CN114594266B - M1联合m2型巨噬细胞因子作为生物标志物在类风湿关节炎诊断和治疗监测中的用途 - Google Patents

M1联合m2型巨噬细胞因子作为生物标志物在类风湿关节炎诊断和治疗监测中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种M1联合M2型巨噬细胞因子作为生物标志物在类风湿关节炎诊断和治疗监测中的用途。解决现有技术中缺乏利用M1联合M2型巨噬细胞因子作为生物标志物进行类风湿关节炎的特异性诊断、治疗监测以及炎症程度评估等问题。本发明通过实验证实了M1型巨噬细胞因子IL‑1R1、IFN‑γ、iNOS2，联合M2型巨噬细胞因子MRC1可以作为类风湿关节炎的诊断指标，使诊断结果更为准确；另一方面，本发明还提供了M1型巨噬细胞因子IL‑1R1、IFN‑γ、iNOS2，联合M2型巨噬细胞因子MRC1可以作为评估类风湿关节炎炎症严重程度的一个指标。从而更好的用于类风湿关节炎的诊断、预后评估和治疗监测。

Description

M1联合M2型巨噬细胞因子作为生物标志物在类风湿关节炎诊 断和治疗监测中的用途
技术领域
本发明属于风湿免疫病分子生物学领域，具体涉及一种M1联合M2型巨噬细胞因子作为生物标志物在类风湿关节炎诊断和治疗监测中的用途。
背景技术
类风湿关节炎(RA)是以关节滑膜炎、骨破坏为特征的自身免疫性疾病。RA炎症反应加剧关节和滑囊破坏而致关节畸形和功能丧失。RA“炎症极化”可分泌大量促炎性细胞因子、趋化因子，激活成纤维细胞和破骨细胞，加速机体炎症反应，造成关节破坏。巨噬细胞能生成多种促炎性细胞因子和趋化因子参与RA致病过程。巨噬细胞在不同因素诱导下呈现不同的表型、功能，即M1型和M2型巨噬细胞，这就是巨噬细胞分泌“炎症极化”现象。M1型巨噬细胞可分泌多种促炎性细胞因子，表达CD86等分子，促进炎症的发展。M2型巨噬细胞高表达抗炎细胞因子，表达CD 163等分子，发挥抗炎作用。有效干预巨噬细胞M1型转为M2型，使M1/M2恢复动态平衡状态，有利于促进RA炎症消退及滑膜关节组织修复。
在外周血等体液样本中筛选出在类风湿关节炎中异常表达的M1/M2促炎性细胞因子作为生物标志物，并研制相应的辅助诊断试剂盒，将有力推动类风湿关节炎的诊断、治疗以及监测等应用领域，具有极高的临床应用价值。
另外，目前对于巨噬细胞因子的检测主要采用的是酶联免疫吸附法(ELISA)，但ELISA法诸主要存在如下缺点：(1)试验中的一抗都得用酶标记，但不是每种抗体都适合做标记，费用相对提高。(2)交互反应发生的机率较高。(3)抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。(4)整体的敏感性和专一性都较差。(5)不能测定抗原量。(6)重复性差。(7)受自身抗体、嗜异性抗体等干扰，易出现假阳性。(8)不论仪器和手工操作，干扰因素较多，影响最大的是温度和时间等缺点。故寻求更好的检测方法尤为重要。
发明内容
针对目前类风湿关节炎缺乏诊断标志物等缺点，本发明提供了一种M1联合M2型巨噬细胞因子作为生物标志物在类风湿关节炎诊断和治疗监测中的用途，用于解决现有技术中缺乏利用M1联合M2型巨噬细胞因子作为生物标志物进行类风湿关节炎的特异性诊断、治疗监测以及炎症程度评估等问题。
为了实现该目的，首先，本发明提供了一种M1联合M2型巨噬细胞因子作为生物标志物在制备或筛选类风湿关节炎诊断试剂中的用途，所述试剂用于测定体液样品中M1型巨噬细胞因子IL-1R1、IFN-γ、iNOS2以及M2型巨噬细胞因子MRC1的表达量，所述体液样品选自血清、血浆、血液中的至少一种，所述体液样品中M1型巨噬细胞因子IL-1R1、IFN-γ、iNOS2的表达量与类风湿关节炎的严重程度正相关，M2型巨噬细胞因子MRC1的表达量与类风湿关节炎的严重程度负相关。
其次，本发明还提供了一种检测M1和M2型巨噬细胞因子存在的试剂在制备用于诊断、预后评估和治疗监测类风湿关节炎的药剂中的用途，所述试剂用于测定体液样品中M1型巨噬细胞因子IL-1R1、IFN-γ、iNOS2以及M2型巨噬细胞因子MRC1的表达量，所述体液样品选自血清、血浆、血液中的至少一种，所述体液样品中M1型巨噬细胞因子IL-1R1、IFN-γ、iNOS2的表达量与类风湿关节炎的严重程度正相关，M2型巨噬细胞因子MRC1的表达量与类风湿关节炎的严重程度负相关。
