CN101377492A - 胱抑素c测定试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种检测血清或血浆中胱抑素C的胶乳增强型免疫比浊试剂盒。该试剂盒采用胶乳包被的抗胱抑素C的抗体，与待测胱抑素C发生连锁反应，胶乳通过免疫反应一层一层聚集形成不溶性免疫颗粒复合物，胶乳的粒径发生改变引起浊度明显变化，用光透射强度(570nm)或光散射强度检测该变化，从用已知浓度胱抑素C标准品做出的标准曲线得出样本中目标检测物胱抑素C的浓度。本发明所述试剂盒包含试剂R1，试剂R2，胱抑素C标准品。本发明的试剂测定胱抑素C是通过胶乳凝集反应法进行的，是测定肾小球滤过率GFR的理想的内源性标记物，且较肌酐更为敏感和早期。使用本发明的方法灵敏度较高保证能够检测极低水平的胱抑素C，具有很高的临床应用价值。

Description

胱抑素C测定试剂盒

技术领域

本发明属于医学免疫体外诊断领域，涉及一种免疫比浊检测试剂，进一步地，本发明涉及一种胶乳颗粒增强型胱抑素C检测试剂盒。

背景技术

胱抑素C(CystatinC)是一种低分子量蛋白质，可由机体所有有核细胞产生，产生率恒定。循环中的胱抑素C仅经肾小球滤过而被清除，是一种反映肾小球滤过率变化的理想的内源性标志物，而肾小球的滤过率(glomerular filtration rate，GFR)是监测肾功能的一个重要指标，尤其对于肾移植的病人，快速准确的掌握肾小球滤过率的变化是十分重要的。此外由于胱抑素C分子量大于肌酐，且带正电荷，所以它更容易反映肾小球滤过膜通透性的早期变化，可以在肾小球滤过率轻微降低时升高，较肌酐更敏感，作为肾功能试验优于血清肌酐，具有重要的临床应用价值。

胱抑素C，是一种由120个氨基酸残基组成的分子量仅13KDa的低分子量分泌性蛋白质，是半胱氨酸蛋白酶抑制物超家族的成员之。胱抑素C基因5′侧翼序列与“看家基因”的启动子区具有相同的特性，也属于“看家基因”即此基因在所有组织恒定持续地转录及表达，无组织学特异性，广泛地存在于各种体液中，如脑脊液、血液、唾液、精浆等，机体胱抑素C产生率相当恒定。而胱抑素C是一种低分子量蛋白质，可经肾小球自由滤过，肾脏是清除循环中胱抑素C的唯一器官，所以血清胱抑素C浓度主要由GFR决定，由此可见胱抑素C是一种理想的反映GFR变化的内源性标志物。

临床研究低分子量蛋白质(β₂-微球蛋白、视黄醇结合蛋白、胱抑素C)浓度与GFR(⁵¹Cr-EDTA清除率或其金标准^99mTc-DTPA清除率)的相关性，血清胱抑素C、肌酐浓度诊断异常GFR的敏感性分别为78.1％及57.1％，各自浓度倒数与GFR(⁵¹Cr-EDTA清除率)的相关系数分别为：0.81、0.50。表明胱抑素C是低分子量蛋白质中与GFR最相关的内源性标志物，甚至优于血清肌酐。血清β₂-微球蛋白浓度由于在炎症、肿瘤及免疫疾病时也可升高，故不是理想的GFR内源性标志物。而胱抑素C即使在炎症状态下，其产生率也不会改变，血清浓度受年龄、性别、疾病的病情变化的影响较小。说明胱抑素C的诊断准确性明显优于血清肌酐。

