CN105372434A - 人血清淀粉样蛋白a检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种人血清淀粉样蛋白A检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括试剂R1、试剂R2，所述的试剂R1为适当的缓冲液；所述的试剂R2是用人血清淀粉样蛋白A抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒、置于适当的缓冲液中组成。本发明具有检测简单而快速、灵敏度高、准确性好、抗干扰能力强及生产成本低的优点。

Description

人血清淀粉样蛋白A检测试剂盒
技术领域
本发明属于医学免疫学领域，涉及一种免疫检测试剂，进一步地，本发明涉及一种人血清淀粉样蛋白A检测试剂盒。
背景技术
血清淀粉样蛋白A（serumamyloidAprotein，SAA)是一种急性时相反应蛋白，属于载脂蛋白家族中的异质类蛋白质，相对分子量约12000。在急性时相反应中，经IL-1、IL-6和TNF刺激，SAA在肝脏中由被激活的巨噬细胞和纤维母细胞合成，可升高到最初浓度的100-1000倍，但半衰期短，只有50分钟左右。血清淀粉样蛋白A与高密度脂蛋白(HDL)有关，它能在炎症期间调节高密度脂蛋白的代谢。血清淀粉样蛋白A一个特别重要的特性是其降解产物能以淀粉样蛋白A(AA)原纤维的方式沉积在不同的器官中，在慢性炎症疾病中这是一种严重的并发症。正常人血清SAA浓度平均值为2.33mg/L，SAA浓度的测定对于肾移植急性排异反应的诊断比血清Cr更为敏感，在排除感染的情况下，SAA的异常的升高对肾移植急性排异反应具有很大的诊断价值。
与C反应蛋白(CRP)类似，血清淀粉样蛋白A的含量浓度是反映感染性疾病早期炎症的敏感指标，有助于诊断炎症、评估其活性、监控其活动及治疗。但是，血清淀粉样蛋白A检测在诊断发生病毒感染、肾移植排斥反应的患者（特别是进行免疫抑制治疗的患者）以及用肾上腺皮质激素治疗的囊性纤维化患者方面，比C反应蛋白更确凿。研究发现，在患炎性关节炎的案例中，血清淀粉样蛋白A与疾病活动性的关系最密切。同时检测C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A能提高对感染的诊断灵敏度。对于淀粉样蛋白A淀粉样变性患者，以将血清淀粉样蛋白A水平回复至正常为宗旨的治疗，能改善病情。
现有的SAA检测方法主要是酶联免疫法，由于酶联免疫测定周期长，不能在自动生化分析仪上使用，不适合急诊的快速检测，是SAA检测试剂盒普及的弊端，而胶乳增强免疫比浊法操作简单，经济，可以在绝大多数医院的自动生化分析仪上使用，特别是急诊能实现快速定量检测，其基本原理是：将抗体包被在胶乳颗粒上，与相应抗原发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物所产生的浊度，即可测出标本中被检物含量。
而血清淀粉样蛋白A抗体包被到胶乳上，一般可以采用物理吸附法和化学偶联法，采用物理吸附法得到的致敏胶乳颗粒稳定性较化学偶联法要差，抗体容易从胶乳颗粒上脱落下来；而且用物理吸附法得到的胶乳，有可能受到类风湿性因子(RF)和嗜异性抗体的干扰，IgM、IgG型RF可以与包被在胶乳上的抗体的Fc段直接结合，从而导致检测结果假阳性或假阴性升高。目前采用的化学偶联法多为随机偶联法，因随机偶联的抗体随机偶联到抗体不同部位，将导致抗体损失结合力；所以，完全随机偶联会损失抗体大部分结合力，增加了抗体用量和生产成本。同时，若将上述方法得到的致敏胶乳颗粒用于检测试剂盒中，会造成特异性差、准确性低、抗干扰能力弱或生产成本高的缺陷。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种检测简单而快速、灵敏度高、准确性好、抗干扰能力强及生产成本低的人血清淀粉样蛋白A检测试剂盒。
