CN102590497B - 胱氨酸蛋白酶抑制剂c检测试剂盒 - Google Patents
胱氨酸蛋白酶抑制剂c检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒,该试剂盒包括试剂R1、试剂R2,试剂R1为促进抗体抗原特异性结合的反应液,试剂R2是抗人胱抑素C抗体包被的聚苯乙烯胶乳颗粒混合物,置于适当的缓冲液中。试剂R2中聚苯乙烯胶乳颗粒混合物为大直径聚苯乙烯胶乳颗粒和小直径聚苯乙烯胶乳颗粒的混合物。该试剂盒检测灵敏度高,准确度高,检测范围内线性好,稳定性好,生产成本低。
Description
技术领域
本发明涉及一种医学检测试剂盒,具体涉及一种运用胶乳增强免疫比浊法测定人血清中胱氨酸蛋白酶抑制剂C的试剂盒。
背景技术
胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cys-c,分子量13kD),简称胱抑素C,是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族中的一员。在人体组织,器官中几乎所有的有核细胞都会生产胱氨酸蛋白酶抑制剂C。由于该蛋白质分子量小,在正常的肾脏中,它能够自由地通过肾小球膜被滤出,然后近乎全部地被肾脏近端小管上皮细胞重吸收和分解。因此,可以通过血液中胱抑素C的浓度来反映肾小球的过滤速率。而且,胱抑素C血清浓度不受敏症过程、性别、年龄和肌肉重量影响的特点使它成为一种优于血清肌酐和β2-微球蛋白的反应肾小球过滤速率的理想的内源性标记物。最近,大量研究表明血清胱抑素C是一种能比血清肌酐更好的反映出肾小球过滤速率的标记物,从而用来早期诊断肾脏疾病。检测血清中胱抑素C浓度的方法包括有酶联免疫法,免疫比浊法,放射免疫法,荧光免疫测定法等,但是除了上述的测定方法外,现今应用最多的就是胶乳增强免疫透射比浊法,其原理是将抗体通过化学交联或者物理吸附的方法标记在表面带有羧基或没有带羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒上,抗体和待测物中相应的抗原结合形成复合物后,使包被抗体的胶乳颗粒之间发生凝集。胶乳凝集的越多,越会阻碍光线的透过性,反应液的吸光度就越大。所以,反应液吸光度的大小和胶乳颗粒凝集程度是成正比的,更近一步地来说,待测物中抗原的浓度是和反应吸光度成正比的。由此采用胶乳颗粒增强的免疫透射比浊法来测定血清中胱抑素C的含量。
该胶乳增强免疫透射比浊法可以通过物理吸附法把多克隆抗体标记在不带羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒上,但是采用物理吸附法得到的致敏胶乳颗粒稳定性比较差,而且物理吸附的效果也不好,很容易会造成抗体从胶乳颗粒表面脱落。为了避免上述的物理吸附的弱点,目前通过化学交联法把抗体标记在表面带羧基的胶乳颗粒上。通过化学共价交联,抗体和胶乳的结合力更强,有抗体包被的胶乳颗粒稳定性更高。通过上述化学交联方法制备的检测试剂盒,会造成灵敏度高,特异性好、准确性高、抗干扰能力高及生产成本低的优点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种空白吸光度低;检测灵敏度,准确度高;精密度好,检测范围内线性好,稳定性好;生产成本低的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒。
本发明所采用的技术方案为:
一种胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒,该试剂盒包括试剂R1、试剂R2,所述试剂R1为促进抗体抗原特异性结合的反应液;所述试剂R2是抗人胱抑素C抗体包被的聚苯乙烯胶乳颗粒混合物,置于适当的缓冲液中。本发明上述试剂盒中试剂R1与试剂R2的容积比为5∶1。
所述试剂R1的各组分及浓度范围为:
作为优选,所述试剂R1的各组分及浓度范围为:
作为进一步优选,所述试剂R1的各组分及浓度范围为:
作为优选,所述试剂R2中的缓冲液为甘氨酸。
所述试剂R1和试剂R2中甘氨酸的pH值为5.5-8.5,进一步优选为6.5-7.5。
作为优选,所述试剂R2中聚苯乙烯胶乳颗粒混合物为大、小两种直径的聚苯乙烯胶乳颗粒的混合物(该聚苯乙烯胶乳颗粒为市售常规产品),大直径聚苯乙烯胶乳颗粒平均粒径为130nm~300nm,小直径聚苯乙烯胶乳平均粒径为20nm~60nm,其中聚苯乙烯胶乳颗粒混合物的含量为0.1~0.5%,大直径聚苯乙烯胶乳颗粒∶小直径聚苯乙烯胶乳颗粒=8~9∶2~1。
