CN113980968B - 一种新的ra标志长链非编码rna及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种新的RA标志长链非编码RNA及其应用，属于风湿病分子生物学领域。新的RA标志长链非编码RNA，即AC123912.4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明根据该长链非编码RNA序列，设计并合成特异性实时定量PCR引物和探针，制备用于RA辅助诊断或者疗效预测的制剂。利用实时定量PCR制剂，在RA临床病例标本中检测该长链非编码RNA的表达水平，发现该长链非编码RNA在RA中表达显著上调，本发明有望制备用于RA辅助诊断或者疗效预测的制剂。

Description

一种新的RA标志长链非编码RNA及其应用

技术领域

本发明属于风湿病分子生物学领域，涉及长链非编码RNA在制备RA辅助诊断或者预后制剂中的应用，具体为一种新的RA标志长链非编码RNA及其应用。

背景技术

类风湿关节炎(RA)是以侵蚀性，对称性，多关节炎为主要临床表现的慢性、全身性、进展性、自身免疫性疾病，基本病理改变为滑膜炎和血管翳的形成，并逐渐出现关节软骨和骨破坏，最终可能导致关节畸形和功能丧失(Weyand CM,Goronzy JJ.The immunologyof rheumatoid arthritis[J].Nat Immunol,2021,22(1),doi:10.1038/s41590-020-00816-x.)。RA发病主要集中在20～50岁，约占世界人口的1％，女性发病率是男性的2～3倍，发病率高、致残率高，累及心脏、肺脏、肾脏等多系统(Nguyen NT,Nakahama T,Kishimoto T.Aryl hydrocarbon receptor and experimental autoimmunearthritis.Semin Immunopathol,2013,35:637-44；Pan L,Wang T.Features of cardiacremodeling in Patients with Acute Coronary Syndrome Complicated withRheumatoid Arthritis[J].Sci Rep,2017,7(1),doi:10.1038/s41598-017-11123-1.)。尽管，目前临床上用于RA诊断和治疗的技术手段在不断改进，但其发病率和致残率仍居高不下。RA的发病机制尚不完全清楚，主要与遗传、环境、感染等因素相关。尽管国内外关于RA发病机制的研究已在mRNA、蛋白质以及miRNA等表观遗传学领域取得了一系列成果(Tsai CY,Hsieh SC,Liu CW,et al.The Expression of Non-Coding RNAs and Their TargetMolecules in Rheumatoid Arthritis:A Molecular Basis for RheumatoidPathogenesis and Its Potential Clinical Applications[J].Int J Mol Sci,2021,22(11),doi:10.3390/ijms22115689.)，但其确切的发病机制目前仍在积极的研究探索中。

长链非编码RNA(lncRNA)是一种转录本长度超过200nt、无蛋白质编码的RNA分子，近年研究发现它是一类具有重要生物学功能的RNA，参与基因组印记、染色体沉默、染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程，在细胞分化和发育、基因转录和翻译、遗传和表观遗传等生命活动中均发挥重要的调控作用(Guo X,Gao L,Wang Y,etal.Advances in long noncoding RNAs:identification,structure prediction andfunction annotation[J].Brief Funct Genomics,2016,15(1),doi:10.1093/bfgp/elv022；Engreitz JM,Ollikainen N,Guttman M.Long non-coding RNAs:spatialamplifiers that control nuclear structure and gene expression.Nat Rev MolCell Biol.2016；17(12):756–770；Li Y,Zhang S,Zhang C.LncRNA MEG3 inhibits theinflammatory response of ankylosing spondylitis by targeting miR-146a[J].MolCell Biochem,2020,doi:10.1007/s11010-019-03681-x.)。目前已有较多lncRNAs被证实在包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、骨关节炎、强直性脊柱炎等多种风湿病中差异表达，并发挥重要的调控作用(Zhu J,Tu S,Qu Q.lncRNA BZRAP1-AS1 alleviatesrheumatoid arthritis by regulating miR-1286/COL5A2 axis[J].Immun Inflamm Dis,2021,11,doi:10.1002/iid3.558；Liu X,Lin J,Wu H,et al.A Novel Long NoncodingRNA lincRNA00892 Activates CD4 T Cells in Systemic Lupus Erythematosus byRegulating CD40L[J].Front Pharmacol,2021,12,doi:10.3389/fphar.2021.733902；Yang J,Zhang M,Yang D,et al.mA-mediated upregulation of AC008 promotesosteoarthritis progression through the miR-328-3p-AQP1/ANKH axis[J].Exp MolMed,2021,doi:10.1038/s12276-021-00696-7.)。lncRNAs在调控RA细胞增殖、凋亡、侵袭和炎症等方面，均具有十分重要作用。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种新的RA标志长链非编码RNA及其应用。