本发明的技术方案为：一种人血清淀粉样蛋白A检测试剂盒，
所述的试剂盒包括试剂R1、试剂R2，所述的试剂R1为适当的缓冲液；所述的试剂R2是用血清淀粉样蛋白A抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒、置于适当的缓冲液中。
本发明上述试剂盒中R1和R2的容积比为4:1。
本发明所述的缓冲液包括但不限于PBS缓冲液、Tris缓冲液、
甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液、氯化铵缓冲液以及其他具有相似性质的缓冲液中的一种或几种。
本发明上述试剂盒中R1所用的缓冲液与配置R2所用的缓冲液只要为上面的缓冲液中的一种任意搭配均可。
本发明上面所述的聚苯乙烯胶乳颗粒(该聚苯乙烯胶乳颗粒为市售常规产品)，其平均粒径在0.01～1.5μm(10～1500nm)之间，粒径小于0.01μm时，胶乳颗粒聚集产生的光密度变化太小，结果很难达到试验敏感度要求，在制备试剂的时候，需要花费过多的离心时间，延长了试剂生产的时间，增加了试剂成本且不利于重复性。而粒径大于1.5μm的胶乳颗粒在测量高浓度检测物时，其聚集产生的光密度变化超过了检测限，结果很难获得对应于分析物浓度的光密度变化，而且颗粒太大会加速自聚集，导致分散性降低。胶乳颗粒粒径随着试验方法和设备的改变而改变。所选择的颗粒粒径最好是介于0.05～0.5μm(50～500nm)之间。
本发明上面所述的抗体包括但不限于多克隆抗体及单克隆抗体。
本发明所述的试剂R2是用血清淀粉样蛋白A抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，置于适当的缓冲液中组成，该试剂R2的制备步骤包括：
(1)胶乳颗粒的激活：在带有羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒(胶乳)中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺(EDAC)，混合反应后加入己二酸二酰肼，继续混合反应，得到激活的胶乳颗粒；
(2)抗体的氧化：用高碘酸钠将抗体非结合活性区域Fc端羧基氧化成醛基；
(3)抗体与胶乳颗粒的偶联：将步骤(1)激活的胶乳颗粒和步骤(2)氧化的抗体混合反应，待反应结束后，再加入葡萄糖封闭胶乳微球上未反应的基团，得到偶联抗体的胶乳微球即血清淀粉样蛋白A抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，置于适量的缓冲液中。
本发明上述制备方法各个步骤中物料配比为：步骤(1)中乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺∶胶乳(带有羧基的胶乳颗粒原料)＝0.5～5∶100(重量比)；己二酸二酰肼∶胶乳(带有羧基的胶乳颗粒原料)＝50～250∶100(重量比)；步骤(2)中高碘酸钠∶胶乳(带有羧基的胶乳颗粒原料)＝0.5～3∶100(重量比)；步骤(3)中抗体∶激活的胶乳颗粒＝2～22∶100(重量比)，葡萄糖∶激活的胶乳颗粒＝(25～50)∶100。加入的是原料胶乳，可以改成抗体：胶乳，都是重量比。
本发明所述胶乳增强免疫透射比浊法，其原理是包被了抗原或抗体的胶乳微粒，与标本中相应抗体或抗原发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物形成所产生的浊度，即可测出标本中被检物的含量。在本发明中，血清中的血清淀粉样蛋白A与结合在胶乳颗粒表面的抗血清淀粉样蛋白A抗体结合，产生抗原抗体反应，使胶乳颗粒形成聚集；在546nm，700nm波长处测定吸光度，对照标准曲线可求出血清淀粉样蛋白A的含量。