本发明上面所述的大直径胶乳颗粒,其平均粒径在130nm~300nm之间,小直径胶乳颗粒,其平均粒径在20nm~60nm之间,在制备试剂的过程中,使用超滤的方法以达到清洗胶乳和置换缓冲液的目的。对于大直径胶乳颗粒来说,优点是胶乳表面积跟自身体积的比率小,很容易在表面包被的抗体和抗原形成复合物后产生明显的凝集现象,从而导致吸光度的变化。因此能测得浓度比较低的分析物。缺点是由于表面积跟自身体积比率小的原因,单位体积内表面羧基含量少,造成单位体积内抗体包被量小,很容易造成抗原过剩的结果。因此很难测浓度高的分析物。小直径胶乳表面积跟自身体积比率大,对测量结果的影响刚好和大胶乳相反。所以本发明在制备试剂盒过程中,选用大小两种胶乳颗粒的混合物,这样能使试剂的空白吸光度低,灵敏度高,线性好。
本发明上面所述抗人胱抑素C抗体为兔抗人胱抑素C多克隆抗体。
试剂R2中抗人胱抑素C和聚苯乙烯胶乳颗粒包被实验,由于是表面带羧基的胶乳颗粒,采用化学交联法制备。用化学交联法制备的抗体胶乳结合力强,抗体不容易脱落。结构比较稳定。
本发明上述试剂盒除包括试剂R1和试剂R2外,还包括胱抑素C试剂的参考标准品。所述参考标准品为添加人重组胱抑素C蛋白的人血清或者类似血清基质的液体,并且过滤除菌。类似血清基质的液体即类似人血清基质的溶液,如0.1%BSA,0.9%NaCl,0.2%NaN3,15mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)。人重组胱抑素C蛋白由大肠杆菌表达,经过亲和和离子交换纯化后得到。所述胱抑素C试剂的参考标准品有5个浓度,分别为0.5mg/L,1mg/L,2mg/L,4mg/L,8mg/L。
本发明胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒采用胶乳增强免疫比浊法(PETIA)测定血清中胱抑素C含量,其原理是包被了抗原或抗体的胶乳微粒,与标本中相应的抗原发生免疫反应后,形成聚集颗粒,在一定波长下,通过测定聚集物形成所产生的浊度,即可测出标本中被检物的含量。进一步的,所述本发明中,血清中的胱抑素C与结合在胶乳颗粒表面的兔抗人胱抑素C抗体结合,产生抗原抗体反应,使胶乳颗粒形成聚集,在546nm、700nm波长处测定反应吸光度,对照标准曲线可求出标本中胱抑素C的含量。
本发明的优点和有益效果:
1.本发明的试剂盒是一种灵敏度高、特异性好、准确性高、抗干扰能力强及生产成本低的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒。
2.本发明试剂盒中的试剂R2选用大小两种聚苯乙烯胶乳颗粒的混合物,充分发挥两者的优势,克服了大直径胶乳颗粒单位体积内抗体包被量小、小直径胶乳颗粒不易产生凝集现象,从而使试剂的空白吸光度低,灵敏度高,线性好。
附图说明
图1所示的是本发明胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒的胱抑素C标准品的标准曲线图;
图2所示的是本发明胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒的线性分析图;
图3所示的是本发明胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒的相关性分析图。
具体实施方式
下面通过实施例进一步详细描述本发明,但本发明不仅仅局限于以下实施例。
实施例1 胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒标准制备和测定方法
本发明的试剂盒涉及试剂的主要原材料如下:
1.由本公司按照常规方法自制的兔抗人胱抑素C多克隆抗体,亲和纯化后采用间接ELISA法测定效价为1∶100000,满足本试剂的要求。该抗体特异性好,和其它抗原没有交叉反应。
2.本发明仅示例性的采用两种直径为100-190nm,20-60nm带羧基基团的聚苯乙烯胶乳颗粒进行实验。相应的检测双波长为主波长546nm,副波长700nm。
3.重组人胱抑素C蛋白由本公司自制,经过大肠杆菌表达,亲和和离子交换纯化后的胱抑素C蛋白,纯度高,稳定性好,用于作为本试剂的标准品。
主要试剂和参考标准配制如下:
试剂R1为20mM甘氨酸缓冲液(pH7.5)。向该缓冲中分别加入NaCl,BSA,吐温-20,PEG6000和叠氮钠。各组分的终浓度分别为0.9%NaCl,0.02%吐温-20,0.1%BSA,2%PEG6000和0.1%叠氮钠。向缓冲液里添加完各组分后,用1N NaOH调节pH值到7.5。
