CN112458089B - 一种长链非编码基因及其相关生物材料与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种长链非编码基因，其为MIR4435‑2HG基因敲除第1090‑1149位后的核酸分子或MIR4435‑2HG基因敲除第1235‑1294位后的核酸分子。将本发明所述的长链非编码基因导入巨噬细胞的实验证明，与表达MIR4435‑2HG基因的巨噬细胞相比，表达本发明所述的长链非编码基因的巨噬细胞显著延缓了细胞凋亡，有望在输血及制备治疗癌症的药物中进行应用。

Description

一种长链非编码基因及其相关生物材料与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中一种长链非编码基因及其相关生物材料与应用。

背景技术

血小板浓缩物(PC)在临床输血治疗中具有重要作用，在大量失血和化疗、放疗等处理后造成的血小板减少症患者的治疗过程中，均需要进行血小板输注。由于血小板难于体外保存及开展功能实验，人血小板源细胞外囊泡(P-EVs)的发现为开展血小板功能的研究提供了解决思路。血小板浓缩物在制备和储存的过程会生成大量P-EVs，P-EVs作为细胞间信息传递的重要媒介，其内携带大量血小板中的遗传信息，其中长链非编码RNA(LncRNA)在细胞的分化、增殖以及凋亡等生理过程中具有重要调节作用，体外P-EVs的输注对机体免疫的调节的潜在作用尚未得到阐明。临床在输血治疗中出现了大量与输血相关损伤并被认为与P-EVs相关，寻找其潜在的作用机制对指导输血治疗十分必要。

MIR4435-2HG在一些肿瘤细胞(如肺癌和胃癌)中异常过度表达，并参与肿瘤的进展。BCL2L11是BCL2家族中促凋亡的成员。BCL2L11位于线粒体外膜，通过转运凋亡诱导因子，诱导线粒体去极化，从而触发线粒体凋亡途径。BCL2L11调节免疫反应，其过早激活可阻碍细胞毒性T细胞的成熟，导致慢性炎症、肿瘤进展等病理生理事件的发生。MIR4435-2HG可以上调巨噬细胞中mRNA BCL2L11的表达，从而促进巨噬细胞的凋亡从而发挥免疫抑制进而在癌症中促进疾病的进展。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是如何延缓细胞凋亡的能力。

为了解决以上技术问题，本发明首先提供了一种长链非编码基因，其为MIR4435-2HG基因敲除其与EIF3G的结合位点后的的核酸分子；所述MIR4435-2HG基因的核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述与EIF3G的结合位点为序列表的序列3第1090-1149位核苷酸或序列表的序列3第1235-1294位的核苷酸。

上述长链非编码基因中，所述MIR4435-2HG基因(ENST00000661655)是来源于人血小板源细胞外囊泡的长链非编码基因，其核苷酸序列如序列表中的序列3所示，由1496个核苷酸组成。

上述长链非编码基因中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述长链非编码基因中，所述核酸分子为如下b1)-b4)任一所示的基因：

b1)编码链的编码序列是序列表中序列3敲除第1090-1149位后的核苷酸的cDNA分子或DNA分子；

b2)编码链的核苷酸是序列表中序列3敲除第1090-1149位后的cDNA分子或DNA分子；

b3)编码链的编码序列是序列表中序列3敲除第1235-1294位后的核苷酸的cDNA分子或DNA分子；

b4)编码链的核苷酸是序列表中序列3敲除第1235-1294位后的cDNA分子或DNA分子。

与所述长链非编码基因相关的生物材料也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的与所述长链非编码基因相关的生物材料，为下述B1)至B5)中的任一种：

B1)含有所述长链非编码基因的表达盒；

B2)含有所述长链非编码基因的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；

B3)含有所述长链非编码基因的重组微生物、或含有B1)所述表达盒的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物；

B4)含有所述长链非编码基因的转基因动物细胞系、或含有B1)所述表达盒的转基因动物细胞系、或含有B2)所述重组载体的转基因动物细胞系。

上述生物材料中，B1)所述的含有所述长链非编码基因的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达所述长链非编码基因的核酸分子，该核酸分子不但可包括启动长链非编码基因转录的启动子，还可包括终止长链非编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。

可用现有的表达载体构建含有所述长链非编码基因表达盒的重组表达载体，例如pcDNA3.1等。

上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。

本发明还提供一种RNA，为X1或X2:

X1、将序列3敲除第1090-1149位后的核苷酸中的T均替换为U得到的序列所示的RNA分子；

X2、将序列3敲除第1235-1294位后的核苷酸中的T均替换为U得到的序列所示的RNA分子。

上述的长链非编码基因、或上述生物材料、或上述RNA的下列Y1-Y4中任一种或多种中的应用也属于本发明的保护范围：

Y1、在延缓细胞凋亡上的应用；

Y2、在制备输血用药品中的应用；

Y3、在制备延缓细胞凋亡产品上的应用；

Y4、在制备治疗癌症的药品中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了药品，其作用为延缓细胞凋亡/促进输血/治疗癌症中的任一种或多种。

本发明所提供的药品含有所述的长链非编码基因或/和所述的长链非编码基因相关的生物材料或/和所述的RNA。

上述药品的活性成分可为所述的长链非编码基因或/和所述的长链非编码基因相关的生物材料，上述药品的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分，上述药品的其他活性成分本领域技术人员可根据延缓细胞凋亡/促进输血/治疗癌症的效果确定。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育凋亡延缓的细胞的方法。

本发明所提供的培育凋亡延缓的细胞，包括干扰目的细胞中序列3第1090-1149位和/或第1235-1294位所示的核苷酸序列，得到凋亡延缓细胞；所述凋亡延缓细胞的细胞凋亡速度比所述目的细胞的细胞凋亡速度慢。

本发明所提供的培育凋亡延缓的细胞，具体可包括将上述长链非编码基因导入目的细胞中，得到凋亡延缓细胞；所述凋亡延缓细胞的细胞凋亡速度比所述目的细胞的细胞凋亡速度慢。

上述培育凋亡延缓的细胞的方法中，其中所述的长链非编码基因可先进行如下修饰，再导入目的细胞中，以达到更好的表达效果：

1)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在微生物或动物中已知的有效的序列进行修饰；

2)与各种微生物或动物表达的启动子连接，以利于其在微生物或动物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；

3)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；任何已知在微生物或动物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

4)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

所述的长链非编码基因可通过使用Ti质粒，病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入细胞。

将本发明所述的长链非编码基因(MIR4435-2HG基因敲除第1090-1149或1235-1294位后的核酸分子)导入巨噬细胞的实验证明，与表达MIR4435-2HG基因的巨噬细胞，表达本发明所述的长链非编码基因的巨噬细胞显著延缓了细胞凋亡，有望在癌症治疗以及输血中进行应用。

附图说明

图1为本发明实施例1中5’race第二轮PCR反应产物的电泳图。其中，M为maker，1为5’race后的电泳结果。

图2为本发明实施例1中3’race第二轮PCR反应产物的电泳图。其中，M为maker，1为3’race后的电泳结果。

图3为本发明实施例1中EIF3G蛋白分别与MIR4435-2HG和BCL2L11结合能力预测结果。

图4为本发明实施例1中长链非编码基因MIR4435-2HG与蛋白EIF3G结合区域预测结果。

图5为本发明实施例1中MIR4435-2HG全长质粒的图谱。

图6为本发明实施例1中MIR4435-2HG全长、敲除第1090-1149位后的MIR4435-2HG、敲除第1235-1294位后的MIR4435-2HG功能研究结果图。其中，图6的A为RNA pull-down实验检测MIR4435-2HG敲除片段前后结合EIF3G蛋白能力；图6的B为Q-PCR检测MIR4435-2HG敲除片段前后对巨噬细胞内mRNA BCL2L11表达水平；图6的C为Western-blot检测MIR4435-2HG敲除片段前后对巨噬细胞内蛋白BCL2L11表达水平；图6的D为流式检测MIR4435-2HG敲除片段前后对巨噬细胞凋亡水平的影响。图中，MIR4435-2HG全长标为MIR4435-2HG，敲除第1090-1149位后的MIR4435-2HG标为Del-1，敲除第1235-1294位后的MIR4435-2HG标为Del-2，空载体对照标为Vector，空白对照标为Blank，negative control标为NC，没有进行任何分离操作的样品标为Input。所示数据为平均值±标准差，重复数为3，**表示显著性分析结果为P≤0.01。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1、临床样本：

以下实施例中的机采血为从健康人群获得的当日机采血经采血对象知情同意，公众按照国家生物安全的有关规定可从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