在本发明的一些实施例中，所述试剂通过多因子蛋白定量芯片检测技术检测RA、AS患者血清M1型巨噬细胞分泌的特点炎症因子标志物。
在本发明的一些实施例中，所述药剂用于诊断或监测类风湿关节炎的存在和/或过程和/或严重程度和/或预后。
与现有技术相比，本发明的有益效果表现在：
1、本发明所提出的M1型巨噬细胞因子IL-1R1、IFN-γ、iNOS2，联合M2型巨噬细胞因子MRC1在制备或筛选类风湿关节炎诊断试剂中的用途，一方面，本发明通过实验证实了M1型巨噬细胞因子IL-1R1、IFN-γ、iNOS2，联合M2型巨噬细胞因子MRC1可以作为类风湿关节炎的诊断指标，使诊断结果更为准确；另一方面，本发明还提供了M1型巨噬细胞因子IL-1R1、IFN-γ、iNOS2，联合M2型巨噬细胞因子MRC1可以作为评估类风湿关节炎炎症严重程度的一个指标。从而更好的用于类风湿关节炎的诊断、预后评估和治疗监测。
2、本发明首次将多因子蛋白定量芯片检测技术应用于患者血清巨噬细胞因子生物标志物的检测，该检测技术具有以下优点：(1)高通量性：一个样品一次可以检测多种因子，同时快速的发现多个生物标志物，且几小时内可以完成上百个样品的检测。(2)样品处理简单：可以直接用粗生物样品(血清、血浆、尿、体液等)进行分析，只需经过离心处理即可；可适用比较不纯的样本，而且数据再现性很高。(3)样品用量少：可以低至10μl-100μl样品检测。(4)特异性和灵敏度高：抗体芯片特异性高，可鉴定未知抗原/蛋白质，以减少测定蛋白质序列的工作量，且蛋白芯片的高灵敏度可以发现低丰度蛋白质及生物标志物。(5)可测定疏水蛋白质，与“双向电泳加质谱”相比，除了有相似功能外，并可增加测定疏水蛋白质的表达和功能。(6)集成性：在同一系统中集发现和检测为一体。(7)可定量检测：可同时绘制多种因子的标准曲线，故可定量检测生物标记物，但一般飞行质谱不用于定量分析。(8)代替和互补传统检测方法：利用抗体芯片，可替代Western Blot；利用定量抗体芯片，可代替ELISA定量检测；抗体芯片互补流式细胞仪不足的功能，如将细胞溶解，可测定细胞内的抗原，而且灵敏度远高于流式细胞仪。(9)性能价格比高：利用定量芯片一次性检测大量目标因子，平均定量每个因子所需的费用远比ELISA便宜，降低RA、AS患者费用。(10)准确、高效、安全可靠优点。
附图说明
图1为标曲稀释步骤示意图。
图2为M1型细胞因子IL-1R1在类风湿关节炎RA中的表达量检测结果。
图3为M1型细胞因子IFN-γ在类风湿关节炎RA中的表达量检测结果。
图4为M1型细胞因子iNOS2在类风湿关节炎RA中的表达量检测结果。
图5为M2型细胞因子MRC1在类风湿关节炎RA中的表达量检测结果。
图6为M1型细胞因子IL-1R1与类风湿关节炎RA的疾病活动性指标相关性检测结果。
图7为M1型细胞因子IFN-γ与类风湿关节炎RA的疾病活动性指标相关性检测结果。
图8为M1型细胞因子iNOS2与类风湿关节炎RA的疾病活动性指标相关性检测结果。
图9为M2型细胞因子MRC1与类风湿关节炎RA的疾病活动性指标相关性检测结果。
图10为M1型细胞因子IL-1R1与类风湿关节炎RA疾病ROC曲线检测结果。
图11为M1型细胞因子IFN-γ与类风湿关节炎RA疾病ROC曲线检测结果。
图12为M1型细胞因子iNOS2与类风湿关节炎RA疾病ROC曲线检测结果。
图13为M2型细胞因子MRC1与类风湿关节炎RA疾病ROC曲线检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明的相关原理及步骤，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解，在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常是按照常规条件或按照厂商所建议的条件进行实施检测。