试剂R2:用100mM pH5.5的MES(2-吗啉乙磺酸缓冲液溶液)稀释聚苯乙烯胶乳颗粒。该试剂为乳白色溶液。往聚苯乙烯胶乳溶液中加入EDAC(聚苯乙烯胶乳颗粒和EDAC的比列为10∶1),混合均匀后,室温下反应15min。激活聚苯乙烯胶乳颗粒表面的羧基。反应后离心去上清液后,用15mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)清洗聚苯乙烯胶乳颗粒。聚苯乙烯胶乳颗粒最终悬浮于15mM磷酸盐缓冲液中。在室温下,用15mM磷酸盐缓冲液稀释兔抗人胱抑素C多克隆抗体,最后加入到聚苯乙烯胶乳颗粒悬浮液中,将两者混匀后在室温下反应3小时(抗体序列中的NH残基和活化后的聚苯乙烯胶乳颗粒表面羧基进行化学交联),之后加入封闭液(含0.1%BSA甘氨酸缓冲液)封闭1小时,离心去上清,用20nm甘氨酸缓冲液稀释至合适浓度后(0.1%-1%)获得试剂R2。
胱抑素C试剂参考标准品制备:纯化好的重组人胱抑素C蛋白,用相应的类似人血清基质的溶液(0.1%BSA,0.9%NaCl,0.2%NaN3,15mM磷酸盐缓冲液pH7.5)进行稀释和过滤除菌,所述的胱抑素C校准品中胱抑素C含量分别控制在0.5mg/l,1mg/l,2mg/l,4mg/l,8mg/l,这些校准品均为无色透明液体。以进口的Dako公司的胱抑素C试剂盒,分别对制备的标准品进行测定和调整,调整合适后分别检测20次,求出平均值达到标准品所要求的五个梯度的浓度,分别为0.5mg/l,1mg/l,2mg/l,4mg/l,8mg/l。
胱抑素C试剂测定方法是两点终点法,检测波长分别为主波长546nm,副波长700nm。试剂R1和试剂R2的用量分别为250μl和50μl。样本用量为3μl;反应方向向上,测定温度为37℃。样本与试剂R1混匀后,置37℃孵育5分钟,之后加入试剂R2,即开始读点,反应5min后读取另一点。使用日立7060自动生化分析仪测得5种不同含量的胱抑素C标准品的标准曲线(如图1所示),其中X轴为胱抑素C含量mg/l,Y轴为反应吸光度。
实施例2胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒各项性能指标测试
1.灵敏度试验
测定6种不同胱氨酸蛋白酶抑制剂C含量的样品,每个样品测10次,通过计算均值和SD值(标准差值),从表1可见,本发明检测试剂盒的灵敏度为0.08mg/L。
表1
CYS-C(mg/L) | 测定次数 | 均值 | 2.6SD | M+2.6SD | M-2.6SD |
0 | 10 | 0.02 | 0.031 | 0.05 | -0.02 |
0.04 | 10 | 0.05 | 0.044 | 0.10 | 0.01 |
0.08 | 10 | 0.10 | 0.031 | 0.13 | 0.07 |
0.12 | 10 | 0.15 | 0.058 | 0.21 | 0.10 |
0.16 | 10 | 0.19 | 0.044 | 0.23 | 0.14 |
0.20 | 10 | 0.22 | 0.032 | 0.25 | 0.19 |
2.高值线性测定
添加重组胱抑素C蛋白于无胱抑素C的空白血清中,胱抑素C在血清中的终浓度为15mg/l。用0.9%Nacl稀释血清,得到5个含不同浓度胱抑素C的血清样本。胱抑素C理论浓度分别为0.5mg/l,1mg/l,2mg/l,4mg/l,8mg/l。把空白血清作为胱抑素C浓度为0的样本。每个样品用本发明中的胱抑素C试剂盒测3次,取均值。对测定值进行相关分析,从表2可见,本发明检测试剂盒的最高检测范围可达到8mg/L,见图2,Y轴实测值,X轴理论值(胱抑素C的含量mg/L),相关系数的R2=0.999,回归方程为Y=1.013x-0.010。说明本发明中胱抑素C试剂盒线性好。
表2
CYS-C理论值(mg/L) | CYS-C实际值(mg/L) | |
1 | 0 | 0 |
2 | 0.5 | 0.48 |
3 | 1 | 1.02 |
4 | 2 | 2.05 |
5 | 4 | 3.97 |
6 | 8 | 8.12 |
3.精密度试验
用本发明中的胱抑素C试剂盒检测低、中、高值3个胱抑素C含量的人血清样品各20次,测定本发明检测试剂盒的批内精密度。使用3个批号试剂盒分别测定1个人血清样品20次,计算本发明检测试剂盒的批间相对极差。结果表明,本发明检测试剂盒的批内精密度为1.79%,1.41和2.99%(见表3),而批间相对极差为3.3%(见表4)。
表3
样品1 | 样品2 | 样品3 | |