2、质粒和细胞：

以下实施例中的pcDNA3.1为invitrogen公司产品。

以下实施例中的THP-1(FH0112)为上海富衡生物科技有限公司产品。

3、蛋白和引物

以下实施例中所用的蛋白EIF3G(A4240)为ABclonal公司产品。

以下实施例中所用的蛋白Actin(ab8226)为Abcam公司产品。

以下实施例中所用的引物均由擎科生物合成。

4、试剂：

以下实施例中的Exosupur外泌体纯化试剂盒(Echo910A)为恩泽康泰公司产品。

以下实施例中的SMARTer RACE 5’Kit(634858)为Clontech公司产品。

以下实施例中的转染试剂X-treme GENETM HP DNA transfection reagent(6366244001)为Roche公司产品。

以下实施例中的生物素探针具体为脱硫生物素化的胞苷二磷酸标记(20163)，为ThermoScientific公司产品。

以下实施例中的免疫磁珠(20164)为ThermoScientific公司产品。

以下实施例中的PMA(P1585-1MG)为SIGMA公司产品。

以下实施例中的RPMI1640培养基为Gibico公司产品。

以下实施例中的FITC Annexin V凋亡检测试剂盒(BD Biosciences)(556547)为BD Biosciences公司产品。

下述实施例中的定量试验，如无特别说明，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的所有数据均均以平均值±标准差表示，采用统计软件SPSS v17.0进行分析，差异性检验均采用双侧检验，以p<0.05为差异具有统计学意义。成组设计资料比较采用t检验进行显著性分析；多组之间比较采用单因素或多因素方差分析；若组件差异有统计学意义，则采用Dunnett’s T检验进一步比较两两之间的差异。

实施例1

1、P-EV的提取纯化

采用恩泽康泰的Exosupur外泌体纯化试剂盒。

当天获得的机采血小板在4℃下1500g离心20min，去除血液中的细胞，取上清，4℃下3000g离心15min，收集上清，得到去血小板血浆。将去血小板血浆进行0.22um微孔滤膜过滤，具体步骤如下：

柱平衡：实验前先将排阻柱室温放置30min以上，使柱子温度充分平衡到室温。将废液收集管放置于排阻柱下方，取下柱子顶盖和底盖，回收柱子上的封柱液，并从顶部加入不少于20mL的PBS冲洗柱子。

取下柱子底盖，用移液器吸去上筛板上面的PBS，加入不超过1mL的样品(去血小板血浆)，等样品全部进入筛板后，再添加洗脱液(PBS)进行洗脱，防止样品被稀释影响实验结果。待样品全部进入筛板，底盖出口无液体流出后，开始加洗脱液，从第一滴流出液开始计算，每500μl流出液记为1个馏分。

P-EVs的收集：前3个馏分为不含外泌体组分的空隙体积，不收集；空隙体积之后立即开始收集5个外泌体馏分，每个馏分500μl。使用100kD超滤管，4000g离心浓缩，得到收集的P-EVs。

2、5’RACE

采用SMARTer RACE 5’Kit，具体步骤如下：

1)提取步骤1收集的P-EVs的总RNA作为RNA样品。

2)在灭菌的DEPC处理Eppondef管中分别加入:

RNA样品 3μl

10μl 10X Random Primer Mix(20μM) 1μl

SMARTer II A Oligonucleotide 1μl。

3)70℃3分钟，冰浴冷却2分钟。在上管中，根据下表依次序分别加入：

4)混匀，离心后放于42℃90分钟。

5)于70℃加热10分钟，灭活反转录酶。

6)加90μl Tricine-EDTA Buffe稀释反转录产物，获得稀释后的反转录产物。

5’race实验步骤

(1)引物设计

5’RACE引物(Long primer、Short primer、JKLNC51和JKLNC52)：

Long primer：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’；

Short primer：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’；

JKLNC51：5’-TACTCAAGTCCTGAGGTTTCTTGCAAG-3’；

JKLNC52：5’-ACCTTTTCTTCTAGCTTTCAGAGCCCTT-3’。

(2)巢式PCR反应：

第一轮PCR反应的反应体系见表1:

表1 5’race第一轮PCR反应的反应体系

TAQ plus DNA Polymerase(5U/μl)	1μl
		10×TAQ plus PCR Buffer	5μl
dNTP Mixture(各2.5mM)	4μl
		逆转录产物(步骤6)中稀释后的反转录产物)	1μl
10X UPM primer	2μl
		JKLNC51(10pM)	2μl
灭菌蒸馏水	up to 50μl

PCR反应条件：95℃5分钟；95℃40秒；60℃30秒；72℃1分30秒；35个循环；72℃10分钟。

第二轮PCR反应的反应体系见表2:

表2 5’race第二轮PCR反应的反应体系

TAQ plus DNA Polymerase(5U/μl)	1μl
		10×TAQ plus PCR Buffer	5μl
dNTP Mixture(各2.5mM)	4μl
		第一轮PCR产物	1μl
Short primer	2μl
		JKLNC52(10pM)	2μl
灭菌蒸馏水	up to 50μl