本发明所采用的技术方案为：一种新的RA标志长链非编码RNA，即AC123912.4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种长链非编码RNA的检测试剂在制备用于RA辅助诊断或者疗效预测试剂中的应用，所述长链非编码RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明根据所述AC123912.4序列设计并合成出用于实时定量PCR的检测引物组。所述引物组适用于SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、复合探针等的检测。

本发明的另一目的是提供一种检测AC123912.4表达水平的荧光定量PCR试剂盒及使用方法，该荧光定量PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。

本发明制备了一种检测lncRNA表达水平的染料类实时定量PCR试剂盒，组分如下：特异性引物、标准DNA模板、荧光染料、实时定量PCR反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.2，下游引物序列为SEQ ID NO.3。所述荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg²⁺、Taq酶及buffer缓冲液。荧光染料优选SYBR Green II，Taq酶优选热启动酶。

本发明还公开了一种检测RA的染料类荧光定量PCR试剂盒的使用方法，荧光定量PCR体系：上游引物(10uM)0.4uL，下游引物(10uM)0.4uL，模板DNA 2.0μL，2×SYBR GreenqPCR Master Mix(High ROX)10μL，RNase Free water 6.2uL，总体积是20μL。荧光定量PCR程序：95℃30s预变性，接40个循环：95℃15s，60℃30s。

本发明还公开了一种长链非编码RNA的检测方法，包括样品总RNA的提取、样品cDNA的制备、AC123912.4的扩增。具体步骤包括：

1)样品总RNA的提取：按照Life Technologies公司的TRIZOL(R)试剂所需试剂及步骤提取RA患者PBMCs中的的Total RNA；再用NanoDropND-1000核酸定量仪定量(NanoDropTechnologies，Wilmington，Delaware)定量所提取的RNA的纯度和浓度，甲醛变性胶电泳质检确保提取的RNA的完整性。

2)样品cDNA的制备：采用TaKaRa试剂盒PrimeScript^TM RT reagent Kit withgDNAEraser(货号：RR047A)对提取的总RNA反转录合成cDNA；该试剂盒内含RNase-Free DNase，可有效去除混杂的基因组DNA。

3)AC123912.4的扩增：采用TAKARA SYBR Premix Ex TaqTM II(TIi RNaseHPlus)荧光定量试剂盒，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。

染料类荧光定量PCR体系：上游引物(10uM)0.4uL，下游引物(10uM)0.4uL，模板DNA2.0μL，2×SYBR Green qPCR Master Mix(High ROX)10μL，RNase Free water6.2uL，总体积是20μL。荧光定量PCR程序：95℃30s预变性，接40个循环：95℃15s，60℃30s。

通过对阳性样品的检测，发现本发明染料类荧光定量试剂盒检测准确率为80％，连续3次重复实验，实验结果稳定。

本发明还提供了一种AC123912.4基因在制备RA靶向治疗试剂中的应用，具体而言，即根据AC123912.4基因制备特异性过表达序列和小干扰RNA序列(如下表所示)，用于在RA-FLS中过表达和干扰AC123912.4基因。

本发明提供了一种RA诊断试剂，所述试剂包括特异性过表达序列pcDNA3.1-AC123912.4和小干扰序列si-AC123912.4，其核苷酸序列如下表所示。该特异性过表达序列pcDNA3.1-AC123912.4和小干扰序列si-AC123912.4是针对AC123912.4的全长序列设计并合成，其可用于感染RA-FLS，使AC123912.4基因在细胞中过表达和小干扰。

