CN111748618A - 一种帕金森病早期诊断的生物标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种帕金森病早期诊断的生物标志物及其应用。本发明实验首次证明PHB2基因的mRNA在帕金森病患者和正常人的血液中存在显著差异，提示可以通过检测血液中PHB2的mRNA表达水平或者PHB2蛋白水平来判断受试者是否患有帕金森病，从而确定了PHB2可以作为帕金森病诊断的生物标志物，为帕金森病的诊断提供了一个新的方向。本发明还根据抑制PHB2表达的试剂的治疗功能，开发出用于治疗帕金森病的药物，在临床上具有广泛的应用前景。

Description

一种帕金森病早期诊断的生物标志物及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种帕金森病早期诊断的生物标志物及其应用。

背景技术

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种严重危害老年人健康的神经退行性疾病，在我国65周岁及以上的人群中患病率高达1.7％，基本与发达国家持平，新增病例数为每年约10万人次，其危害性仅次于心脑血管疾病以及肿瘤，严重危害老年人的健康生活。主要临床症状是静止性震颤、肌强直、行动迟缓、姿势步态障碍等，患上PD不仅降低了病人的生活质量，还给家庭带来了沉重的经济负担。有效地控制PD不仅是单个家庭问题，也已经成为一个亟待解决的社会问题。目前，临床症状控制主要通过提高相应脑内区域的多巴胺水平来实现，这随可以减轻PD的症状，但不能抑制PD的发展，且长期使用后往往伴随一系列的不良反应。

帕金森病最主要的病理改变是中脑黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元的变性死亡，由此而引起纹状体DA含量显著性减少而致病。导致这一病理改变的确切病因目前仍不清楚，遗传因素、环境因素、年龄老化、氧化应激等均可能参与PD多巴胺能神经元的变性死亡过程。神经元一旦发生损伤或坏死就难以自身修复再生，因此，在神经元损伤发生的超早期发现和干预成了帕金森病防治的重中之重。研究发现，疾病发生的早期阶段即机体细胞甚至分子水平的改变往往远远早于临床症状的出现，临床病理分析结果也提示早在帕金森病临床症状出现20年前，患者脑部就开始出现小胶质细胞激活和多巴胺能神经元丢失。因此，怎样才能实现在帕金森发生初期细胞甚至分子水平超早期诊断是我们亟待解决的关键问题，以期为帕金森病超早期诊断和干预提供新的策略。

现有技术确诊帕金森病主要靠临床症状和体征，即医生的询问、观察和检查。症状的出现和发展可以非常缓慢，有些震颤或运动障碍甚至在几年后才引起重视。因此，患者往往在发病的中后期才被确认患有帕金森病，此时的治疗方法只能是进行药物干预，且药物干预只是以减轻PD的症状为主，不能抑制PD的发展，且长期使用后往往伴随一系列的不良反应。因此，传统的诊断方法，不仅错过了疾病的最佳干预时期，降低了病人的生活质量，而且还给患者家庭带来了沉重的经济负担。

发明内容

基于现有技术的局限性，本发明的目的在于提供一种帕金森病早期诊断的生物标志物及其应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

根据本发明的第一个方面，本发明提供了帕金森病生物标志物，所述生物标志物是PHB2基因或其表达产物，所述PHB2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明的第二个方面，本发明提供了检测所述生物标志物的产品在制备诊断帕金森病工具中的应用，其特征在于，所述产品包括检测PHB2基因mRNA表达的产品，或检测PHB2蛋白水平的产品。

进一步的，所述产品包括通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测PHB2基因mRNA表达水平的产品。

更进一步的，所述RT-PCR检测PHB2基因mRNA表达水平的产品：至少包括一对特异扩增PHB2基因的引物；所述实时定量PCR检测PHB2基因mRNA表达水平的产品：至少包括一对特异扩增PHB2基因的引物；所述原位杂交检测PHB2基因mRNA表达水平的产品：包括与PHB2基因核酸序列杂交的探针；所述芯片检测PHB2基因mRNA表达水平的产品是基因芯片，基因芯片包括与PHB2基因核酸序列杂交的探针。

