CN107916252B - 一株用于验证脊肌萎缩症的永生淋巴细胞株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株用于验证脊肌萎缩症的永生淋巴细胞株IOP28，所述细胞株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号CGMCC No.14734，本发明还涉及所述的细胞株在制备检测肌萎缩症的试剂盒或制备筛选抗脊肌萎缩症的药物中的应用。

Description

一株用于验证脊肌萎缩症的永生淋巴细胞株
技术领域
本发明属于医药生物领域，具体而言，涉及一株用于验证脊肌萎缩症的永生淋巴细胞株。
背景技术
脊肌萎缩症(Spinal muscular atrophy,SMA)是最常见的常染色体隐性遗传性神经肌 肉病，发病率约为1/6000～1/10,000[1]。该病是由于运动神经元存活基因1(survival motor neuron,SMN1)纯合缺失或复合杂合突变(杂合缺失伴点突变)所致。基因诊断是SMA疾病 临床确诊的主要依据。然而，目前SMA基因诊断主要针对SMN1基因纯合缺失患儿，仍有很大 比例的点突变患儿尚未得到明确的基因诊断[2-5]。
SMN1基因全长27Kb，包含9个外显子(1，2a，2b，3～8)，该基因存在与其高度同源的SMN2基因，前者为SMA疾病的致病基因，后者则为疾病表型的修饰基因[6-8]。上述两个基因在全部基因组上仅存在5个核苷酸差异位点，其中2个位点位于外显子区(E7和E8各一个)。在SMA的实际临床基因诊断过程中，鉴于两个基因高度同源，直接基于基因组水平进行扩增测序来明确点突变来源是SMN1或SMN2较为困难。目前，国内外大多数SMN1点突变基因诊断是基于cDNA水平，利用RT-克隆技术结合测序分析鉴别点突变是否发生于SMN1基因[9-14]。
申请人近年来一直致力于SMN1基因点突变的研究，先后确定SMN1点突变15种，发现除 了常见的错义突变和移码突变外，产生提前终止密码子(Premature terminationcodon,PTC) 的SMN1点突变也有6种，约占SMA点突变人群的70％(36/50)，其中，p.Ser8Lysfs*23、 p.Leu228*为中国SMA的常见突变[5-8]。
而多项研究表明，含有PTC的转录产物,将导致翻译提前终止而产生无生物活性甚至毒害 性截短蛋白。而无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)作用机制是机 体内的一种翻译依赖性质控机制，可选择性地迅速降解含有PTC的mRNA(PTC+mRNA)，避 免产生对细胞正常生理功能有害的截短蛋白。
申请人发现相比错义突变(p.Arg2Gly)，上述携带PTC的突变在RT-克隆实验中全长SMN1 基因mRNA转录本的阳性克隆比例极低，降低了点突变基因诊断效率，为临床基因确诊带来 了很大困难，有必要对点突变的临床基因诊断策略进行优化。对携带上述突变的患儿外周血 进行全长SMN1基因转录本的检测，结果提示其SMN1mRNA转录水平显著下降[10,13]。这提 示我们，SMN1基因无义/移码突变极可能通过NMD机制下调含PTC的全长SMN1mRNA转录， 进而引起含全长转录本的阳性克隆比例降低，这就是造成这类点突变基因诊断困难的根本原 因。
Noensie和Diet最早将NMD应用于肿瘤研究，他们提出了一种新的研究策略，即通过抑 制NMD来鉴定突变基因(gene identification by NMD inhibition,GINI),首先用药物或 者siRNA来抑制NMD，然后通过微阵列技术比较基因表达状况的改变，表达上调的基因即可 能为发生无义突变的抑癌基因[15]。这一研究策略也提示我们，在SMA无义/移码突变的基因 诊断过程中，通过加入常用的抑制NMD机制的药物(如放线菌酮和嘌呤霉素)或使用RNAi 的技术特异性的抑制相关NMD基因，可能会在一定程度上增加PTC+型mRNA的稳定性，提高 含PTC的全长SMN1转录本的表达，使得NMD相关突变的基因诊断中全长SMN1转录本阳性克 隆比例上调，进而提高这类点突变基因诊断的效率，以达到优化SMN1点突变临床基因诊断 策略的目的。