与现有技术相比，本发明的有益效果表现在：

为系统探索RA的lncRNA表达谱，发现与RA发生发展特异性相关的一组lncRNAs，由3对RA患者PBMCs和正常人PBMCs，通过上海典希生物公司的RNA提取试剂盒(Thermo FisherScientific，Waltham，MA，USA)提取RNA后，采用HiSeq3000(Illumina)进行测序筛选出一条在RA患者中显著高表达的lncRNA，命名为AC123912.4，其基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示，位于19号染色体反义链21,753,624-21,770,124之间，基因全长约为1178bp。

经过45对RA患者PBMCs与正常人PBMCs样本RT-qPCR验证发现该lncRNA表达在RA患者中显著上调，与临床指标具有显著相关性。进一步在验证发现该lncRNA在RA-FLS中表达上调，能促进RA-FLS的炎症反应和高凝状态。lncRNA有望成为风湿病诊断和预后判断的标志物，同时也为风湿病的治疗提供了新的靶点。

附图说明

图1为3对RA患者和正常人PBMCs中差异表达lncRNAs火山图。

图2为45例RA患者和45例正常人PBMCs中AC123912.4的RT-qPCR检测结果。

A.AC123912.4在RA患者和正常人PBMCs中的表达，AC123912.4在RA患者中表达升高(p<0.001)；B.AC123912.4在RA患者和正常人PBMCs中ROC曲线图。数据表示为平均值±S.E.M(n＝45)，^***p<0.001。

图3为AC123912.4与RA患者临床指标相关性分析。

A.AC123912.4与年龄呈正相关；B.AC123912.4与病程呈正相关；C.AC123912.4与ESR呈正相关；D.AC123912.4与CRP呈正相关；E.AC123912.4与RF呈正相关；F.AC123912.4与CCP呈正相关；G.AC123912.4与IGG呈正相关；H.AC123912.4与DAS28呈正相关。

图4为AC123912.4在RA-FLS中的表达。

经TNF-ɑ刺激后，AC123912.4在RA-FLS中表达升高(p<0.05)，与pcDNA3.1-NC组相比，过表达AC123912.4后AC123912.4在RA-FLS中表达升高(p<0.001)，与si-NC组相比，干扰AC123912.4后AC123912.4在RA-FLS中表达降低(p<0.01)。数据表示为平均值±S.E.M(n＝6)，与RA-FLS组相比，^*p<0.05，与pcDNA3.1-NC组相比，^▲▲▲p<0.001，与si-NC组相比，^##p<0.01。

图5位AC123912.4对RA-FLS炎症的影响。

A.AC123912.4对RA-FLS中IL-6的影响；B.AC123912.4对RA-FLS中IL-8的影响。与pcDNA3.1-NC组相比，过表达AC123912.4后IL-6和IL-8在RA-FLS中表达升高(p<0.001)，与si-NC组相比，干扰AC123912.4后IL-6和IL-8在RA-FLS中表达降低(p<0.01)。数据表示为平均值±S.E.M(n＝6)，与pcDNA3.1-NC组相比，^***p<0.001，与si-NC组相比，^▲▲▲p<0.001。

图6为AC123912.4对RA-FLS高凝状态的影响。

A.AC123912.4对RA-FLS中PAF的影响；B.AC123912.4对RA-FLS中TXB2的影响。与pcDNA3.1-NC组相比，过表达AC123912.4后PAF和TXB2在RA-FLS中表达升高(p<0.001)，与si-NC组相比，干扰AC123912.4后PAF和TXB2在RA-FLS中表达降低(p<0.01)。数据表示为平均值±S.E.M(n＝6)，与pcDNA3.1-NC组相比，^***p<0.001，与si-NC组相比，^▲▲p<0.001，^▲▲▲p<0.001。