PCR反应条件：95℃5分钟；95℃40秒；60℃30秒；72℃1分30秒；20个循环；72℃10分钟。

(3)结果：PCR电泳图见图1，测序结果见序列表的序列1。

3、3’race

采用SMARTer RACE 3’Kit，具体步骤如下：

1)提取步骤1收集的P-EVs的总RNA作为RNA样品，添加polyA，具体为在灭菌的DEPC处理0.2ml Eppondef管中分别加入:

RNA样品 10μl

10X Poly(A)聚合酶反应缓冲液 2μl

10mM ATP 1μl

加DEPC处理的水至20μl。

37℃反应15分钟，得到添加polyA的RNA样品。

2)cDNA第一条链的合成

在灭菌的DEPC处理Eppondef管中分别加入：

添加polyA的RNA样品 5μl

3RACEP1(0.5μg/μl) 1μl。

70℃5分钟，冰浴冷却5分钟。

3)在上管中，根据依次序分别加入：

加水至20μl。

4)混匀，离心后放于42℃60分钟。

5)于95℃加热5分钟，灭活反转录酶，得到加尾产物。

3’race实验步骤

(1)引物设计

3’RACE引物(接头引物和特异引物)：

接头引物(3RACEP1和3RACEP2)

3RACEP1：

5’-CGAAAGCGACAAGGCCGTGATCCCGAAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’(字母V代表A/C/G中的任一种核苷酸，字母N代表A/C/G中的任一种核苷酸)；

3RACEP2：5’-CGAAAGCGACAAGGCCGTGATCCCGAAAGC-3’。

特异引物(JKLNC31和JKLNC32)

JKLNC31：5’-ATAAACCCATTTGTCCACAAAGTCAAG-3’；

JKLNC32：5’-GAGGCCCTTGCCATGGGGCTTTTTAG-3’。

(2)巢式PCR反应：

第一轮PCR反应的反应体系见表3:

表3 3’race第一轮PCR反应的反应体系

PCR反应条件：95℃5分钟；95℃40秒；60℃30秒；72℃1分30秒；35个循环；72℃10分钟。

第二轮PCR反应的反应体系见表4:

表4 3’race第二轮PCR反应的反应体系

TAQ plus DNA Polymerase(5U/μl)	1μl
		10×TAQ plus PCR Buffer	5μl
dNTP Mixture(各2.5mM)	4μl
		第一轮PCR产物	1μl
3RACEP2(10pM)	2μl
		JKLNC31(10pM)	2μl
灭菌蒸馏水	up to 50μl

PCR反应条件：95℃5分钟；95℃40秒；60℃30秒；72℃1分30秒；20个循环；72℃10分钟。

(3)结果：PCR产物电泳结果见图2，测序结果见序列表的序列2。

2、生物信息预测

通过catRAPID(http://service.tartaglialab.com/page/catrapid_group)分析，具体结果见图3和图4，发现EIF3G连接MIR4435-2HG与BCL2L11，并确定MIR4435-2HG与EIF3G之间的结合位点为MIR4435-2HG(序列表的序列3)的第1090-1149位，以及第1235-1294位区域。

3、基因克隆载体的构建

1)以pcDNA3.1为出发载体，分别构建MIR4435-2HG全长质粒、MIR4435-2HG第1090-1149位区域敲出质粒(Del-1质粒)，以及MIR4435-2HG第1235-1294位区域敲出质粒(Del-2质粒)，构建由北京米伽有限公司完成。

2)阳性克隆的筛选

3)阳性克隆的挑选及阳性质粒的提取

随机挑选在LB抗性平板长出的单菌落，将其接种于5mL含100μg/mL氨苄青霉素LB液体培养基中，在37℃、225rpm匀速摇动下，扩增培养12-16h。

4)菌液测序

对步骤3)获得的阳性克隆质粒进行测序，测序结果表明：

MIR4435-2HG全长质粒(质粒图谱见图5)为用MIR4435-2HG全长DNA(编码链的核苷酸序列为序列表的序列3)替换pcDNA3.1的限制性核酸内切酶BamHI和XhoI识别位点间的片段(包括BamHI的识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pcDNA3.1的其它序列不变，得到MIR4435-2HG的重组表达载体。

