CN112680511B

CN112680511B - Atf5在筛选用于治疗线粒体基因3243位点突变相关疾病的药物中的用途

Info

Publication number: CN112680511B
Application number: CN202110103589.8A
Authority: CN
Inventors: 王从容; 孙毅; 张宜男; 韦跃华; 李凤雯; 姜之歆
Original assignee: Shanghai Fourth People's Hospital
Current assignee: Shanghai Ai Porcon Biological Technology Co ltd
Priority date: 2021-01-26
Filing date: 2021-01-26
Publication date: 2022-09-09
Anticipated expiration: 2041-01-26
Also published as: CN112680511A

Abstract

ATF5作为药物靶点在筛选用于治疗线粒体m.3243A>G突变相关疾病的药物中的用途。本发明还提供了靶向ATF5的抑制剂在制备用于治疗线粒体m.3243A>G突变相关疾病的药物中的用途。通过实验发现，高突变细胞的线粒体形态和功能均出现损伤。高突变激活了ATF5依赖的线粒体未折叠蛋白反应、抑制了Wnt/β‑catenin信号通路，造成了干细胞成骨能力的减退。敲低ATF5后，可恢复GSK3B和WNT7B这2个Wnt通路上关键因子的表达，最终恢复了高突变尿液干细胞的成骨能力。

Description

ATF5在筛选用于治疗线粒体基因3243位点突变相关疾病的药物中的用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及线粒体未折叠蛋白反应中的转录因子ATF5，具体来说是ATF5作为药物靶点在筛选用于治疗线粒体m.3243A>G突变相关疾病的药物中的用途。

背景技术

线粒体DNA3243A>G突变(以下简称mt.3243A>G突变)是最常见的一种单基因突变糖尿病，该疾病是由于编码线粒体亮氨酸tRNA基因——tRNALeu(UUR)发生突变、即线粒体DNA第3243位核苷酸序位发生A→G突变所致。

mt.3243A>G突变容易累及ATP阈值高的组织，主要临床特点表现为：40岁以前起病的早发糖尿病。患者多消瘦，病程中胰岛功能进行性衰退。超过75％患者有感觉神经性耳聋。其他临床症状包括线粒体脑肌病伴高乳酸血症和脑卒中样发作、视网膜色素变性、骨骼肌病、心肌疾病、肾病等，且病变呈母系遗传。该病在不同患者中的临床表现呈明显组织器官异质性，疾病严重程度不一，给临床防治带来巨大挑战。最近有研究发现mt.3243A>G突变和过早的骨老化相关，表现为骨重量降低，骨结构和力量受损。我们最近的研究也发现血液中mt.3243A>G的突变率越高，骨密度越低，这两者有密切的负相关性。

由于线粒体DNA突变的细胞杂胞质性(不同细胞之间线粒体DNA突变比例存在差异)，造成了多种临床表型的差异。以往研究表明高突变率会降低线粒体tRNALeu(UUR)的含量，降低其氨酰化，抑制转录后修饰。突变率高的细胞会造成蛋白合成及呼吸链受损。但由于致病机制不清楚，目前尚未找到治疗mt.3243A>G的特效药物。

研究表明，线粒体未折叠蛋白反应可以保护线粒体，使其减少突变蛋白造成的损伤。线粒体DNA缺失或者线粒体-核蛋白合成不平衡均会激活线粒体未折叠蛋白反应，造成线虫线粒体功能的提高和生存率的提升。值得注意的是，除了正面效应，在线粒体DNA缺失的线虫模型中，激活线粒体未折叠蛋白反应反而引发突变线粒体增加，造成线粒体功能紊乱的负面影响。提示，线粒体未折叠蛋白反应在线粒体DNA缺陷的发病机制中起到重要作用。其中，ATF5是一个线粒体未折叠蛋白反应中的转录因子，目标是和线粒体蛋白稳态相关的一系列蛋白。