具体实施方式

实施例1

RA患者和正常人PBMCs中差异表达lncRNAs火山图

一、材料和方法

(一)材料

1.病例来源：3例RA患者PBMCs来自安徽中医药大学第一附属医院住院确诊病人，3例正常人PBMCs来自同一时期安徽中医药大学第一附属医院体检中心体检患者。

2.纳入标准：纳入RA患者均符合2010年美国风湿病学会(ACR)联合欧洲抗风湿病联盟(EULAR)提出的诊断标准：

A：受累关节

1个大关节(0分)

2-10个大关节(1分)

1-3个小关节(有或没有大关节)(2分)

4-10个小关节(有或没有大关节)(3分)

超过10个关节(至少一个小关节)(5分)

B：血清学(至少需要1项结果)

-RF和CCP(抗环瓜氨酸肽抗体)阴性(0分)

-RF和CCP，至少有一项是低滴度阳性(2分)

-RF和CCP，至少有一项高滴度阳性(3分)

C：急性期反应物(至少需要1项结果)

-CRP和ESR均正常(0分)

-CRP或ESR异常(1分)

D：症状持续时间

-＜6周(0分)

-≥6周(1分)

在A-D内，取病人符合条件的最高分。例如，患者有5个小关节和4个大关节受累，评分为3分。分数相加≥6分，诊断为RA。

3.排除标准：

不符合上述诊断标准及中医证候诊断标准

合并有心、肝、肾等严重疾病以及严重关节外表现

年龄在18岁以下，75岁以上者

孕妇或哺乳期女性

精神病患者

关节严重畸形，完全丧失关节功能者

观察期间应用免疫抑制剂和生物制剂的患者

4.知情同意：所有研究对象均自愿签署知情同意书。知情同意书的内容包括本次研究的目的、意义和方法，研究对象因参加此项研究可能获得的益处和可能出现的风险，本研究的意义以及收集到的研究对象相关信息尤其个人隐私方面的保密问题等。

3对RA患者和正常人的一般信息表见表1

表1 3对RA患者和正常人的一般信息表

编号	研究对象	性别	年龄(岁)	病程(年)
					1	RA患者	女	54	6
2	RA患者	女	56	5
					3	RA患者	男	48	8
4	正常人	女	54	/
					5	正常人	女	56	/
6	正常人	男	48	/

(二)方法

1.RA患者PBMCs提取

室温条件下，在50mL离心管中加入6mL Ficoll-Paque PLUS；10mL离心管中加入4mL新鲜的抗凝血和等量的PBS，混匀，将稀释过的血液样本小心铺到Ficoll-Paque分离液上面，然后将离心管置于水平式离心机内，19℃400g离心35min；离心后分4层，从上往下依次为：血浆层、单核细胞层、Ficoll-Paque PLUS、红细胞层，吸掉血浆层，将单核细胞层转移到另一离心管中，加入至少3倍体积的PBS，混匀，19℃400g离心15min，弃上清；加入6mL PBS重悬细胞，19℃100g离心10min，弃上清；再加入1mL PBS重悬细胞，然后转移到1.5mL EP管中，19℃100g离心10min，弃上清，置-80℃冰箱保存。

2.RNA提取

收集好的细胞沉淀在室温条件下加入1ml TRIzol裂解至液体澄清且无细胞团状态；加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置5分钟；4℃12000rpm离心10分钟，取上清(约500ul)加入到另一EP管中；加入0.5mL预冷的异丙醇，温和混匀，冰上孵育30分钟；4℃12000rpm离心15分钟，弃去上清；加入1mL预冷的75℅乙醇，4℃12000rpm离心5分钟，弃上清；反复洗涤2次。室温干燥RNA沉淀，加入20-50μL DEPC水，-80℃保存备用。