Del-1质粒为用MIR4435-2HG敲出第1090-1149位区域的DNA(编码链的核苷酸序列为序列表的序列3缺失第1090-1149位得到的序列)替换pcDNA3.1的限制性核酸内切酶BamHI和XhoI识别位点间的片段(包括BamHI的识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pcDNA3.1的其它序列不变，得到MIR4435-2HG敲出第1090-1149位的重组表达载体。序列3缺失的第1090-1149位序列如下：

5’-AGATAAACCCATTTGTCCACAAAGTCAAGGAGTCAGGCAGAGGCCCTTGCCATGGGGCTT-3’。

Del-2质粒为用MIR4435-2HG敲出第1235-1294位区域的DNA(编码链的核苷酸序列为序列表的序列3缺失第1235-1294位得到的序列)替换pcDNA3.1的限制性核酸内切酶BamHI和XhoI识别位点间的片段(包括BamHI的识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pcDNA3.1的其它序列不变，得到MIR4435-2HG敲出第1235-1294位的重组表达载体。序列3缺失的第1235-1294位序列如下：

5’-AGCTTAGAGACCAGGCCAGAGTCCACTGCAGTAGCCCAGTCAAGAGAGGATGGTGACTTG-3’。

5)用小量质粒DNA快速提取法提步骤4)中3种质粒，具体方法为：取质粒培养菌液3mL，15,000rpm离心30sec后，弃上清，加入200μl悬浮液(北京鼎国生物技术公司)和10μlRNase A(北京鼎国生物技术公司)(10mg/mL)彻底悬浮，再用300μL裂解液(北京鼎国生物技术公司)和450μl变性剂(北京鼎国生物技术公司)处理，12000rpm离心5min后，移上清至吸附柱(北京鼎国生物技术公司)中，静置2min，8000rpm离心30sec，再用洗涤液(北京鼎国生物技术公司)洗涤吸附柱后，12000rpm离心1min甩干剩余液体，将吸附柱置于新的离心管中，加入40μl 50℃预热的去离子水，静置1min，12,000rpm离心1min，沉淀即为质粒DNA，3种质粒分别提取得到MIR4435-2HG全长质粒DNA、Del-1质粒DNA、以及Del-2质粒DNA，-20℃保存备用。

4、体外反转录合成RNA

以MIR4435-2HG全长质粒DNA、Del-1质粒DNA、以及Del-2质粒DNA为模版，分别体外反转录合成3种目标RNA，由宝生物工程(大连)完成。

5、MIR4435-2HG功能研究

5.1转染实验

MIR4435-2HG全长质粒(标为MIR4435-2HG)、Del-1质粒(标为Del-1)、以及Del-2质粒(标为Del-2)，设置空白对照(标为Blank)和空载体对照(pcDNA3.1质粒，标为Vector)，利用转染试剂X-treme GENETM HP DNA transfection reagent(Roche)分别转染上述质粒进入巨噬细胞(150nM PMA诱导THP-124h获得)，24h后检测蛋白和基因表达，结果见图6的A和图6的C，发现Del-1质粒和Del-2质粒显著降低细胞凋亡相关蛋白(CASP3、PARP)以及细胞凋亡激活剂BCL2L11的表达。

检测CASP3、PARP、BCL2L11在蛋白质上的表达量采用western blot进行，采用Actin作为内参，所用一抗分别为CASP3抗体(ABclonal，A0215)、PARP抗体(CST，9532)、BCL2L11抗体(ABclonal，A19702)、Actin抗体(ABclonal，AC026)。

检测基因在RNA水平上的表达量采用定量PCR进行，所用引物为：

BCL2L11:

5’-TCCCTACAGACAGAGCCACA-3’；3’-AAAAGCGGGGATCTGGTAGC-5’。

内参为GAPDH(生工生物工程有限公司，B661104)。

5.2 RNA Pull-down实验

5.2.1生物素探针标记RNA

以MIR4435-2HG全长质粒DNA、Del-1质粒DNA、以及Del-2质粒DNA为3种待测的目标RNA，设置空白对照(Blank)和空载体对照(Vector)。

(1)目标RNA各5μl，分别放于200μl的PCR管中，每管可加1μl DMSO，混匀后置于PCR仪上，85℃，5min，然后立即置于冰上5min。

(2)按照生物素探针的使用说明配制探针标记的反应体系，之后放至PCR仪内，16℃，4h至过夜。

(3)加10μl 5M NaCl，2μl糖原，以及600μl预冷的100％乙醇，放于-20℃或-80℃沉淀，可沉淀过夜。

5.2.2 RNA抽提

(1)将步骤5.2.1沉淀过夜的RNA取出，4℃，最大转速离心30min，离心后可见管底的白色沉淀，即为RNA。

(2)小心移取上清，用1ml 70％乙醇洗涤，8000rpm离心10min，之后吸净管内液体，空气中晾干RNA，若乙醇未挥发完全，将影响下游实验效率。

(3)每管加20μl nuclease free-water溶解RNA，之后将RNA放于PCR仪中，95℃，5min使其变性，之后立即置于冰上，分别得到生物素标记的MIR4435-2HG全长RNA、生物素标记的Del-1 RNA、以及生物素标记的Del-2 RNA，备用。