为发现mt.3243A>G突变的致病机理、探索治疗相关疾病的新药物靶点，我们制备了患者来源的mt.3243A>G高突变尿液干细胞。实验发现mt.3243A>G高突变细胞会激活ATF5依赖的线粒体未折叠蛋白反应，同时抑制Wnt/β-catenin通路，造成成骨能力下降。通过基因敲低ATF5，抑制线粒体未折叠蛋白反应后，尿液干细胞线粒体功能增强，Wnt/β-catenin通路增强，成骨能力显著恢复。发明人的研究结果提示，ATF5及其影响的线粒体未折叠蛋白反应是m.3243A>G突变治疗的潜在靶点。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了ATF5作为药物靶点在筛选用于治疗线粒体m.3243A>G突变相关疾病的药物中的用途，所述的这种用途要解决现有技术中没有合适的靶点用于治疗线粒体m.3243A>G突变相关疾病的技术问题。

本发明提供了ATF5作为药物靶点在筛选用于治疗线粒体m.3243A>G突变相关疾病的药物中的用途。

进一步的，所述的药物是抑制ATF5表达的药物。

进一步的，所述的药物是抑制ATF5活性的药物。

本发明还提供了靶向ATF5的抑制剂在制备用于治疗线粒体m.3243A>G突变相关疾病的药物中的用途。

本发明的研究结果显示，ATF5及其基因与mt.3243A>G造成的线粒体功能损伤及成骨能力下降密切相关，为后期治疗mt.3243A>G突变的药物研发提供了一个全新的药物靶点及新的治疗手段和思路。

为了实现本发明的上述目的，我们采用以下技术方案：

第一方面，通过对线粒体膜电位和ROS检测分析，发现高突变尿液干细胞的线粒体膜电位下降，提示线粒体功能下降。敲低ATF5后，高突变尿液干细胞的线粒体膜电位上升，ROS下降，表明抑制ATF5可以恢复高突变细胞的线粒体功能。

第二方面，通过对尿液干细胞成骨的分析，发现mt.3243A>G高突变尿液干细胞成骨能力减弱。敲低ATF5后，mt.3243A>G高突变尿液干细胞的成骨能力增强，表明抑制ATF5可以恢复高突变细胞的成骨能力。

上述研究结果说明抑制ATF5不仅能改善线粒体功能，还能通过增强Wnt信号通路显著改善成骨能力。这些研究结果提示，ATF5或其基因可以作为药物靶点在筛选治疗mt.3243A>G突变药物中得到应用。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。目前国际上还没有研究报导ATF5的激活会引起mt.3243A>G突变患者线粒体功能降低和成骨能力降低的效应。本发明通过对线粒体m.3243A>G突变患者尿液干细胞中高突变细胞(突变率＞95％)的实验发现，高突变细胞的线粒体形态和功能均出现损伤。发明人首次提出并验证了ATF5不仅能降低mt.3243A>G高突变尿液干细胞的线粒体功能，还能通过Wnt信号通路降低成骨能力。高突变激活了ATF5依赖的线粒体未折叠蛋白反应、抑制了Wnt/β-catenin信号通路，造成了干细胞成骨能力的减退。在基因层面上敲低ATF5，可抑制高突变细胞的线粒体未折叠蛋白反应，可以增加mt.3243A>G高突变尿液干细胞的线粒体功能，恢复GSK3B和WNT7B这2个Wnt通路上关键因子的表达，最终恢复了高突变尿液干细胞的成骨能力，提高mt.3243A>G高突变尿液干细胞的成骨能力。因此，ATF5可以作为新的治疗线粒体m.3243A>G突变的靶点，在筛选或开发m.3243A>G突变相关疾病的药物上具有应用价值。

附图说明

图1显示了尿液干细胞提取过程。

图2显示了不同突变率细胞的ROS。

图3显示了敲低ATF5后，不同突变率细胞的ROS。

图4显示了不同突变率细胞的膜电位。

图5显示了敲低ATF5后，不同突变率细胞的膜电位。

图6显示了ATF5相关的基因在不同突变率细胞的表达。其中，A显示了在高突变细胞中，ATF5，HSP70，HSP60，LONP1均表达升高。B显示了在高突变细胞中，WNT7B的表达显著降低。