3.高通量测序

首先，使用EpicenterRibo-ZerorRNARemoval试剂盒(Illumina，SanDiego，CA，USA)从总RNA中去除核糖体RNA，用RNaseR(Epicentre)处理核糖体耗尽的RNA并片段化为大约200bp；根据NEBNext超定向RNA文库试剂盒(NEB，Beverly，MA，USA)提供的说明，对纯化的RNA进行第一链cDNA合成，使用End-ItDNAEndRepair试剂盒修复cDNA片段，通过Klenow片段修饰在DNA片段的3'端添加一个A，最后连接到接头上；然后将纯化的第一链cDNA进行13-15个循环的PCR扩增，使用Agilent2200TapeStation和Qubit2.0(LifeTechnologies，Carlsbad，CA，USA)对文库产品进行评估，稀释至10pM以在HiSeq3000双端流通池上原位生成簇，最后进行测序(2×150bp)在HiSeq3000(Illumina)上，使用Skewer软件从测序数据的3'端动态去除序列片段和低质量片段。

4.差异基因筛选

使用FastQC软件分析了预处理数据的质量并计算了Q20和Q30的基础比率，BWA软件用于将预处理后的数据依次与rRNA序列数据库进行比对，参考基因组版本是GRCh38(hg38)。

二、结果

关于RA患者和正常人PBMCs中差异表达lncRNAs火山图见图1。高通量测序筛查发现多条表达上调和表达下调的lncRNAs。其中AC123912.4显示出在RA患者中表达显著上调，鉴于其可能在RA患者中中存在特异性表达，本发明通过以下实施例扩大临床样本进行指标的重复验证。

实施例2

RT-qPCR初步验证AC123912.4在45对RA患者和正常人PBMCs中的差异表达一、实验材料

选取45例RA患者PBMCs来自安徽中医药大学第一附属医院住院确诊病人(来源于45个患者具体信息见表1，样本特点见表2)，45例正常人PBMCs来自同一时期安徽中医药大学第一附属医院体检中心体检患者。

表2样本信息1

表3样本信息2

二、方法

1.RA患者PBMCs提取

室温条件下，在50mL离心管中加入6mL Ficoll-Paque PLUS；10mL离心管中加入4mL新鲜的抗凝血和等量的PBS，混匀，将稀释过的血液样本小心铺到Ficoll-Paque分离液上面，然后将离心管置于水平式离心机内，19℃400g离心35min；离心后分4层，从上往下依次为：血浆层、单核细胞层、Ficoll-Paque PLUS、红细胞层，吸掉血浆层，将单核细胞层转移到另一离心管中，加入至少3倍体积的PBS，混匀，19℃400g离心15min，弃上清；加入6mL PBS重悬细胞，19℃100g离心10min，弃上清；再加入1mL PBS重悬细胞，然后转移到1.5mL EP管中，19℃100g离心10min，弃上清，置-80℃冰箱保存。

2.RNA提取

收集好的细胞沉淀在室温条件下加入1ml TRIzol裂解至液体澄清且无细胞团状态；加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置5分钟；4℃12000rpm离心10分钟，取上清(约500ul)加入到另一EP管中；加入0.5mL预冷的异丙醇，温和混匀，冰上孵育30分钟；4℃12000rpm离心15分钟，弃去上清；加入1mL预冷的75℅乙醇，4℃12000rpm离心5分钟，弃上清；反复洗涤2次。室温干燥RNA沉淀，加入20-50μL DEPC水℃-80℃保存备用。

3.RT反应

反转录试剂盒PrimeScriptRT reagent Kit(TaKaRa提供)，分为两步，第一步去除基因组DNA，反应体系：加入总RNA(质量为1μg)、5×gDNA Eraser Buffer 2.0μL，gDNAEraser 1.0μL，DEPC水补足至10μL，然后PCR仪上42℃2min。第二步反转录反应体系：PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0μL、RT Primer Mix 1.0μL、RNase Free dH2O 4.0μL、PrimerScript Buffer 2 4.0μL，37℃，15min；85℃，5s，取出上述反应液，即为cDNA，-80℃保存备用。反应体系及扩增条件见下表。

1)去除基因组DNA反应体系

体系	体积
		5×gDNA Eraser Buffer	2uL
gDNA Eraser	1uL
		Total RNA	1ug
RNase Free water	Up to 10uL