5.2.3细胞裂解

(1)巨噬细胞(150nM PMA诱导THP-124h获得)弃去培养基，用预冷的PBS洗3次，吸去上清。

(2)每个大皿中加入200μl cell lysis buffer。

(3)用细胞刮刀刮下细胞，收集至EP管，液氮中三冻三融。

(4)离心，4℃，3000rpm，离心10min。

(5)转移上清至新的EP管中，置于冰上；可加200U/ml RNase Inhibitor。

(6)取10-20μl左右上清至新管中，作为实验input组。

5.2.4免疫磁珠(magnetic beads)预处理

(1)涡旋混匀磁珠(beads)。

(2)每管取400μl磁珠置于磁力架上，吸去上清。

(3)用800μl 1X binding&washing buffer，洗3次，吸去上清。

5.2.5 RNA与磁珠结合

(1)向步骤5.2.4的磁珠中加入400μl 2X binding&washing buffer。

(2)向上一步中分别加入20μl步骤5.2.3得到的生物素标记的3种RNA，再补380μlDEPC水，使其终体积为800μl。

(3)室温慢速旋转20min，使磁珠与每种生物素标记的RNA充分结合。

(4)将上一步的管子置于磁力架上，吸去上清。

(5)用800μl 1X binding&washing buffer(含RNase Inhibitor，1U/μl)，洗3次，吸去上清。

(6)用cell lysis buffer A洗一次磁珠，吸去上清。分别得到与MIR4435-2HG全长RNA结合的磁珠、与Del-1 RNA结合的磁珠、以及与Del-2 RNA结合的磁珠。

5.2.6 RNA与蛋白相互作用

(1)向步骤5.2.5已处理好的与MIR4435-2HG全长RNA结合的磁珠、与Del-1 RNA结合的磁珠、以及与Del-2 RNA结合的磁珠中每管加入500μl细胞裂解液(见步骤5.2.3)；同时向每管加入RNase Inhibitor，1U/μl。

(2)4℃慢速旋转2h，使磁珠与细胞裂解液充分结合

(3)磁力架上吸去上清，用400μl新鲜配制的cell lysis buffer A(+RNaseInhibitor+蛋白三联)，洗5次磁珠。

(4)吸去上清，用25μl预冷的0.1％SDS溶液重悬磁珠，加6.25μl的5X蛋白上样缓冲液，100℃金属浴煮10min之后立即置于冰上5min，再置于磁力架上吸取上清至新的EP管中，准备蛋白上样。

检测所用的蛋白为EIF3G，并将Actin作为内参。

上述RNA Pull-down实验的结果表明Del-2质粒表达的敲出了第1235-1294位区域的MIR4435-2HG与EIF3G蛋白的结合能力与MIR4435-2HG(MIR4435-2HG全长质粒表达)、敲出了第1090-1149位区域的MIR4435-2HG(Del-1质粒表达)相比，显著降低，具体见图6的A。

5.3流式细胞术检测细胞凋亡及极化

5.3.1质粒转染

(1)THP-1细胞添加PMA(25ng/ml)诱导24h获得巨噬细胞；

(2)更换无PMA的RPMI1640培养基培养24h；

(3)将2μg空载体(pcDNA3.1)，MIR4435-2HG全长质粒、Del-1质粒、Del-2质粒添加到4uX-tremeGENE^TM HP DNA转染试剂配制成转染复合物；

(4)室温孵育15min，转染到巨噬细胞中培养24h，得到转染空载体(pcDNA3.1)后的巨噬细胞，转染MIR4435-2HG全长质粒后的巨噬细胞、转染Del-1质粒后的巨噬细胞、转染Del-2质粒后的巨噬细胞；