本发明拟在前期研究基础上，以SMN1基因常见突变p.Ser8Lysfs*23和p.Leu228*为研 究对象，利用NMD药物抑制试验和NMD关键因子(UPF1)敲减实验明确其SMN1mRNA降解是 否通过NMD调控所致；同时，将抑制NMD机制的药物应用于此类SMA点突变患儿的临床基因 诊断中，观察其对SMA点突变诊断效率的影响，进而优化SMN1基因点突变的基因诊断策略。
发明内容
本发明首先涉及一株来源于脊肌萎缩症患者的永生淋巴细胞株IOP28，所述的细胞株 2017年11月7日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneral Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，编号CGMCC No.14734，地址：北 京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名：人永生化淋巴细胞株。
所述的细胞株IOP28的培养方法为：
培养基为：RPMI1640完全培养基(10％胎牛血清+90％RPMI 1640培养基、青霉素、链霉 素)；培养条件为：37℃、5％CO2的无菌培养箱。
本发明还涉及所述细胞株IOP28在制备检测SMN1基因突变的试剂盒中的应用。
所述的SMN1基因突变包括但不限于包括如下SMN1基因的如下突变：p.Ser8Lysfs*23、 p.Glu14*、p.Gln15*、p.Val19Glyfs*21、p.Leu228*、p.Ile249Tyrfs*16、p.Tyr272Trpfs*35、 p.Gly279Glufs*5等无义突变或移码突变。
所述的试剂盒中还包括：
(1)抑制NMD机制的药物或干扰RNA；
(2)mRNA提取试剂及反转录试剂；
(3)检测目标突变所需的引物、探针和必要的试剂。
所述的抑制NMD机制为UPF1基因介导的NMD机制；
所述的抑制NMD机制的药物为放线菌酮或嘌呤霉素。
本发明还涉及所述的细胞株IOP28在筛选或制备抗脊肌萎缩症的药物中的应用。
附图说明
图1、IOP28细胞株的形态学观察。
图2、IOP28细胞株SMN基因外显子1的Sanger测序结果，备注：下划线处提示为起始密码子处，箭头所示为c.22位插入碱基A。
图3、IOP28细胞株的MLPA拷贝数结果。
图4、IOP28细胞株的SMN1基因RT-PCR克隆测序结果。
图5、IOP28细胞株中SMN1的mRNA的表达量和SMN1蛋白的表达量。
具体实施方式
实施例1、建立永生淋巴细胞株(Immortalized B lymphoblastoid cells)：
1、永生淋巴细胞株原代建系方法：
(1)取p.Ser8Lysfs*23点突变患儿以及单拷贝携带者5～10mL肝素抗凝血；
(2)加入2mL无血清1640培养液，混匀，沿管壁小心加在4mL淋巴细胞分离液上；
(3)2500r/min离心30min，将白细胞层轻轻吸出后移入另一试管中；
(4)加入10mL无血清1640培养液洗涤3次，然后将洗涤后的白细胞用2mL RPMI1640完 全培养基(10％胎牛血清+90％RPMI 1640培养基+青、链霉素)重悬；
(5)加入1.3mL EBV悬液和0.4mL环胞霉素A(CySA，Sigma)，充分混匀后等量移入2个10mL培养瓶内，置于37℃、5％CO2培养箱培养；
(6)培养7天左右镜下观察，此后每周两次半量换液；约2周后转瓶，继续培养、换液和传代；
(7)至细胞数达到(4～6)X109/ml时，转化后的细胞在倒置显微镜下观察，可见细胞 体积增大，呈球状，胞质丰富，呈明显的团状或簇状增生(见图1)，标志转化成功。
(8)取传代2周后的子代细胞株，进行染色体核型分析，并挑取核型完整的单克隆细胞 进行进一步扩增培养，得到能够稳定传代的IOP28细胞系，做进一步的实验验证工作。
2、SMN基因外显子1的Sanger测序结果：
患儿家长知情同意抽取患儿及家系成员外周血，应用苯酚一氯仿方法提取基因组DNA。 以：
SMN-E1F(5'-GGGCGGCGGAAGTCGTCA-3')和
SMN-E1R(5'-TGATGCTGTCCCGAGGCT-3')为上下游引物进行扩增，扩增片段进行序列测定， 结果表明患儿的IOP28细胞系在SMN基因外显子1的c.22处存在c.22dupA突变(见图2)， 由于基因组测序同时混有SMN1和SMN2基因组序列，因此需要后续MLPA结合克隆测序验证突 变位点发生于SMN1基因，而非SMN2基因。
3、多重连接探针扩增(multiplex-ligation—dependent probe amplification，MLPA) 检测：