实施例1
1、样品与标准品准备
标准品与样本处理如下：
(1)样品准备
血液样本60例，含健康对照(HC)组30例，RA组30例。
血清样本制备：10,000rpm，离心10min，取上清，用稀释液Calibrator DiluentRD6-52进行2倍稀释，即取40ul RD6-52加入到40ul样本中，最终取50μL稀释好的样本，进行检测。
(2)标准品准备
向标准品瓶中，加入相应量的稀释液Calibrator Diluent RD6-52，上下颠倒几次，在低速水平摇床上放置15min，标记为重组标准品溶液(Standard Cocktail)。准备9个EP管分别标记为S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、Blank。向记为S1的EP管加入500μL重组标准品溶液，向其余8个EP管内加入200ul稀释液(Calibrator Diluent RD6-52)。取100ul S1加入S2中，将S1进行3倍稀释得到S2，以此类推，混合均匀后向S3中加入100ul S2，将S2进行3倍稀释得到S3，将标准品稀释至S8，稀释步骤如图1所示。
2、芯片检测操作
(1)样品孵育
1)取微珠(Microparticle Cocktail)在振荡器上1,400rpm，振荡30s，使用稀释液“Assay Diluent RD1W”稀释微珠，即将500μL微珠加入5mL的稀释液RD1W中。
2)稀释后的微珠用振荡器，1,400rpm，再次震荡30s，每孔50μL加入96孔板中。
3)取50μL准备好的标准品标曲、样品和空白(Blank)加入对应孔中，上样顺序见表1。贴上封口膜，放置在平板振荡器上850rpm振荡，避光，室温，孵育2h。
表1
Figure BDA0003528610410000051
备注：孔S1-S8为标曲，孔K为空白，其余孔均为样本。其中A1-J1为健康对照组，A2-J2为类风湿关节炎患者组。
(2)孵育检测抗体
1)弃去样品，使用洗板机洗涤3次。
2)使用稀释液Assay Diluent RD1W稀释M1型巨噬细胞因子IL-1R1、IFN-γ、iNOS2，M2型巨噬细胞因子MRC1生物素-抗体混合液，即取500μL生物素-抗体混合液加入5mL的稀释液RD1W中。
3)每孔加入50μL稀释好的生物素-抗体混合液抗体混合物，贴上封口膜，放置在平板摇床上850rpm振荡，避光，室温，孵育1h。
(3)显色
1)弃去生物素-抗体混合液混合物，使用洗板机洗涤3次。
2)使用洗涤缓冲液稀释链霉亲和素-PE混合液，即取220μL链霉亲和素-PE混合液加入5.35mL的稀释液洗涤缓冲液中。
3)每孔加入50μL稀释好的链霉亲和素，贴上封口膜，放置在平板摇床上850rpm振荡，避光，室温，孵育30min。
4)使用洗板机洗涤3次。
5)每孔加入100μL洗涤缓冲液重悬，贴上封口膜，放置在平板摇床上850rpm，室温，避光，振荡2min。
6)送入已校正的Luminex 200机器中读值。
(4)操作过程如表2所示。
表2
Figure BDA0003528610410000061
3、数据结果的导出
本次检测的样品与标准品经Luminex 200检测仪检测后，获得的荧光由软件自动计算与优化，形成输出文件。
实施例2
检测结果
1、RA患者M1型细胞因子IL-1R1的表达
与健康对照组(HC)比较，类风湿关节炎患者组(RA)M1型细胞因子IL-1R1表达明显升高(P<0.0001)。如图2所示。
2、RA患者M1型细胞因子IFN-γ的表达
与健康对照组(HC)比较，类风湿关节炎患者组(RA)M1型细胞因子IFN-γ表达明显升高(P<0.0001)。如图3所示。
3、RA患者M1型细胞因子iNOS2的表达
与健康对照组(HC)比较，类风湿关节炎患者组(RA)M1型细胞因子iNOS2表达明显升高(P<0.0001)。如图4所示。
4、RA患者M2型细胞因子MRC1表达变化
与健康对照组(HC)比较，类风湿关节炎患者组(RA)M2型细胞因子MRC1表达明显降低(P<0.0001)。如图5所示。
5、M1型细胞因子IL-1R1与RA疾病活动性指标相关性分析