图7显示了ATF5相关的蛋白在不同突变率细胞的表达。

图8显示了敲低ATF5后，ATF5相关的基因在不同突变率细胞的表达。其中，A显示了在高突变细胞中，ATF5，HSP70，HSP60，LONP1均表达降低。B显示了在高突变细胞中，WNT7B和GSK3B的表达显著上升。

图9显示了敲低ATF5后，成骨标志物基因在不同突变率细胞的表达。

图10显示了敲低ATF5后，钙结节在不同突变率细胞中的染色情况。

具体实施方式

实施例1 mt.3243A>G突变患者尿液干细胞的单克隆分离培养(图1)

1)将青霉素、链霉素和两性霉素B的混合溶液5ml(其中青霉素含量10kU/ml，链霉素含量10mg/ml，两性霉素B含量25μg/ml)加入T75瓶子，将T75瓶口周围喷上消毒水；

2)选择线粒体mt.3243A>G突变人群的尿液，采用步骤1)的T75瓶子进行尿液收集；

3)打开T75瓶子，在4个50ml离心红管中各加50ml尿液样本，离心机离心；

4)每个红管中用移液管吸去上清至5ml以下，第一个红管加入15ml～20ml PBS，吹打混匀，然后将重悬液转移至下一个红管中，再次吹打混匀，以此类推，直至最后所有管的沉渣汇集于一管，1500转离心10min；吸去上清，留至少于5ml的溶液，得到沉渣红管；

5)吸去上清，留至少于5ml的溶液，得到沉渣红管；

6)采用质量百分比浓度为0.1-1％的明胶包被过的96孔培养板；

7)将步骤6)的96孔板放入超净台，吸净明胶，吸取培养基加入步骤5)的沉渣红管，加入15ml～20ml的PBS溶液吹打混匀，形成重悬液，然后加入96孔板，100ul/孔，在第3天或第4天，每孔再加100ul培养基；

8)第5或第6天半量换液；

9)第11天左右将出现密集成单克隆集簇细胞的96孔板内的培养基吸去，孔内加入PBS缓冲液冲洗，若孔内出现2个或以上克隆则弃去不要。

10)加入100ul胰酶，立即在显微镜下观察细胞是否消化分离，若细胞分离，吸去胰酶。在孔内先加入200ul培养基，吹打混匀使细胞重悬，传代为P1代。

11)后续细胞培养每2～3天换液，待细胞达80％～90％融合时进行消化传代。并在P3代对样本DNA做浓度测定。

12)对抽提到的DNA进行PCR扩增。

13)正向引物ttcacaaagcgccttccccc；反向引物ccattgcgattagaatgggtaca。

14)焦磷酸测序，96孔板，每孔各加70uL binding buffer mix，各孔对应PCR产物10uL，振荡器打开，25℃，1300rpm震荡15Min，加入引物(ggtttgttaagatggcag)和缓冲液，24孔圆板置于振荡器，80℃，5min，0rpm。记录A>G的突变率。

15)建立定量焦磷酸测序分析拟合曲线方程：

Y＝0.0000737578382X³+0.010544978865X²+0.71548332X-0.63357639446

Y是:实际的突变率，X是:检测到的突变率。

16)根据拟合方程计算出每个克隆的突变率，确认正常对照细胞、低突变细胞、高突变细胞，对这些已知突变率的单细胞进行扩增。

实施例2 SiRNA干扰ATF5

通过检索NCBI获得ATF5的基因序列(Gene ID:22809)，从网站下载靶向mRNA序列(>NM_012068.6ATF5[organism＝Homo sapiens][GeneID＝22809][transcript＝1](SEQID NO.26所示))。根据此mRNA序列设计了siRNA序列，正义链和反义链都为21nt，通过Genbank的BLAST查询，确保siRNA编码不与其它基因同源。将设计的ATF5 siRNA序列1(正向引物GCGAGUUGAUUUCACAGCUTT,反向引物AGCUGUGAAAUCAACUCGCTT)，交由上海吉玛制药技术有限公司化学合成。合成后经实验验证确实可以降低ATF5的表达(图8A)。