(5)同时设置只添加转染试剂的阴性对照和空白对照。

5.3.2细胞凋亡检测

采用FITC Annexin V凋亡检测试剂盒(BD Biosciences)。

(1)用27ml的去离子水稀释3ml 10X的结合液至1x。

(2)收集步骤5.3.1中转染质粒24h后的巨噬细胞(1×10⁶个/次)，然后用冷的PBS洗涤，使用细胞刮刀收集细胞。

(3)用1ml 1X的结合液悬浮细胞，300x g离心10min，弃上清。

(4)用1ml 1X的结合液重悬细胞，使细胞密度达到1×10⁶个/ml。

(5)每管加入100μl细胞。

(6)再向管中加入5μl Annexin V-FITC。

(7)室温、避光，轻轻地混匀，10min。

(8)加入5μl PI，室温，避光，孵育5min。

(9)加入PBS至200μl，轻轻混匀后上机检测，检测结果见图6的D，流式细胞术结果显示，MIR4435-2HG上的蛋白EIF3G结合位点缺失后，细胞凋亡率显著降低，表明MIR4435-2HG的1090-1149以及1235-1294区域是细胞凋亡的关键。表明与MIR4435-2HG(MIR4435-2HG全长质粒表达)相比，敲出了第1090-1149位区域的MIR4435-2HG(Del-1质粒表达)，敲出了第1235-1294位区域的MIR4435-2HG(Del-2质粒表达)显著降低细胞凋亡。

综上所述，敲出了序列3第1090-1149位区域的MIR4435-2HG基因，以及敲出了序列3第1235-1294位区域的MIR4435-2HG基因与蛋白EIF3G结合能力下降，促进凋亡的能力下降。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种长链非编码基因及其相关生物材料与应用

<130> GNCSY202719

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 438

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagtacatg ggggtgtgta 60

catcattggg aatggaggga aataaatgac tggatggtcg ctgcttttta agtttcaaat 120

tgacattcca gacaagcggt gcctgagccc gtgcctgtct tcagatcttc acagcacagt 180

tcctgggaag gtggagccac cagcctctcc ttgacaagca aagtggatca gcaaaggctg 240

cagtcaccag catcttttcc aaccttaatg aactgtatcc tcaaaagaac actatcagac 300

tggctctgcc gacttccagt tctggaacaa gatggttaaa ctcatttttc cctgctctgc 360

tcctctaaat acaactaagt accttggaaa ctattcagca gacaatgata aagggctctg 420

aaagctagaa gaaaaggt 438

<210> 2

<211> 359

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaggcccttg ccatggggct ttttaggata aagcaacaag cctggacttt gctctacaac 60

agggttttgc atagggagta gtatgaccag atccctcaag aaagaaagct tagagaccag 120

gccagagtcc actgcagtag cccagtcaag agaggatggt gacttggact tgtagtagag 180

ccagttagaa tgaaagaaat tgacacattc agaaatggtt ttagagatag agtcaaactg 240

gacctgataa agaactagag aagcggagtg aggataaaga gaagagccat gactgactcg 300

gaagattttg tcttgaaaaa cttgagaact caagacagag tgaaataaaa tcacatgtg 359

<210> 3

<211> 1496

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtgtgtaca tcattgggaa tggagggaaa taaatgactg gatggtcgct gctttttaag 60