反应条件

温度	时间
		42℃	2min

2)反转录反应体系

反应条件

温度	时间
		37℃	15min
85℃	5s

4.荧光定量PCR反应

取出cDNA作为荧光定量的模板，反应体系：2×SYBR Green mixture 10uL、正反向引物各0.4uL、模板cDNA 1uL、RNase Free water 2.0uL，在荧光定量PCR仪上进行PCR扩增反应，反应条件为95℃1min，随后95℃20s、60℃1min进行40个循环，得到每个样品的Ct值，以β-actin作为内参参照基因，实验结果采用2^-△△CT的方法进行分析。

1)反应体系如下：

2)反应条件如下：

3)各检测指标引物

三、结果

实验结果如图2所示，结果发现，与正常人相比，RA患者中AC123912.4表达上调(P<0.001)，差异具有统计学意义。ROC曲线结果表明，AUC为80.89％，95％CI为0.720-0.898，说明AC123912.4在RA诊断和预后判断中具有重要的潜在价值。

Spearman相关分析显示，AC123912.4表达水平与RA的年龄、病程疾病活动性指标ESR、CRP、RF、CCP、IGG和DAS28呈明显正相关，结果如图3。

在45对RA患者和正常人PBMCs扩大样本量验证的RT-qPCR结果中，采用染料类实时定量PCR检测出35例呈上调，检测阳性率达到80％。以上结果再次证明该指标在RA患者中普遍高表达。我们对上述样本进行重复3次RT-qPCR检验，结果重复性达100％，表明本发明试剂盒的重复性和稳定性较好。

实施例3

AC123912.4过表达序列和小干扰序列在RA-FLS中的应用

本实施例针对AC123912.4的全长序列设计，并合成其特异性过表达序列pcDNA3.1-AC123912.4和小干扰序列si-AC123912.4(其核苷酸序列如下表所示)，感染RA-FLS，使AC123912.4基因在细胞中过表达和小干扰，并进一步将该过表达和小干扰基因载体应用于调控RA-FLS的炎症反应和高凝状态。

具体病毒包装及细胞感染方法如下：

(1)293T细胞在6cm dish中培养至80-90％融合时，倾去培养液，用3mL PBS洗涤细胞两次；(2)加1mL Trypsin-EDTA solution，混匀后，小心吸去胰酶溶液，37℃放置3分钟；(3)再加入2mL含10％FBS的DMEM培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液；(4)血球计数板计数，将细胞稀释至3x10⁵细胞/mL；(5)按5x10³细胞/孔的浓度接种96孔板，混匀后于37℃5％CO2培养24h；(6)转染试剂Lipofectamin2000用于转染过表达质粒，剂量如下，每个剂量设三复孔；

Lipo(uL)	0.2	0.3	0.4
				质粒(ug)	0.2	0.3	0.5

(7)在1.5mL EP管中加入75μL(25μL/well*3well)无血清DMEM，再加入根据上述表格算出的不同剂量的质粒，混匀，取另一1.5mL EP管，加入75μL(25μL/well*3well)无血清DMEM，加入根据上述表格算出的相应剂量的Lipofectamin2000，混匀，室温放置5分钟后将两组管混合，室温放置20分钟，吸去96孔板中的培养液，每孔加入50μL无血清的DMEM培养液；(8)将转染混合物逐滴加入96孔板中，混匀后，在培养箱中温育5小时；(9)转染质粒组，吸弃转染液，更换为完全培养基，在培养箱孵育24h后观测；(10)48h后，RT-qPCR检测293T的感染效率；(11)48h后，收集293T细胞上清液至15ml离心管中，并于4℃，1500rpm离心5min，弃掉细胞沉淀，0.45μm滤器过滤后转移至1.5ml离心管，-80℃冰箱冻存；(12)在六孔板中接种待感染重组慢病毒的RA-FLS，密度为5～8×10⁵/孔培养；(13)吸尽培养液，加入1mL重组慢病毒液，及8μLpolybrene(终浓度1μg/μL)，放入培养箱培养；(14)4h后半量换液；(15)24h后，全量换液；(16)48h后，RT-qPCR检测RA-FLS的感染效率。