1.转染混合物的准备：合成的siRNA每管10D(光密度值)，配制成20umol/L的溶液，需要在每一管中加入140pL的0.1％DEPC-H20，20uM siRNA＝20umol/ul。在4个EP管中分别用100uL无血清培养液稀释2.0、3.0、4.0、5.0、6.0pL的siRNA。使每50uL培养基中分别含有20、30、40、50、60pmol ATF5siRNA。在2个EP管中分别用250ul无血清培养液稀释5.0、7.5uLlipofectamin^TM 2000试剂，使每50ul培养基中分别含有1.0、1.5ul的lipofectamine^TM 2000，轻轻混匀后在室温下孵育5min。不同含量的lipofectamine^TM 2000在稀释后30min内分别同相对应的已稀释的ATF5 siRNA混合于新的EP管中，制备成相对应的转染混合物，室温静置20min。

2.转染：在加入混合物前移去含血清的细胞培养液，PBS洗涤细胞3次，加入0.5mL无血清培养液，直接将混合物加人到相应的细胞孔中。摇动培养板，轻轻混匀，在37℃、5％CO₂培养箱中孵育。

3.对正常细胞、高突变细胞、低突变细胞3组细胞转染完成后48小时进行siRNA沉默效果检测，包括ATF5及其线粒体未折叠蛋白反应下游基因的mRNA水平的检测和蛋白水平的检测。

实施例3 ROS检测

1.收集正常细胞、低突变细胞、高突变细胞3组细胞并装载探针：按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10umol/L。

2.细胞600g，4min(或3000rpm/5min)离心，去上清，将细胞悬浮于稀释好的DCFH-DA(1ml)中，细胞浓度为10^6-2*10^7/毫升，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。将细胞600g，4min离心，用无血清细胞培养液洗涤(离心、弹散、吹打)细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。加入约500ul(视细胞密度而定)培养液吹打混匀后进行检测。

3.实验结果发现：高突变细胞的ROS显著高于正常细胞(P<0.05)。通过小干扰RNA(正向引物GCGAGUUGAUUUCACAGCUTT,反向引物AGCUGUGAAAUCAACUCGCTT)敲低ATF5后，高突变细胞的ROS显著降低至正常细胞水平(图2，3)。

实施例4尿液干细胞膜电位检测

1.取适量JC-1(200X)，按照每50μl JC-1(200X)加入8ml超纯水的比例稀释JC-1。剧烈Vortex充分溶解并混匀JC-1。然后再加入2ml JC-1染色缓冲液(5X)，混匀后即为JC-1染色工作液总液，分配JC-1染色工作液的量为1ml。

2.对于六孔板的一个孔，吸除培养液，根据具体实验如有必要可以用PBS或其它适当溶液洗涤细胞一次，加入1ml间充质干细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。

3.加入1ml JC-1染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20分钟。

4.在孵育期间，按照每1ml JC-1染色缓冲液(5X)加入4ml蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液(1X)，并放置于冰浴。

5. 37℃孵育结束后，吸除上清，用JC-1染色缓冲液(1X)洗涤2次。

6.加入2ml细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红。

7.实验结果发现：高突变细胞的膜电位显著低于正常细胞(P<0.05)。通过小干扰RNA小干扰RNA(正向引物GCGAGUUGAUUUCACAGCUTT,反向引物AGCUGUGAAAUCAACUCGCTT)敲低ATF5后，高突变细胞的膜电位显著升高(图4，5)。

实施例5尿液干细胞中目标基因RT-qPCR实验

1.正常细胞、低突变细胞、高突变细胞3组细胞总RNA提取及cDNA合成:使用trizol抽提样本总RNA，NANODROP光谱分析仪(Thermo，美国)测定RNA浓度及纯度。每份样本取1μg总RNA按照HiScript II Q RT SuperMix for qPCR试剂盒(Vazyme，南京)说明书反转录合成cDNA第一链。

2.实时荧光定量PCR:采用AceQTMUniversal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme，南京)和Roche Light Cycler 384Real-time PCR仪(Roche，德国)在384孔板上进行PCR反应。反应体系：2×AceQ SYBR qPCR Master Mix 10μL，cDNA模板(浓度为0.2ng/μL)用量4μL，反向引物(10μM)各0.2μL，补充超纯水至10μL。qPCR程序：95℃、5min，(95℃、10s，60℃、30s)×40cycles，在延伸阶段检测荧光强度收集信号；熔解曲线程序(95℃、15s，60℃、60s，95℃、15s)，每个样品设3个重复，取平均值进行分析。每次运行包括一个阴性对照，以检测反应体系是否污染。