更进一步的，所述特异扩增PHB2基因的引物，上游引物如SEQ ID NO.2所示，下游引物如SEQ ID NO.3所示。

进一步的，所述检测PHB2蛋白水平的试剂包括针对PHB2蛋白的抗体。

根据本发明的第二个方面，本发明提供了抑制所述生物标志物表达的试剂在制备治疗帕金森病药物中的应用。

进一步的，所述试剂包括但不限于siRNA、shRNA。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明首次发现了PHB2基因表达与帕金森病的相关性，通过检测受试者血液中PHB2的表达，可以判断受试者是否患有帕金森病、或判断受试者是否存在患有帕金森病的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

2、相比于现有的帕金森的诊断方法，通过本发明生物标志物诊断诊断帕金森具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。

3、本发明的研究成果可在帕金森早期即可作出诊断，并根据抑制PHB2表达的试剂的治疗功能，开发出用于治疗帕金森病的药物，在临床上具有广泛的应用前景。

附图说明

图1显示利用QPCR检测PHB2 mRNA表达水平的统计图；

图2显示利用免疫印迹检测PHB2蛋白表达水平的统计图；

图3显示利用免疫印迹检测PHB2蛋白表达抑制程度的统计图；

图4显示利用CCK-8检测细胞活性的统计图；

图5显示利用流式细胞术检测细胞凋亡率的统计图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

PHB2基因表达与帕金森病诊断的关联性研究

l、研究对象：

收集原发性PD患者60例，男32例，女28例，年龄50-85岁，病程6个月-20年。PD入组标准：诊断标准均符合PD临床诊断标准(参考“蒋雨平，王坚，丁正同，等，原发性帕金森病的诊断标准，2005，中国临床神经科学，2006，14：40”)。排除标准：(1)特发性震颤；(2)继发性帕金森综合征；(3)严重痴呆、构音障碍者；(4)患有其他精神疾患者。此项研究己通过医院伦理委员会批准且所有患者签署知情同意书。

正常组：选取年龄50-85岁的健康志愿者60例，男女各30例。

两组之间年龄、性别差异无统计学意义(P>0.10)，具有可比性。

2、血液中总RNA的提取

(1)匀浆处理：取新鲜的外周血，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置1min，10,000rpm离心1min。彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。每100-200μl血液收集的白细胞沉淀加入1ml TRIzol。

(2)分层

a.样品加入TRIzol后，震荡混匀后室温放置5min，使样品充分裂解。

b.每1ml TRIzol加入200μl氯仿，剧烈振荡10s后室温放置5min使其自然分相

(3)RNA沉淀

a.4℃12,000rpm离心20min。样品会分成三层：上层无色水相，中间层和下层黄色有机相，RNA主要存在于上层水相中，把水相(通常约500μl)转移到新的离心管中。

b.加入与上清等体积的冰预冷的异丙醇，混合均匀后，室温放置20min。4℃12,000rpm离心l0min，弃上清，RNA沉淀位于管底。

(4)RNA漂洗

a.按照1ml TRIzol加入1ml 75％冰预冷的乙醇进行洗涤(75％乙醇用RNase-free水现用现配)，用移液管轻轻吹打使RNA沉淀悬浮。

b.4℃,12,000rpm离心10min，弃上清，室温放置10min，让沉淀的RNA在室温下自然晾干。

(5)溶解RNA

沉淀中加入50μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA充分溶解，-80℃保存。

3、RNA质量和纯度的检测

RNA质量：通过RNA完整性来表示，可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：1.2％胶；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15min)检测完整性。

RNA纯度：OD260/OD280比值是衡量RNA样品中蛋白质污染程度的指标。OD260/OD280值(l0mM Tris，pH7.5)在1.9-2.1之间可认为RNA的纯度较好。

4、逆转录

用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/L dNTP，0.1mmol/LDTT，30μmmol/LOligo dT,200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。

5、QPCR

根据Genbank中PHB2基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：

PHB2基因：

正向引物为5’-TCCGAGGAGTATGAGACT-3’(SEQ ID NO.2)；

反向引物为5’-CTGGCTGTAGTTGGTGTT-3’(SEQ ID NO.3)。

GAPDH基因：

正向引物为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’(SEQ ID NO.4)；

反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.5)。

采用25μl反应体系，在PCR管中分别加入以下组分：正向引物1μl，反向引物1μl，SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，模板cDNA 2μl，去离子水补足251μl，进行QPCR反应。扩增程序为：95℃5min，(95℃15s，56℃60s)*40个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，ΔΔCT法进行相对定量。将正常人血液中PHB2 mRNA表达设为100％，帕金森患者组与其进行比较。