如此便获得AC123912.4过表达和小干扰的RA-FLS。

RA-FLS在无血清培养基中培养过夜后，加入10ng/ml TNF-ɑ分别刺激，用RT-qPCR检测AC123912.4的表达水平，结果如图4所示，发现TNF-ɑ刺激RA-FLS能够上调AC123912.4表达，过表达AC123912.4后AC123912.4表达显著升高，小干扰AC123912.4后AC123912.4表达显著下调。

图5结果显示，用ELISA试剂盒分别检测IL-6和IL-8的表达，与pcDNA3.1-NC组相比，pcDNA3.1-AC123912.4组IL-6和IL-8表达升高，与si-NC组相比，si-AC123912.4组中IL-6和IL-8表达显著降低。

图6结果显示，用ELISA试剂盒分别检测PAF和TXB2的表达，与pcDNA3.1-NC组相比，pcDNA3.1-AC123912.4组PAF和TXB2表达显著升高，与si-NC组相比，si-AC123912.4组中PAF和TXB2表达显著降低。

由此可见，AC123912.4能介导TNF-a介导的RA-FLS炎症反应和高凝状态。

因此，本发明所提出的这一新颖的长链非编码RNA不仅能成为诊断相关的生物标志物，更有望成为新的RA治疗靶点以改善、提高临床RA治疗效果。显然，找到更多、更准确的像AC123912.4这样的有望参与辅助RA诊断、治疗及预后相关的生物标志物，具有十分重要的现实意义。

以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 安徽中医药大学第一附属医院（安徽省中医院）

<120> 一种新的RA标志长链非编码RNA及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1178

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tctctgccgc tggcgtaggg gcgggggcgg gggacagtgt cttcagcaaa agtctgcgga 60

tagaaaggcc ccgctcctgt ccggacagca ggaatgggag agccgcctcc aaccccagcc 120

ccatggagca gggcagaaac gctgcccact gccctgctcc tgccaccagg aagggcgtgt 180

ggggggccac tttctgtaaa gaagaaaccg cctgaacaac aagtggctca aggcaccctt 240

gtctaacgac cagggacact gagcgccagg gcccaagtca ccagcaagag aaaacccagg 300

cggagcccag ggtgtccccc actgcccacc agccactgcg gtcaacgtga agggcaaggg 360

tgcaagcggg atcgcgtcac agggagccga gtgagcccag aaagtaggag aaggacgttt 420

ccacccacct ggagcgcagt ccgtttgcag ccggcggcag aatgctgctg tctccatcaa 480

taaagtccat gttagccacc tagaggataa aataccacga ggaggagtag caaggtgccc 540

ctgttgacag atcttgaagc acaagctcac tcccagaagc acagctgcct agtcaacaaa 600

cagctgacaa tacatgtctg aaggagctca gctgggaaca gaagaatggc cccactgagc 660

ctagcctaaa tggcggacca tctcaattat gagctaataa gttttggatg atttgttatg 720

ctgccatacc taactaatac atgcacccag tgcagattgg gtgtcaagat ttaaagacag 780

tttgattatt agtcaccttc taacaatggg caccctaaag gtactgacat ttttcccgat 840

ttaaagttaa atgtcttgta aggcaatgtt gactgatgca ggaatacttg tagacatgta 900

tgcatgtgat tggtgcttat atgcacacag tcccccacac cacaggaaaa aaccgatgac 960

cagagcctga ccattatggc caaggccaaa tagccaaagt ttgcctttaa tctattttct 1020

tcatatctaa aaattggagg tcaatactgt ggacaggtct gaagacatag agttttgttc 1080

tcctgtggcc ccatcattct tcagtggtct acctgtggtt attttattct tgttaccttc 1140

tgctctttct atgaccacta tctgttccac ccttgaaa 1178

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cctaaatggc ggaccatctc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acctttaggg tgcccattgt 20

Claims (1)

1.长链非编码RNA AC123912.4特异的小干扰RNA在制备TNF-α介导的类风湿关节炎靶向治疗试剂中的应用。

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