3.数据分析：将原始Ct值转换为相对表达量：2-△Ct，其中△Ct＝所有样品Ct值-最小Ct值。

实施例6尿液干细胞中目标基因Western blot:

对正常细胞、低突变细胞、高突变细胞3组细胞分别加入适量蛋白裂解液(每20mg组织加入150～250灿蛋白裂解液)，充分裂解后将标本离心10min，吸取5uL上清进行BCA蛋白定量，剩余上清液水浴锅中煮沸进行蛋白变性。选取10％的分离胶，5％浓缩胶制胶后进行上样，每个上样孔加入12ul蛋白样本，后以100V恒压模式下进行电泳60min，电泳结束后以“三明治结构”在350mA、70min恒流模式进行下进行转膜，封闭结束后将抗体(以GAPDH作为内参)以1：1000浓度稀释后进行孵育，4℃过夜，将洗好的膜放在二抗中室温孵育1小时，洗涤后进行ECL化学发光和曝光显影，用QualityOne软件进行灰度值分析。结果发现，在高突变细胞中ATF5、HSP60、HSP70、LONP1的表达均比正常升高，p-GSK3β的表达比正常降低(图7)。

实施例7尿液干细胞中线粒体未折叠蛋白反应及Wnt通路的检测1.对正常细胞、低突变细胞、高突变细胞3组细胞每种各3个克隆进行ATF5、HSP60、HSP70、LONP1、WNT7B的RT-PCR检测。结果发现高突变细胞的ATF5、HSP60、HSP70、LONP1表达升高，WNT7B表达降低(图6)。

2.对这些克隆进行ATF5、HSP60、HSP70、LONP1、p-GSK3β的western blot检测。结果发现高突变细胞的ATF5、HSP60、HSP70、LONP1蛋白表达升高，p-GSK3β表达降低(图7)。

3.应用ATF5的小干扰RNA序列(正向引物GCGAGUUGAUUUCACAGCUTT,反向引物AGCUGUGAAAUCAACUCGCTT)，干预三组细胞48小时后，对ATF5、HSP60、HSP70、LONP1、WNT7B、GSK3B进行RT-PCR检测。结果发现敲低ATF5后、ATF5、HSP60、HSP70、LONP1表达降低，WNT7B、GSK3B表达上升(图8)。

实施例8尿液干细胞成骨能力的检测

将正常细胞、低突变细胞、高突变细胞3组细胞每组各3个克隆进行成骨分化。分别置于37℃，5％CO₂的培养箱中进行培养，当细胞融合度达到60％-70％时，小心的将孔内完全培养基吸走，向六孔板中加入2mL成人骨髓间质干细胞成骨诱导分化完全培养基(Cyagen，HUXMA-90021)。每2～3天换用新鲜的成人骨髓间质干细胞成骨诱导分化完全培养基(使用前需预热至37℃)。应用ATF5的小干扰RNA序列(正向引物gcgaguugauuucacagcutt,反向引物agcugugaaaucaacucgctt)，放到培养基中48小时后，加入成骨培养基培养48小时后进行RNNX2，OCN，BMP2基因的RT-PCR检测(图9)。培养21天后进行茜素红染色(图10)。结果表明，高突变细胞ATF5敲低后，RNNX2，OCN，BMP2的表达均上升，钙结节显著增加，成骨能力增强。