tttcaaattg acattccaga caagcggtgc ctgagcccgt gcctgtcttc agatcttcac 120

agcacagttc ctgggaaggt ggagccacca gcctctccct gacaagcaaa gtggatcagc 180

aaaggctgca gtcaccagca tcttttccaa ccttaatgaa ctgtatcctc aaaagaacac 240

tatcagactg gctctgccga cttccagttc tggaacaaga tggttaaact catttttccc 300

tgctctgctc ctctaaatac aactaagtac cttggaaact attcagcaga caatgataaa 360

gggctctgaa agctagaaga aaaggtgtac ttgcaagaaa cctcaggact tgagtaacag 420

caacatggtt cttctgagct atgaaggggc ccagatttaa gggctatttt tgacacccta 480

aatgtgctga gacaagtcat taaggtggtc ctgccaggac acagccatct aaagcagcaa 540

tctgcttctt gccagaaaat ctcgtgcctc tgcagagcct tttccagaat gaaccacacc 600

atgctgagga aaggagaaag agactaccta ctgcatttct gtcactcgct gaaaaggaca 660

ctctgtcaga aaatcttcta gcaaacttca aagggcaaaa tcaccccttg ttactgataa 720

agcccagaga gcttcagcag ctaacattcc ctggacaggg cacagcaagg atttgaacct 780

aggtcagtct ggccagaaca cccacaagct ttccttaact cagtgtgcta tctccccacg 840

actaggtcac tactgcttta taatcacctt tgtagccacc agtggatttt gctcatcagt 900

atttttcagg caattgatac tttagatatt cagctgcaag acgtatgcag ttttcattga 960

catcttttgg agaaactgac aaacctggac ttgacttaat gcctttggaa ccttccaaga 1020

tgttatataa ctctagatag aaggctgggc ctccatgatg tcaggaatgt tgcattctta 1080

tttccccata gataaaccca tttgtccaca aagtcaagga gtcaggcaga ggcccttgcc 1140

atggggcttt ttaggataaa gcaacaagcc tggactttgc tctacaacag ggttttgcat 1200

agggagtrgt atgaccagat ccctcaagaa agaaagctta gagaccaggc cagagtccac 1260

tgcagtagcc cagtcaagag aggatggtga cttggacttg tagtagagcc agttagaatg 1320

aaagaaattg acacattcag aaatggtttt agagatagag tcaaactgga cctgataaag 1380

aactagagaa gcggagtgag gataaagaga agagccatga ctgactcgga agattttgtc 1440

ttgaaaaact tgagaactca agacagagtg aaataaaatc acatgtggga aaaatc 1496

Claims (7)

1.长链非编码基因在下列任一种或多种中的应用：

Y1、在非治疗目的的延缓细胞凋亡上的应用；

Y2、在制备延缓细胞凋亡产品上的应用；

Y3、在制备治疗癌症的药品中的应用；

所述长链非编码基因为MIR4435-2HG基因敲除其与EIF3G的结合位点后的的核酸分子；所述MIR4435-2HG基因的核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述与EIF3G的结合位点为序列表序列3第1090-1149位的核苷酸或序列表序列3第1235-1294位的核苷酸；

所述细胞为巨噬细胞。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述核酸分子为如下b1）-b4）任一所示的基因：

b1）编码链的编码序列是序列表中序列3敲除了第1090-1149位的核苷酸的cDNA分子或DNA分子；

b2）编码链的核苷酸是序列表中序列3敲除了第1090-1149位的cDNA分子或DNA分子；

b3）编码链的编码序列是序列表中序列3敲除了第1235-1294位的核苷酸的cDNA分子或DNA分子；

b4）编码链的核苷酸是序列表中序列3敲除了第1235-1294位的cDNA分子或DNA分子。

3.与权利要求1或2中所述的长链非编码基因相关的生物材料的应用，其特征在于，所述生物材料为下述B1）至B5）中的任一种：

B1）含有权利要求1或2中所述的长链非编码基因的表达盒；

B2）含有权利要求1或2中所述的长链非编码基因的重组载体、或含有B1）所述表达盒的重组载体；

B3）含有权利要求1或2中所述的长链非编码基因的重组微生物、或含有B1）所述表达盒的重组微生物、或含有B2）所述重组载体的重组微生物；

B4）含有权利要求1或2中所述的长链非编码基因的转基因动物细胞系、或含有B1）所述表达盒的转基因动物细胞系、或含有B2）所述重组载体的转基因动物细胞系；

所述应用为下列任一种或多种：

Y1、在非治疗目的的延缓细胞凋亡上的应用；

Y2、在制备延缓细胞凋亡产品上的应用；

Y3、在制备治疗癌症的药品中的应用；

所述细胞为巨噬细胞。

4.RNA的应用，其特征在于，所述RNA，为X1或X2:

X1、将序列3敲除第1090-1149位后的核苷酸中的T均替换为U得到的序列所示的RNA分子；

X2、将序列3敲除第1235-1294位后的核苷酸中的T均替换为U得到的序列所示的RNA分子；

所述应用为所述应用为下列任一种或多种：

Y1、在非治疗目的的延缓细胞凋亡上的应用；

Y2、在制备输血用药品中的应用；

Y3、在制备治疗癌症的药品中的应用；

所述细胞为巨噬细胞。

5.药品，其特征在于，含有权利要求1或2中所述的长链非编码基因或/和权利要求3中所述的生物材料或/和权利要求4中所述的RNA。

6.一种培育凋亡延缓的细胞的方法，其特征在于，包括干扰目的细胞中序列3第1090-1149位和/或第1235-1294位所示的核苷酸序列，得到凋亡延缓细胞；所述凋亡延缓细胞的细胞凋亡速度比所述目的细胞的细胞凋亡速度慢；所述细胞为巨噬细胞，所述方法为非治疗目的的方法。

7.一种培育凋亡延缓的细胞的方法，其特征在于，包括将权利要求1或2中所述的长链非编码基因导入目的细胞中，得到凋亡延缓细胞；所述凋亡延缓细胞的细胞凋亡速度比所述目的细胞的细胞凋亡速度慢；所述细胞为巨噬细胞，所述方法为非治疗目的的方法。

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