测定次数 | 20 | 20 | 20 |
平均值(mg/L) | 0.54 | 3.40 | 6.87 |
最小值(mg/L) | 0.522 | 3.34 | 6.444 |
最大值(mg/L) | 0.56 | 3.498 | 7.206 |
标准差(SD) | 0.01 | 0.05 | 0.21 |
变异系数(CV%) | 1.79 | 1.41 | 2.99 |
表4
4.抗干扰性试验
在同一份人血清样品中分别加入不同含量的干扰物质后进行测定。加入干扰物质后的测定值除以加入干扰物质前的测定值即为影响率,试验结果表明游离胆红素,结合胆红素,血红蛋白,三酰甘油,类风湿因子的浓度分别在640μmol/L,640μmol/L,8g/L,10mmol/L以及160IU/mL以下时,它们对测定结果的干扰均在3%以下(见表5)。
表5
5.稳定性试验
在2-8℃贮存条件下,分别在0月、4月、8月和12月对同一血清样本进行测定,每个样本测10值(结果见表6)。血清样本分装后,储存于-20℃。4月,8月,12月与0月相比,测得值差异小,说明本发明的检测试剂盒在2-8℃贮存条件下可稳定一年。
表6
项目 | 0月 | 4月 | 8月 | 12月 |
试剂空白吸光度A0 | 0.6500 | 0.6635 | 0.6489 | 0.6723 |
样本测得值 | 0.9 | 0.890 | 0.882 | 0.873 |
CV(%) | 1.30 | 1.322 | 1.45 | 1.60 |
6.相关性试验
分别使用本发明胱抑素C检测试剂盒和商售可获得的某公司的胱抑素C胶乳增强型试剂盒,采用日立7060全自动生化分析仪对50份人血清(包含正常的异常标本)按各自设定的参数同时进行测定,(结果见图3,X、Y轴均为测定值,胱抑素C浓度单位为mg/L)。两种试剂的相关系数为R2=0.991,回归方程为y=0.991x+0.001。结果表明本发明中的试剂盒与进口试剂盒测定血清标本中胱抑素C浓度的相关性良好,具有很好的准确度。进一步,本试剂除了适用于日立7060全自动化分析仪,还可以用于其它的全自动或者半自动的生化分析仪。但是,本发明试剂盒和不同型号的生化仪使用时,具体测量参数可以根据主要参数做调整。
从上述实施例可知本发明的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒具有空白吸光度低,灵敏度高、特异性好、准确性好、抗干扰能力强及生产成本低的优点。
Claims (6)
1.一种胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒,其特征在于:包括试剂R1、试剂R2,所述试剂R1为促进抗体抗原特异性结合的反应液;所述试剂R2是抗人胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体包被的聚苯乙烯胶乳颗粒混合物,置于适当的缓冲液中;
所述试剂R1的各组分及浓度范围为:
所述试剂R2中聚苯乙烯胶乳颗粒混合物为大直径聚苯乙烯胶乳颗粒和小直径聚苯乙烯胶乳颗粒的混合物,大直径聚苯乙烯胶乳颗粒平均粒径为130nm~300nm,小直径聚苯乙烯胶乳平均粒径为20nm~60nm,大直径聚苯乙烯胶乳颗粒︰小直径聚苯乙烯胶乳颗粒=8~9︰2~1;
所述试剂R2中抗体包被胶乳的制备方法为化学交联法,具体为抗体序列中的氨基残基和活化后的聚苯乙烯胶乳颗粒表面羧基进行化学交联;
所述试剂R2中的缓冲液为甘氨酸。
4.根据权利要求1~3中任一权利要求所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒,其特征在于:所述甘氨酸的pH值为5.5-8.5。
5.根据权利要求4所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒,其特征在于:所述甘氨酸的pH值为6.5-7.5。
6.根据权利要求1所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒,其特征在于:还包括胱氨酸蛋白酶抑制剂C试剂的参考标准品,所述参考标准品为添加人重组胱氨酸蛋白酶抑制剂C蛋白的人血清或者类似血清基质的液体,人重组胱氨酸蛋白酶抑制剂C蛋白由大肠杆菌表达、经过亲和和离子交换纯化后得到;所述胱氨酸蛋白酶抑制剂C试剂的参考标准品有5个浓度,分别为0.5mg/L,1mg/L,2mg/L,4mg/L,8mg/L。
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