下表为上述实施例RT-PCR检测使用到的引物序列：

	Forward	Reverse
			ATF5	ctggctccctatgaggtccttg	gagctgtgaaatcaactcgctcag
mtHSP70	caagcgacaggctgtcaccaac	caacccaggcatcaccattgg
			HSP60	gatgctgtggccgttacaatg	gtcaattgactttgcaacagtcacac
Lonp1	cattgccttgaaccctctc	atgtcgctcaggtagatgg
			Runx2	ccaacccacgaatgcactatc	tagtgagtggtggcggacatac
BMP2	gagaaggaggaggcaaagaaa	agcagcaacgctagaagacag
			OCN	ccccctctagcctaggacc	accaggtaatgccagtttgc
GSK-3β	ccttaacctggtgctggact	agctctggtgccagta
			Wnt-7b	caacgagtgccagtaccagttcc	atctcccgagcgtccacgaag
6-<u>actin</u>	catgtacgttgctatccaggc	ctccttaatgtcacgcacgat

序列表

<110> 上海市第四人民医院

<120> ATF5在筛选用于治疗线粒体基因3243位点突变相关疾病的药物中的用途

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttcacaaagc gccttccccc 20

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccattgcgat tagaatgggt aca 23

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtttgttaa gatggcag 18

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctggctccct atgaggtcct tg 22

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gagctgtgaa atcaactcgc tcag 24

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caagcgacag gctgtcacca ac 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caacccaggc atcaccattg g 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gatgctgtgg ccgttacaat g 21

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtcaattgac tttgcaacag tcacac 26

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cattgccttg aaccctctc 19

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgtcgctca ggtagatgg 19

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccaacccacg aatgcactat c 21

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tagtgagtgg tggcggacat ac 22

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gagaaggagg aggcaaagaa a 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agcagcaacg ctagaagaca g 21

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ccccctctag cctaggacc 19

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

accaggtaat gccagtttgc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ccttaacctg gtgctggact 20

<210> 19

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

agctctggtg ccagta 16

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

caacgagtgc cagtaccagt tcc 23

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

atctcccgag cgtccacgaa g 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

catgtacgtt gctatccagg c 21

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ctccttaatg tcacgcacga t 21

<210> 24

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gcgaguugau uucacagcut t 21

<210> 25

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

agcugugaaa ucaacucgct t 21

<210> 26

<211> 2070

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

agaggcagaa agagaaagaa accagagctt agagtcagga ggaggaaacc agaccccgga 60

gccacaagga gagggctgga tccccggctc agagggaaga gtgtcgccgc ctctgcctgc 120

gtagccccgg ccatggctct gtagcctcga cccctttgtg cccccggccc gtctccgcgc 180

tcaccacgcc tgcgctctcc gctcccacct tctttcttca gccgaggccg ccgccgcctc 240

tccttgctgc agccatggag tcttccactt tcgccttggt gcctgtcttc gcccacctga 300

gcatcctcca gagcctcgtg ccagctgctg gtgcagcctc tcctgttgcc atcagtgccc 360

agcacctgtg ctacagccat gtcactcctg gcgaccctgg ggctggagct ggacagggcc 420

ctgctcccag ctagtgggct gggatggctc gtagactatg ggaaactccc cccggcccct 480

gcccccctgg ctccctatga ggtccttggg ggagccctgg agggcgggct tccagtgggg 540

ggagagcccc tggcaggtga tggcttctct gactggatga ctgagcgagt tgatttcaca 600

gctctcctcc ctctggagcc tcccttaccc cccggcaccc tcccccaacc ttccccaacc 660

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ctaccaccag ccccctccct ccccctgtcc ctcccctcct ttgacctccc ccagccccct 840

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caccgaggcc cacagggaag cagctgggag cttggaaacc tggtctcttg aatttcaaac 1680

ctggtttctt acaggtggtt gtctggggtg ggtggagtgg cgacaggata gagctgaagg 1740

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caggtttgca gtgcgggaag atgagcaggc cagtgggagg aggggcaggg cagggctgta 1920

gttggtgact gggtgttcat tttagctcta agaaaaaaaa tcagtgtttc gtgaaggtgt 1980

tggagagggg ctgtgtctgg gtgagggatg gcggggtact gatttttttg ggaggttatg 2040

agcaaaaata aaacgaaaca tttcctctgg 2070

Claims

1.ATF5作为药物靶点在体外筛选用于治疗线粒体m.3243A>G突变相关疾病的药物中的用途，所述的相关疾病为线粒体功能损伤或者成骨能力下降，所述的药物是抑制ATF5表达的药物。