6、Western blot检测

提取总蛋白。用BCA蛋白浓度试剂盒测定蛋白浓度。每个样本取30μg总蛋白，12％SDS-PAGE 90V电压电泳2h后，100V电压转膜2h。5％脱脂奶粉封闭1h，一抗4℃孵育过夜，二抗37℃孵育1h。ECL发光液显色，凝胶成像系统曝光。ImageJ软件进行灰度分析，取目的蛋白与GAPDH的灰度值的比值为目的蛋白的相对表达量。将正常人血液中PHB2蛋白表达设为100％，帕金森患者组与其进行比较。

7、统计学处理

数据以

的方式表示，采用SPSS21.0统计软件进行统计分析。两者之间的差异采t检验，P<0.05具有统计学意义。

8、结果

(1)QPCR结果

如图l所示，与正常人相比，帕金森症患者血液中PHB2的mRNA水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

(2)Western blot结果

如图2所示，与正常人相比，帕金森病患者中血液中PHB2的蛋白水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例2PHB2基因表达的抑制

1、细胞培养

培养SH-SY5Y细胞，培养液为含有10％胎牛血清的DMEM/H培养液(Hyclone)，培养条件为5％CO2、37℃。当细胞密度达到80％～90％时，用含0.25％EDTA的胰蛋白酶消化细胞，按1:3-1:5比例进行传代。

2、细胞转染

PHB2的shRNA慢病毒粒子及其阴性对照shRNA慢病毒粒子购于Santa Cruz生物技术有限公司。

实验分2组：阴性对照组(转染shRNA-NC)，实验组(转染shRNA-PHB2)。取对数生长期的SH-SY5Y细胞，接种于6孔细胞培养板，24h后细胞覆盖率约为50％。转染方法按照SantaCruz生物技术有限公司的慢病毒粒子转染说明书进行。

3、Western blot检测shRNA-PHB2的干扰效率

步骤同实施例1的步骤64、结果

结果如图3所示，shRNA-PHB2可显著抑制PHB2表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例3PHB2基因表达与帕金森病治疗的关联性研究

1、MPP⁺的配制

按1ml细胞培养液溶解10mg的MPP⁺(sigma)，配制成MPP⁺储备液。用时每1ml培养液加60μl MPP⁺储备液，即配制成2mM的MPP⁺工作液。

2、帕金森病细胞模型构建

前期试验已证明浓度为2mM MPP⁺诱导损伤SH-SY5Y细胞24h，细胞存活率50％左右，因此以2mM MPP⁺可建立稳定的帕金森病细胞模型。

3、干扰PHB2基因表达对MPP⁺诱导的SH-SY5Y细胞损伤的影响

通过检测细胞活性以及细胞凋亡率来研究干扰PHB2基因表达对MPP⁺诱导的SH-SY5Y细胞损伤的影响。

3.1CCK-8实验

调整细胞到合适浓度并接种在96孔板中，当细胞汇合度达到70％-80％，加入MPP⁺作用24h。

实验分组如下：

空白对照组：不处理；

模型组：加MPP⁺；

阴性对照组：转染siRNA-NC，加MPP⁺；

治疗组：转染siRNA-PHB2，加MPP⁺；

用碧云天公司的CCK-8试剂盒(货号：C0038)检测细胞活性。根据制造商的说明，将孔内培养液倒掉，每个孔中加入100μl含有10mM CCK-8的培养基并在37℃下孵育2h。用多功能酶标仪测定450nm并650nm处的吸光度值即OD值(双波长可去除背景吸光度值)。将正常组的吸光度设为100％，其他组与对照组的吸光度值的百分比即为细胞活性百分比。

3.2流式细胞术检测细胞凋亡

调整细胞到合适浓度并接种在6孔板中，当细胞汇合度达到70％-80％，加入MPP⁺作用24h。

实验分组如下：

空白对照组：不处理；

模型组：加MPP⁺；

阴性对照组：转染siRNA-NC，加MPP⁺；

治疗组：转染siRNA-PHB2，加MPP⁺；

用碧云天公司的Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(货号：C1062M)测定细胞凋亡情况，按照操作说明书进行。