免疫浊度测定的基本原理是：抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。当反应液中保持抗体过量时，形成的复合物随抗原量增加而增加，反应液的浊度亦随之增加，与一系列的标准品对照，即可计算出待检测物的含量。但含量低的分子量小的抗原抗体复合物极难形成浊度，除非放置较长时间；如形成较大的复合物，则抗原和抗体用量也较大，显然不符合微量化的要求。于是发展了免疫胶乳浊度测定法，是在胶乳凝集定性试验基础上发展建立的-种非放射性均相免疫浊度测定法，其基本原理是：将抗体吸附在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上，当遇到相应抗原时，则使胶乳颗粒发生凝集。单个胶乳颗粒在入射光波之内不阻碍光线透过，两个或两个以上胶乳颗粒凝聚时则使透过光减少，这种减少的程度与胶乳颗粒凝聚的程度呈正比，当然也与待测抗原量呈正比，由此可测出标本中待测物的含量。

由于血清中胱抑素C浓度较低，故其测定方法需较高的分析灵敏度及特异性。最早采用单向免疫扩散法(RID)及酶免疫测定法(EIA)对胱抑素C含量进行测定，而这两种方法不仅费时，检测限也较差。较简单且更灵敏的放射、荧光及各种酶免疫测定(RIA、FIA及EIA)的方法能改善胱抑素C测定的可靠性，但测定时间仍较长，无法常规应用，更无法用于急诊测定。以上各种测定方法均属非均相测定方法，很难自动化，因此限制了胱抑素C的广泛临床应用。采用上述的胶乳免疫均相测定方法，即在胶乳颗粒上包被抗体，与抗原结合时颗粒发生凝集，此方法很容易自动化。Kabanda等于1994年报道的测定胱抑素C的胶乳颗粒凝集法是一种颗粒计数免疫测定法。Kyhse andersen等于同年报道了一种颗粒增强透射免疫比浊法(particle-enhancedturbidimetric immunoassay，PETIA)，使胱抑素C测定的时间缩短至5min左右，且可在自动生化分析仪上进行，使胱抑素C测定的常规应用成为可能。

单纯就检测灵敏度而言，RID法最差，而EIA、RIA及FIA法均优于PETIA及PENIA法。由于RIA法存在放射性污染，FIA法需昂贵的仪器，以及RIA、FIA、EIA法测定时间长，且不能全自动化，无法用于临床大批量标本的测定。PETIA及PENIA法虽然检测灵敏度差些，但仍可达150μg/L左右，远远低于健康人血清胱抑素C浓度的下限值，可满足临床需要；这两种测定方法基本上不受血红蛋白、胆红素、类风湿因子、甘油三酯的影响，回收率可达95％～109％，批内及批间变异系数均较小(<4.5％)；加上这两种方法可全自动化，故在血清胱抑素C测定的常规临床应用中可首选PETIA或PENIA法。

本发明采用胶乳颗粒增强透射免疫比浊法即PETIA检测血清或血浆中胱抑素C含量。采用胶乳包被的抗胱抑素C的抗体，与待测标本中的胱抑素C发生凝集反应，用光透射强度检测这种变化，以胱抑素标准品的标准曲线得出样本中目标检测物胱抑素C的浓度。使用本发明的方法灵敏度较高保证能够检测极低水平(0.1mg/L)的胱抑素C，具有很高的临床应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种特异的高灵敏度的能够测定0.1mg-8mg的胱抑素C的含量的胶乳颗粒增强型胱抑素C测定试剂盒，所述的试剂盒包含试剂R1，试剂R2，所述的试剂R1为含有多聚物的缓冲液；所述的试剂R2为结合抗人胱抑素C抗体的聚苯乙烯胶乳溶液，胶乳颗粒直径为50-150nm，置于合适的缓冲液。

进一步的，在本发明所述的胶乳颗粒增强型胱抑素C测定试剂盒试剂R1中，所述的多聚物包括TritonX，Tween，E70C或聚氧乙烯类多聚物等；在试剂R2中，结合有抗人胱抑素C抗体的聚苯乙烯胶乳溶液的含量为0.2-2.0mg/mL。更进一步的，在本发明所述的胶乳颗粒增强型胱抑素C测定试剂盒，试剂R1中，所述的多聚物包括TritonX，Tween，E70C或聚氧乙烯类多聚物等其含量为0.1-5.0％(重量体积比)。更进一步的，试剂2中胶乳与抗人胱抑素C抗体的包被实验，可以采用物理吸附法或化学交联法制备，物理吸附法更为优化。

