加入30μL样品，Maker上样量为10μL；
(7)恒流100mA，点击开始按钮，溴酚蓝到达胶的底端处附近停止电泳。
2.4.4转膜
(1)取出胶板，将胶置于转膜液中浸泡；
(2)夹子黑面冲下，按海绵、滤纸、胶、PVDF膜、滤纸、海绵的顺序放好，夹紧夹子；
(3)放到转膜槽中，黑对黑放好，放入冰壶，倒入转膜液；
(4)组装转膜槽，恒压100V进行转膜。
2.4.5封闭
(1)丽春红染膜5min；
(2)清水轻轻冲洗丽春红；
(3)根据maker指示大小剪膜
(4)加入5％脱脂奶粉(封闭液)，常温摇床孵育1h。
2.4.6Western杂交
2.4.6.1一抗孵育
(1)根据说明书，稀释抗体；
(2)一抗孵育，置于4℃摇床摇过夜；
(3)回收一抗，PBST洗膜10min，三次。
2.4.6.2二抗孵育(避光操作)
(1)根据说明书，稀释抗体；
(2)二抗孵育，置于4℃摇床1h；
(3)回收二抗，PBST洗膜10min，三次。
2.4.6蛋白上机检测
使用Odyssey双红外激光成像系统检测蛋白条带变化并分析结果。
2.5流式细胞术检测Rho123外排：
(1)收集细胞至1.5EP管中，用预冷的1mL PBS洗涤细胞沉淀两次，2 000r/min离心10min；
(2)避光将1μL Rho-123加入到500μL 37℃预热的1×Incubation Buffer配成Rho-123工作液；
(3)吸取其中500μLRho-123工作液重悬细胞，于37℃、5％CO2培养箱中孵育30min；
(4)2000r/min离心10min后收集细胞，再用500μL1×Incubation Buffer重悬清洗细胞2次；
(5)最后再用500μL1×Incubation Buffer重悬细胞，400目筛网过滤后，流式细胞仪检测。结果显示，敲低CREB1的表达能下调MRP1基因的表达，且肺癌A549/DDP细胞Rho123外排减弱，药物潴留量增加，逆转肺癌细胞MDR。其可为逆转肿瘤细胞的多药耐药性方面提供新思路。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书其等效物界定。
核苷酸和/或氨基酸序列表
核苷酸和/或氨基酸序列表
<110>齐齐哈尔大学
<120>一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1
<160>9
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
GCCGGGTACT ACCATTCTAC A 21
<210>2
<211>64
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
GATCCGCCGG GTACTACCAT TCTACACGAA TGTAGAATGG TAGTACCCGG CTTTTTTGAA
TTCA 64
<210>3
<211>64
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
GCGGCCCATG ATGGTAAGAT GTGCTTACAT CTTACCATCA TGGGCCGAAA AAACTTAAGT
TCGA 64
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
CCAGGGAGGA GCAATACAGC 20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
TGTCCATCAG TGGTCTGTGC 20
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
GGGGTCCTCA TTATCTTCTG G 21
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
TGGTCTCAGG GTAGGGGTTA G 21
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
AGCGAGCATC CCCCAAAGTT 20
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
GGGCACGAAG GCTCATCATT 20

Claims (3)

1.一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1，其特征在于：一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1，首先复苏和培养A549/DDP细胞，接着根据NCBI中人NM号为134442.4的CREB1基因()的mRNA序列，按照RNAi设计原则，设计最优靶向CREB1的干扰片段：GCCGGGTACTACCATTCTACA；分析质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP的多克隆位点，在5’端加上BamHⅠ酶切位点，3’端加上HindⅢ酶切位点，经NCBI Blast比对同源性确定与其他基因无同源性，送至上海生工合成，命名为pFYJN-1；在上述序列的基础上，加上序列为CGAA的LOOP环，反向互补序列及酶切位点，组成完整的RNAi干扰序列，以合成上下游引物的方式分别合成，用T4DNA连接酶连接酶切载体与目的片段，连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中；挑取单个菌落并进行富集培养，提取重组载体质粒，构建靶向CREB1的shRNA干扰表达载体，待细胞生长至汇合度为60％左右时开始转染A549/DDP细胞，通过qRT-PCR检测RNAi后的CREB1和MRP1基因mRNA的表达水平，通过Western blot检测RNAi后的CREB1和MRP1蛋白表达水平，使用Odyssey双红外激光成像系统检测蛋白条带变化并分析结果；流式细胞术检测细胞Rho123外排，结果显示，敲低CREB1的表达能下调MRP1基因的表达，且肺癌A549/DDP细胞Rho123外排减弱，药物潴留量增加，逆转肺癌细胞MDR。
2.根据权利要求1所述的一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1，其特征在于：所述的复苏和培养A549/DDP细胞的步骤为：细胞复苏：液氮中取出冻存细胞，在37℃水浴锅内摇晃，至其全部融化；缓慢滴入含5mL 1640培养基的离心管中，1000g离心5min，弃上清；用5mL 1640完全培养基悬浮细胞沉淀，移至细胞瓶，37℃、5％CO2培养箱内培养细胞；细胞传代：弃原瓶内培养基，用5mL PBS轻轻洗涤细胞2遍；加入1mL0.25％胰酶消化细胞，镜下观察，待60％的贴壁细胞皱缩成亮点形态，加入完全培养基终止消化并反复吹打使其从壁上脱落；向细胞悬液中加入10mL完全培养基吹匀后，分别取出5mL加入两个新瓶中，37℃、5％CO2培养箱内培养细胞；A549/DDP细胞复苏和培养结果：细胞为贴壁生长，A549/DDP呈多边形，细胞生长状态良好。
3.根据权利要求1所述的一种通过RNAi沉默CREB1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pFYJN-1，其特征在于：所述的构建靶向CREB1的shRNA干扰表达载体的步骤为：设计shCREB1：根据NCBI中人CREB1基因的mRNA序列，按照RNAi设计原则，设计最优靶向CREB1的干扰片段：GCCGGGTACTACCATTCTACA；分析质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP的多克隆位点，在5’端加上BamHⅠ酶切位点，3’端加上HindⅢ酶切位点，经NCBI Blast比对同源性确定与其他基因无同源性，送至上海生工合成，命名为pFYJN-1；在上述序列的基础上，加上序列为CGAA的LOOP环，反向互补序列及酶切位点，组成完整的RNAi干扰序列，以合成上下游引物的方式分别合成的序列；用HindⅢ、BamHⅠ双酶切pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP载体，琼脂糖凝胶电泳检测载体是否切开，使用T4DNA连接酶，按照连接体系进行连接；双酶切回收后的线性与退火后的shCREB1片段的摩尔比为1：5，按照表5体系进行连接；合成上下游序列退火反应，反应体系为：上游引物，2μL；下游引物，2μL；10×PCR buffer，5μL；dd H2O，41uL；用T4DNA连接酶连接酶切载体与目的片段，连接体系为：PCR产物，1.0μL；10×buffer，1.0μL；回收的双切载体，2.0μL；dd H2O，5.0μL；T4DNA连接酶，1.0μL；连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中；挑取单个菌落并进行富集培养，提取重组载体质粒；双酶切验证及送至上海生工生物技术服务有限公司测序鉴定测序验证。
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