4、结果

4.1CCK-8实验

结果如图4所示，与模型组(存活率约为50.5％)相比，治疗组(存活率约为79％)的PHB2基因沉默后可引起细胞存活率明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；阴性对照组与模型组相比，细胞存活没有统计学差异(P>0.05)。上述结果表明，抑制PHB2基因可逆转MPP⁺诱导的SH-SY5Y细胞损伤。

4.2细胞凋亡实验

结果如图5所示，与模型组(约27％)相比，治疗组(约18.3％)的PHB2基因沉默后可显著降低凋亡细胞百分数，差异具有统计学意义(P<0.05)。表明抑制PHB2基因表达可抑制MPP⁺诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。

需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 河南科技大学第一附属医院

<120> 一种帕金森病早期诊断的生物标志物及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5427

<212> DNA

<213> 人

<400> 1

tccgtatgcg cgattcctgt gcgcgaagtt cgggtccgta gtgggctaag ggggagggtt 60

tcaaagggag cgcacttccg ctgccctttc tttcgccagc cttacgggcc cgaaccctcg 120

tgtgaagggt gcagtaccta agccggagcg gggtagaggc gggccggcac ccccttctga 180

cctccagtgc cgccggcctc aagatcagac atggcccaga acttgaagga cttggcggga 240

cggctgcccg ccgggccccg gggcatgggc acggccctga agctgttgct gggggccggc 300

gccgtggcct acggtgtgcg cgaatctgtg ttcaccggtg agcaacctcc gcctgctcgc 360

cggacgcttc cagtccctcc cccaaacccc ttgccctgtc cccgcgcccc tccacgggcc 420

tagcatttcc tctgagcagc ggcctggcct gatcaccacc catctcccca cagtggaagg 480

cgggcacaga gccatcttct tcaatcggat cggtggagtg cagcaggaca ctatcctggc 540

cgagggcctt cacttcaggt aatggcgggc agagcctgct gaccctgacc tttcaccctt 600

gacgccgacc cagcagtggc tatagtcgga cgtgcaacag gattcaacgc tgctcttttc 660

ccaccctcct catccctgcc cctaggatag tgggtgctgc gagaacctcc agcagcatac 720

aaactgttgt tttccagagg gacaagagaa tctctccttg tctgtggtcg tggagaggag 780

caggccaaaa aacgcgtggt gaggggaaac cgggcaaggc tagtgaaact gcggcctttt 840

cttttttttt ttttggagag ggagtcttgc tctgtcgccc aggctggagt gcagtggcgc 900

gatctcggct cactgcaacc tccgcctcct gatttcaagc gattctcctg cctcagcctc 960

acgagtagct gggattacag gcgcccgcca ccacgcccgg ctaatttttg tattttagta 1020

gagacggggt ttcactatgt agatcaagct ggtctcgaac tcctgacctc aaatgatccg 1080

cccgcctcgg cctcccaaag tgctgggatt acaggcgtga gccaccgcgc ccggccgaaa 1140

ctgtggcctc ttaataccta tccctgtcct ctccaggatc ccttggttcc agtaccccat 1200

tatctatgac attcgggcca gacctcgaaa aatctcctcc cctacaggct ccaaaggtag 1260

gtctgagcac ttggtaatca catggcaggt gggatgatca aggtagctgg caagaaaccc 1320

caggggaata tggtagtgtc aggcctttag gcctctttcc acatctgcaa gagctgtaac 1380

aaaaatacct gcctcctggg gtcaaagcag caaattctga acacactgtg tttgcgtgct 1440

ttttactgtc tcctccctga cgtgtattca ataagagtat tgtttgtccc tcgtcttgtt 1500

cactgcctag atcaaagctt tgttttaaag cctttttttt ctaactgctt gacttactat 1560

atctacagtt acatccacta gtacactctg ttctggagaa gtttgtccct aagcttgact 1620

agttcacctg ttctctcctt ctagaccata cataaaagcc gtgcctttga gttccccaga 1680

cctcttcctc ctccccaccc acgcacacat atacaccctg ggtcaggtag ctcacctgta 1740

acctgtaatg tacttctttg tgctatacct agtgcaggtc gcttattcat ttactagact 1800

gggccctggg aataaaagat tcattaaaca caattcttgt cccccaagtc cttacaggag 1860