在本发明所述的胶乳颗粒增强型胱抑素C测定试剂盒，其中还包括胱抑素C试剂的参考标准品。进一步的，所述的胱抑素C试剂的参考标准品，即胱抑素C含量为0.5，1.0，2.0，4.0，8.0mg/L的五个梯度标准品。进一步的，所述的胱抑素C试剂的参考标准品，为添加重组人胱抑素C纯品的人血清或其它类似血清基质的液体。

进一步的，在本发明中，胱抑素C测定试剂盒中，试剂R1，R2的缓冲液包括但不限于TRIS缓冲液或甘氨酸缓冲液，以及其它具有相似性质的缓冲液。缓冲液的pH值为6.5-8.5，进一步缓冲液pH值7.0-8.0更为优化。

本发明采用胶乳颗粒增强透射免疫比浊法即PETIA，是一种间接凝集试验，其原理是包被了抗原或抗体的胶乳颗粒即免疫胶乳，与标本中相应的抗体或抗原发生免疫后，形成凝集颗粒，凝集物的形成使体系中产生一定的浊度，且与目的检测物的浓度成正相关，测定特定波长下反应体系得浊度，通过标准曲线(该曲线为标准物浓度与浊度关系曲线)即可测出目的检测物的浓度。该技术的关键在于两个方面:首先是选择适用的胶乳，其大小(直径)要稍小于波长，用500nm波长者，选择100nm颗粒较适合；用585nm波长者，则选用100～200nm颗粒为好；其次是采用合适的方法将聚苯乙烯胶乳包被目的抗体，常有的包被方法有物理吸附法和化学交联法。本发明两种方法均可采用，其中物理吸附法更为经济，简便和稳定，为更优化推荐方法。

本发明中，采用聚苯乙烯胶乳包被的抗胱抑素C的抗体，与待测标本(血清或血桨)中的胱抑素C发生结合反应，形成免疫复合物，用光透射强度检测这种变化，以胱抑素标准品的标准曲线得出样本中目标检测物胱抑素C的浓度。使用本发明的方法灵敏度较高保证能够检测极低水平的胱抑素C，具有很高的临床应用价值。本试剂为液体双试剂，具有特异性好，灵敏度高，准确性好及抗干扰能力强等优点，可用于检测血清或血浆中胱抑素C的浓度，适用于临床全自动生化分析仪。

附图说明

图1是采用本发明胶乳增强型胱抑素C试剂盒测定目标蛋白含量的方法示意图。

图2显示5种不同含量的胱抑素C参考标准的标准曲线，每个点代表不同含量的胱抑素C参考标准，其中X轴表示胱抑素C的含量，Y轴表示吸光度。

图3分别采用本发明试剂和A公司的胱抑素C胶乳增强型试剂，采用日立全自动生化分析仪对50份人血清(包含正常和异常标本)按各自参数同时进行测定，对测定值进行相关分析。其中X轴表示的是本发明试剂测定的病人血清结果；Y轴表示的是某公司试剂测定的病人血清结果，相关系数R²＝0.9919，回归方程为y＝1.1119x-0.2466。

表1，2本发明试剂和A公司试剂灵敏度实验结果，计算结果为我公司试剂检测灵敏度可达0.1mg/L较A公司试剂更好(0.25mg/L)。

表3本发明试剂抗干扰性实验结果。结果显示各项抗干扰指标均优于对比A公司试剂。

具体实施方式

实施例1 检测试剂及标准制备及测定方法

本发明检测试剂盒及标准所需主要原料如下:

1 兔抗人胱抑素C多克隆抗体，委托本公司按照常规方法自制，该抗体仅与人胱抑素C反应，与其他抗原无免疫交叉反应，效价能够满足本试剂要求。

2 聚苯乙烯胶乳，市场上有许多商品化的胶乳可供选择，包括美国sigma公司，日本UNF公司；可选择多种直径的胶乳颗粒，本实施例仅仅示例性的采用了直径为100-150nm的乳胶颗粒进行实验，则相应的试剂检测主波长为570nm。

3 重组人胱抑素C纯品(购自Dako公司)，用于制备本试剂所需标准品。

主要试剂和参考标准品配制如下：

试剂R1为0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.2)，向该缓冲液中分别添加NaCl、Tritonx100、PEG6000和NaN₃，使各种成分的终浓度分别为0.9％(重量体积比)的NaCl，终浓度为0.5％(重量体积比)的Tritonx100，终浓度为5％(重量体积比)的PEG6000，终浓度为0.5％(重量体积比)NaN₃。各种成分可以在室温下依次添加，或者同时添加，或者分别单独包装并于检测之前在即时配制。

试剂R2：用0.1M磷酸缓冲液(pH 7.2)在室温下稀释兔抗人胱抑素C多克隆抗体和聚苯乙烯胶乳(抗体和胶乳的比例1：1左右)，将两者混匀后室温吸附1小时(即物理吸附法)，加入封闭液(含0.1％BSA磷酸缓冲液)封闭1小时，离心去上清，用0.1M磷酸缓冲液稀释至合适浓度(0.1％-5％)并加入适当的本领域技术人员已知的防腐剂。获得试剂2，其为乳白色溶液。

胱抑素C试剂参考标准品制备：用重组人胱抑素C蛋白(购自Dako公司)溶于制备的类似人血清基质的溶液(Nacl 0.9％，BSA 0.1％，NaN₃0.5％，Tris-Hcl pH8.0)，制备不同浓度的标准品。以进口的胱抑素C标准品(购自Dako公司)为原始标准，采用胶乳凝集反应法，分别对制备的标准品进行测定和调整，调整合适后分别检测20次，求出均值达到标准品所要求的浓度，即0.5，1.0，2.0，4.0和8.0mg/L。

胱抑素C试剂测定方法(如图1所示)，分析方法：两点终点法，即试剂R1：试剂R2用量分别为300ul和100ul，样本用量3ul；300ul试剂R1加入3ul样本，于37C 5min后加入100ul试剂R2，即开始读点，反应5min后读取另一点；检测波长分别主波长570nm副波长800nm。

采用本试剂及上述测定方法，采用自动奥林巴斯AU400生化分析仪测得的5种不同含量的胱抑素C标准品(自制)的标准曲线(如图2所示)，每个点代表一个含量的参考标准品。其中X轴表示胱抑素C的含量(mg/L)；Y轴表示的是吸光度。这些自制的5种不同含量的胱抑素C标准品将用作下一步检测的标准品。

实施例2：检测试剂的相关性试验及灵敏度试验

1 相关性试验

分别使用本发明试剂(具体配方同实施例1)和商售可获得的A公司的胱抑素C胶乳增强型试剂，采用奥林巴斯AU400全自动生化分析仪对50份人血清(包含正常和异常标本)按各自参数同时进行测定，我们试剂的主要参数同上即胱抑素C试剂测定方法，对测定值进行相关分析(结果见图3，X，Y轴均为测定值(胱抑素C的含量mg/L)。两种试的相关系数为R²＝0.9919，回归方程为y＝1.1119x-0.2466。结果表明本试剂与进口试剂测定病人血清相关性良好，具有很好的特异性和准确性。此外本试剂不仅适用于奥林巴斯AU400全自动生化分析仪还适用于其他全自动和半自动生化分析仪，具体参数可据主要参数做适当调整。

2灵敏度试验

表1表2分别显示的是本发明检测试剂和对照A公司试剂的灵敏度试验结果，具体操作方法同上。

结果显示本发明试剂的灵敏度可达0.1mg/L，优于对照A公司试剂。

表1：

本试剂最低检测限(LLD)＝2.55+3*1.731291＝4.2813

灵敏度：0.8×4.2813/33.6951＝0.1mg/L

表2：

 