应用MLPA P060试剂盒(SALSA MLPA KIT P060，MRC—Holland)进行SMN1基因与SMN2 基因的拷贝数分析，所得数据采用Coffalyser MLPA DAT 9.0软件进行分析，比值为0.7～ 1.3时基因拷贝数为2；比值为0.3～0.7时基因拷贝数为1；比值为0时，基因拷贝数为0， 即纯合缺失。结果提示患儿SMN1和SMN2拷贝数分别为1和3(见图3)。
4、RT-PCR点突变克隆测序验证：
以IOP28总RNA为模板，应用反转录试剂盒(Invitrogen，美国)逆转录合成互补DNA(cDNA) 第1条链。利用SMN575和541cl 120特异引物扩增包含SMN基因E1～E8以及部分3’非翻 译区的片段，扩增产物经电泳分离切胶纯化后克隆人pGEM-T载体(Promega，美国)，连接产 物转化DH5a感受态细胞。根据SMNl和SMN2cDNA外显子7的差异位点，利用PCR—RFLP技术筛选SMNl和SMN2克隆子各5个，并进行序列测定。结果提示IOP28细胞系的SMN1基因处 存在c.22dupA突变(见图4)，。
实施例2、在IOP28细胞株中验证无义介导的mRNA降解机制
使用SALSA MLPA Kit(P021-A2；RC-Holland,Amsterdam,the Netherlands)，对构建 成功的IOP28细胞系的SMN1和SMN2拷贝数进行检测，结果显示，IOP28细胞系SMN1和SMN2的拷贝数与其外周血中的拷贝数一致。在SMN基因的Sanger测序后，我们确认了IOP28细胞系中存在SMN突变体(c.22dupA)。并且IOP28细胞系中并未检测到其他新SMN基因突变体。
进一步的研究结果表明，与非NMD突变阴性对照(c.830A>G)个体的细胞系和正常对照 的细胞系相比，携带c.22dupA突变的IOP28细胞系的fl-SMN1转录表达水平显著降低(如 图5)。同时，与正常对照相比，c.22dupA的IOP28细胞系的SMN蛋白表达水平也显著降低(如图5)。
以上实验说明所述的IOP28细胞系中，在NMD机制的作用下，受提前终止密码子型SMN1 点突变的影响，SMN1的转录水平和蛋白水平都有所降低。
实施例3、抑制NMD机制后对IOP28细胞系的SMN1转录水平和蛋白水平的影响
为进一步验证目标细胞系IOP28确实携带了正确的SMN1突变信息，对多次复苏且稳定传 代的目标细胞系进行了反向验证，
5％CO2，37℃条件下，目标淋巴细胞系在含有胎牛血清、双抗(青霉素和链霉素)的1640 培养基中培养24小时。在1.5ml细胞悬液中分别加入放线菌酮和嘌呤霉素至终浓度为100μ g/ml和300ug/ml，继续培养5.5个小时。分析了两种药物对细胞内SMN1转录水平的影响， 结果显示，经过放线菌酮和嘌呤霉素处理后，SC35基因和SMN1基因的转录水平和蛋白表达 量都有显著增加。
最后需要说明的是，以上实施例仅帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用作对本 发明保护范围的限定。
序列表
<110> 首都儿科研究所
<120> 一株用于验证脊肌萎缩症的永生淋巴细胞株
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列("人工序列")
<400> 1
gggcggcgga agtcgtca 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列("人工序列")
<400> 2
tgatgctgtc ccgaggct 18

Claims (1)

1.一株来源于脊肌萎缩症患者的永生淋巴细胞株IOP28，所述的细胞株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号CGMCC No.14734，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其特征在于，所述的细胞株的培养基为：含10％～15％胎牛血清、青霉素和链霉素的RPMI1640培养基。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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