acatgattac ggtacagcac gaaagcgccc acgttagagg ttgcacagag tacagagggg 1920

gaaagagtag tcagctctgc tggtgacggg gtttgcagtt caaggcttca cagtgggtga 1980

gggtgcattt cagctgtgct gcgtcttgtc ttccttgtca gcctgattaa ctctcctccc 2040

cccagggtag tgccaggctg tacaccattg cacagggcat acagggagga acatgaagga 2100

gaaaatgctt gggaaagggt gtttggcctt gaccagccac tgctgacctc aatctcagac 2160

ctacagatgg tgaatatctc cctgcgagtg ttgtctcgac ccaatgctca ggagcttcct 2220

agcatgtacc agcgcctagg gctggactac gaggaacgag tgttgccgtc cattgtcaac 2280

gaggtgctca agagtgtggt ggccaagttc aatgcctcac agctgatcac ccagcgggcc 2340

caggtctgac tcccaccacc atctgcgtgg tgtcagcctt tccttcctag gcccagagta 2400

ttgggaatta ggaaaggcag cttattagaa aagcattgtc accctagtgc catttccacc 2460

taaaagctgt gctaattgcc actgtgaaat aaggagagcc agcattagaa ctcgatagca 2520

ctcggtgtta ggaagcacag aggaaaatgg ccaagtcttg gcttttcctg cacctcttcg 2580

agcagagagg cttatgttac aggtttgcct gacaggaagc taaggcagtg catgttgtat 2640

tgagagtgaa gggttagggg tcgcaacctt cctttcagct ccccagtccc ctcaaaccac 2700

ccctcccttc ccctcttcac ccctgccctc aggtatccct gttgatccgc cgggagctga 2760

cagagagggc caaggacttc agcctcatcc tggatgatgt ggccatcaca gagctgagct 2820

ttagccgaga gtacacagct gctgtagaag ccaaacaagt gggtgagtcg caagagccgt 2880

ggggtgaggg cttctgagat gcaggaggag gaaagactcc atgggtgggg ctcctgaccc 2940

aggacagggt ctccctgact ctctcccacc acagcccagc aggaggccca gcgggcccaa 3000

ttcttggtag aaaaagcaaa gcaggaacag cggcagaaaa ttgtgcaggc cgagggtgag 3060

gccgaggctg ccaagatgat atccttctgc tggagagatc tcagcccagc ccctagggca 3120

cctgagttcc ccattctcct tcatgggcag gctgatgaga ctaaggcgaa tgcgactccg 3180

tgctctctgg cccttggctc cttgttgggg gtggggacta cagatgagat ctgaaatctt 3240

agtggtagta cctgagccat gactccccac tgtaaggcca gatcaatagc attggtggcc 3300

ttgccttcat ttctggtgct gcccctagtt cctggcagca gcctgcaggg aggcccacag 3360

gtggggtcca cggtagggct gggcacaagc cacctgagcg caaccttgga tctgacagcc 3420

cagaggagga ctggagcaag ggagtgtggt aaggacaggg ccagggattg agacctgccc 3480

ttgcgtgtac cttaaccctc ctcaccttgg agaagcactg agcaagaacc ctggctacat 3540

caaacttcgc aagattcgag cagcccagaa tatctccaag acggtgagtg tgtcagccca 3600

gcgtctctga tggggctgcc ttgagaaagt gctttcagtt aaggcacatt gaggtgaggg 3660

aattcgaacc ttgcttgttc cggtttctac tcagattggc ttctctggcc ggcgcggtgg 3720

ctcacgcatg taatccccgc actttgggag gccaaggtgg gtggatcacc tgaggtcagg 3780

agttcgagac cagcctggcc aacatggtga aaccccatct ctactaaaaa tacaaaagat 3840

aatgagcccg ctgtggtggc gtttagctat attcccagct acgcaggagg ctgaggcagg 3900

agaatcactt gaacccagga ggcggaagtt gcagtgagct gagatcatgc cactgcactc 3960

cagcctgagc aacagagcaa gactccgtct caaaaataaa taaataaaaa attggcttct 4020

ccgatactcc tcctgtcaag aatgattcct ctgggttccc tgaccttttg ttctaatcat 4080

agctgctgct cagcgctctg gatccctaag tgcgagcaga aaccatgtgt tactcattgc 4140