次数	水Δab	低值样本Δab(理论值0.58mg/l)
			1	117	631
2	147	537
			3	125	666
4	130	549
			5	233	631
6	68	615
			7	36	632
8	135	646
			9	117	697
10	179	717
			11	112	698
12	64	614

 

13	146	755
			14	193	724
15	139	646
			16	61	751
17	62	689
			18	83	647
19	160	687
			20	3	661
均值	115.5	659.65
			SD	56.08781	57.8958

A公司试剂最低检测限(LLD)＝115.5+3×56.08781＝283.76

灵敏度：0.58×283.76/659.65＝0.25mg/L

实施例3：检测试剂的抗干扰性试验

本发明对检测试剂(具体配方同实施例1)和对照试剂同时进行了抗干扰性试验，试验结果如表3所示，加入干扰物后，对各种干扰物的相对误差均在10％以内。对照试剂对各种干扰物的相对误差都超过10％。显示即使检测样品中存在一定浓度的干扰物包括血红蛋白、胆红素、Vc、甘油三酯等，对本发明的测定结果影响很小。

表3：

 

干扰物	本试剂	相对误差	A公司试剂	相对误差
					样本+水	0.48	-----	0.61	----
样本+1600mg/dl甘油三酯	0.49	2.08	0.74	21.3
					样本+460mg/dl血红蛋白	0.48	0	0.71	16.39
样本+50mg/dlVC	0.48	0	0.71	16.39
					样本+18.2mg/dl胆红素	0.51	6.25	0.77	26.23

Claims (10)

1.一种胶乳增强型胱抑素C检测试剂盒，其特征在于，包含试剂R1，试剂R2，所述的试剂R1为含有多聚物的缓冲液；所述的试剂R2为结合抗人胱抑素C抗体的聚苯乙烯胶乳溶液，胶乳颗粒直径为50-150nm，置于合适的缓冲液。

2.根据权利要求1所述的胶乳增强型胱抑素C检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂R1，R2的缓冲液是TRIS缓冲液或甘氨酸缓冲液，缓冲液的pH值为6.5-8.5。

3.根据权利要求2所述的胶乳增强型胱抑素C检测试剂盒，其特征在于所述的缓冲液的pH值为7.0-8.0。

4.根据权利要求1所述的胶乳增强型胱抑素C检测试剂盒，其特征在于，在试剂R1中，所述的多聚物包括TritonX，Tween，E70C或聚氧乙烯类多聚物等；在试剂R2中，结合有抗人胱抑素C抗体的苯聚乙烯胶乳溶液的含量为0.2-2.0mg/mL。

5.根据权利要求1所述的胶乳增强型胱抑素C检测试剂盒，其特征在于试剂2中胶乳与抗人胱抑素C抗体的包被实验采用物理吸附法或化学交联法制备。

6.据权利要求1所述的胶乳增强型胱抑素C检测试剂盒，其特征在于试剂2中胶乳与抗人胱抑素C抗体的包被实验采用物理吸附法制备。

7.根据权利要求4所述的乳胶增强型胱抑素C检测试剂盒，其特征在于，在试剂R1中，所述的多聚物包括TritonX，Tween，E70C或聚氧乙烯类多聚物，其含量按按体积比为0.1-5.0％。

8.根据权利要求书1所述的胶乳增强型胱抑素C检测试剂盒，其特征在于，其中还包括胱抑素C试剂的参考标准品。

9.根据权利要求8所述的胶乳增强型胱抑素C检测试剂盒，其特征在于所述的胱抑素C试剂的参考标准，为胱抑素C浓度分别为0.5，1.0，2.0，4.0，8.0mg/L的五支标准品。

10.根据权利要求8所述的胶乳增强型胱抑素C检测试剂盒，其特征在于所述的胱抑素C试剂的参考标准，为添加重组人胱抑素C纯品的人血清或其它类似血清基质的液体。

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