相关性分析结果显示，IL-1R1与RA疾病指标RF、CCP抗体呈正相关(P<0.05)，与RA活动性指标CRP、ESR呈正相关(P<0.01)，且与RA疾病状态DAS28呈正相关(P<0.05)。具体相关系数r见图6。
6、M1型细胞因子IFN-γ与RA疾病活动性指标相关性分析
相关性分析结果显示，IFN-γ与RA疾病指标CCP抗体呈正相关(P<0.05)，与RA活动性指标CRP、ESR呈正相关(P<0.01)，且与RA疾病状态DAS28呈正相关(P<0.05)。具体相关系数r见图7。
7、M1型细胞因子iNOS2与RA疾病活动性指标相关性分析
相关性分析结果显示，iNOS2与RA疾病指标RF、CCP抗体呈正相关(P<0.05)，与RA活动性指标CRP、ESR呈正相关(P<0.01)，且与RA疾病状态DAS28呈正相关(P<0.01)。具体相关系数r见图8。
8、M2型细胞因子MRC1与RA疾病活动性指标相关性分析
相关性分析结果显示，MRC1与RA疾病指标RF、CCP抗体呈负相关(P<0.05)，与RA活动性指标CRP、ESR呈负相关(P<0.01)，且与RA疾病状态DAS28呈负相关(P<0.01)。具体相关系数r见图9。
9、M1型细胞因子IL-1R1与RA疾病ROC曲线
ROC曲线结果显示，IL-1R1与RA疾病ROC曲线下面积为0.898(95％CI:0.78-1.00，P<0.01)。
说明M1型细胞因子IL-1R1可以作为协助诊断RA的分子标志物。见图10。
10、M1型细胞因子IFN-γ与RA疾病ROC曲线
ROC曲线结果显示，IFN-γ与RA疾病ROC曲线下面积为0.739(95％CI:0.554-0.925，P<0.05)。说明M1型细胞因子IFN-γ可以作为协助诊断RA的分子标志物。见图11。
11、M1型细胞因子iNOS2与RA疾病ROC曲线
ROC曲线结果显示，iNOS2与RA疾病ROC曲线下面积为0.667(95％CI:0.464-0.869)。
说明M1型细胞因子iNOS2可以作为协助诊断RA的分子标志物。见图12。
12、M2型细胞因子MRC1指标与RA疾病ROC曲线
ROC曲线结果显示，MRC1与RA疾病ROC曲线下面积为0.656(95％CI:0.460-0.852)。
说明M2型细胞因子MRC1可以作为协助诊断RA的分子标志物。见图13。
综上所述，本发明发现M1型巨噬细胞因子IL-1R1、IFN-γ、iNOS2在临床RA患者血清中的含量显著高于健康者，M2型巨噬细胞因子MRC1在临床RA患者血清中的含量显著低于健康者。与各炎症指标显著相关，并通过ROC曲线分析发现M1型巨噬细胞因子IL-1R1、IFN-γ、iNOS2，联合M2型巨噬细胞因子MRC1作为分子生物标志物在类风湿关节炎的诊断、预后评估和治疗监测上具有较高的效益。
以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种M1型巨噬细胞因子联合M2型巨噬细胞因子作为生物标志物在制备或筛选类风湿关节炎诊断试剂中的用途，其特征在于，所述试剂用于测定体液样品中M1型巨噬细胞因子IL-1R1、IFN-γ、iNOS2以及M2型巨噬细胞因子MRC1的表达量，所述体液样品选自血清、血浆、血液中的至少一种，所述体液样品中M1型巨噬细胞因子IL-1R1、IFN-γ、iNOS2的表达量与类风湿关节炎的严重程度正相关，M2型巨噬细胞因子MRC1的表达量与类风湿关节炎的严重程度负相关。
2.一种检测M1型巨噬细胞因子联合M2型巨噬细胞因子存在的试剂在制备用于诊断类风湿关节炎的药剂中的用途，其特征在于，所述试剂用于测定体液样品中M1型巨噬细胞因子IL-1R1、IFN-γ、iNOS2以及M2型巨噬细胞因子MRC1的表达量，所述体液样品选自血清、血浆、血液中的至少一种，所述体液样品中M1型巨噬细胞因子IL-1R1、IFN-γ、iNOS2的表达量与类风湿关节炎的严重程度正相关，M2型巨噬细胞因子MRC1的表达量与类风湿关节炎的严重程度负相关。
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