tgcacccctg ccctaatctg catgtgttcc atgttaagta gctgctgaat tgcaggggtc 4200

ggaattgagg tctttgctta atgcaagcat ctgtcttatt tcctgccctg tagatcgcca 4260

catcacagaa tcgtatctat ctcacagctg acaaccttgt gctgaaccta caggatgaaa 4320

gtttcaccag gtgagagatg tggccacact gtggggtatc accaagaacg tgggacctga 4380

gtctggttgt ttgggctctg gagcctgcta cagctattca tatggctcag agacattgaa 4440

ccaaaattag aaaagggggt ggttgacagt ttctatcttg catctcatag gattgatttt 4500

atgagatcaa ataggattat tcacataaaa agcactttaa ttataaagtt ttcatctaac 4560

caaaaagtga tgaaagatga tactcagttt tcttactcaa gagccctcaa actcctctgg 4620

tgaatggagg gatgttagga aaggagatga gaaatagcag tggccatgag aacatgcctc 4680

ctcctttcat gagcctgaga ttcctggctg tcaaccctgt ttatcttttc tcttgggagc 4740

aaaggagggt tcaaagctga gtggggcctg aagctgtcaa ttaacatgtg catttctctt 4800

ctctgtttct tgttcatctg gcgatctggc accacagggg aaggtaagct gttgttgctt 4860

ctgtggggtc ctgcaggcca ccttctccag tacccgcctc ctaccctacc ccctttccca 4920

cctccccgaa gacaaaccct caatcagggt aggagggtcg tagagggaat ggcctagagt 4980

gtcctgcctc tcacatttat gtcccctaat aatgtcatta tctatctttt ttttcctaca 5040

gtgacagcct catcaagggt aagaaatgag cctagtcacc aagaactcca cccccagagg 5100

aagtggatct gcttctccag tttttgagga gccagccagg ggtccagcac agccctaccc 5160

cgccccagta tcatgcgatg gtcccccaca ccggttccct gaacccctct tggattaagg 5220

aagactgaag actagcccct tttctgggga attactttcc tcctccctgt gttaactggg 5280

gctgttgggg acagtgcgtg atttctcagt gatttcctac agtgttgttc cctccctcaa 5340

ggctgggagg agataaacac caacccagga attctcaata aatttttatt acttaacctg 5400

aagtcaaggc ttcacgtgtt catgaac 5427

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tccgaggagt atgagact 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctggctgtag ttggtgtt 18

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tttaactctg gtaaagtgga tat 23

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggtggaatca tattggaaca 20

Claims (8)

1.帕金森病生物标志物，其特征在于，所述生物标志物是PHB2基因或其表达产物，所述PHB2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.检测权利要求1所述生物标志物的产品在制备早期诊断帕金森病工具中的应用，其特征在于，所述产品包括检测PHB2基因mRNA表达的产品，或检测PHB2蛋白水平的产品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品包括通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测PHB2基因mRNA表达水平的产品。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述RT-PCR检测PHB2基因mRNA表达水平的产品：至少包括一对特异扩增PHB2基因的引物；

所述实时定量PCR检测PHB2基因mRNA表达水平的产品：至少包括一对特异扩增PHB2基因的引物；

所述原位杂交检测PHB2基因mRNA表达水平的产品：包括与PHB2基因核酸序列杂交的探针；

所述芯片检测PHB2基因mRNA表达水平的产品是基因芯片，基因芯片包括与PHB2基因核酸序列杂交的探针。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述特异扩增PHB2基因的引物，上游引物如SEQ ID NO.2所示，下游引物如SEQ ID NO.3所示。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测PHB2蛋白水平的试剂包括针对PHB2蛋白的抗体。

7.抑制权利要求1所述生物标志物表达的试剂在制备治疗帕金森病药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述试剂包括但不限于siRNA、shRNA。

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