本发明的优点和有益效果：
1.本发明的试剂盒具有检测简单而快速、灵敏度高、准确性好、抗干扰能力强及生产成本低的优点。
2.本发明SAA试剂盒采用的检测方法为胶乳增强免疫比浊法，该方法解决了市场现有酶联免疫方法SAA试剂盒的急诊不适用性，使得SAA的检测更为经济、方便和快速，适用于绝大多数医院的自动生化分析仪，特别是对急诊能实现快速定量检测。
3.本发明试剂盒中的试剂R2的制备是采用一种抗原抗体反应试验方法，特别之处在于，本发明采用定向化学偶联法将SAA抗体包被到胶乳颗粒上；本发明将抗体的非结合活性区域的Fc端定向偶联到胶乳颗粒上，不易受到类风湿性因子(RF)和嗜异性抗体的干扰，大大提升了检测结果的准确性和可信性。而且该方法不会发生抗体结合力损失的情况，可大大减少抗体用量，降低了生产成本。
具体实施方式
下面通过实施例进一步详细描述本发明，但本发明不仅仅局限于以下实施例。
实施例1人血清淀粉样蛋白A检测试剂盒的制备
本发明的试剂盒涉及试剂的主要原材料如下：
1.血清淀粉样蛋白A抗体：采用间接ELISA法测定效价为1∶100000。
2.胶乳：本发明仅示例性的采用直径为100～200nm带羧基基团的聚苯乙烯胶乳颗粒进行实验。
本实施例的主要试剂的配制如下：
试剂R1：含1.5％PEG6000(聚乙二醇6000)，0.8％NaCl的氯化铵缓冲液。该试剂为无色透明溶液。
试剂R2：用抗血清淀粉样蛋白A抗体致敏胶乳颗粒。该试剂为乳白色溶液。
具体步骤如下：
1.取1ml(100mg/ml)胶乳，用0.1M(mol/L)，pH5.0的MES溶液(2-吗啉乙磺酸缓冲液)洗涤3次，超声分散；
2.加入0.2ml用0.1M，pH5.0的MES溶液新鲜配制的EDAC(10mg/ml)混合完全，室温混和15min；
3.加入0.8ml用0.1M，pH5.0的MES溶液新鲜配制的己二酸二酰肼(83mg/ml)，4℃反应过夜；
4.用0.1M，pH5.0的MES溶液洗涤2次，0.1M，pH7.5的磷酸盐溶液洗涤1次，超声分散备用；
5.取1.5ml抗体(3.9mg/ml)溶液，加入0.2ml用0.1M，pH7.5的磷酸盐溶液配制的高碘酸钠溶液(10mg/ml)，室温混合15min，
6.将步骤5中氧化好的抗体加入到步骤4中已激活的胶乳溶液中，4℃反应过夜；
7.加入0.32ml10％BSA(小牛血清白蛋白)溶液，4℃混合4h；
8.加入0.4ml10％葡萄糖溶液，4℃混合过夜；
9.用0.1M，pH7.5Tris溶液洗涤3次，加入0.1M，pH7.5Tris溶液(含1％BSA，0.2％NaN3的Tris缓冲液)至胶乳终浓度为0.25％。
实施例2人血清淀粉样蛋白A的测定
检测工具：日立7080型自动分析仪。
分析方法：两点终点法；主波长：546nm，副波长：700nm：样品量：2.0ul；R1：240ul；R2：60ul；校准方式：Logit-log5p；反应方向：上升；测定温度：37℃；样品与R1混匀5分钟时加入R2，立即读取第一点吸光度A1，5分钟后读取吸光度A2。反应吸光度的计算为A2与A1的校准差值。
计算方法：多点定标，根据吸光度与参考血清的值作剂量/响应曲线，样品含量可根据其吸光度值在剂量/响应曲线上算出。
实施例3人血清淀粉样蛋白A检测试剂盒性能评价
1.分析灵敏度评估
用200mg/L的样本测定试剂盒，重复测定3次，换算在试剂盒规定198.9mg/L浓度下的吸光度的改变，结果表明，198.9mg/L浓度下吸光度为0.0730（见表1）。
表1
测定次数 测定吸光度均值 198.9mg/L浓度下吸光度
3 0.0734 0.0730
2.高值线性评估
将SAA浓度分别为0mg/L和400mg/L的样本按不同比例混合，每个浓度重复测定3次（见表2）
本发明检测试剂盒的最高检测范围可达到400mg/L，判定依据r2≥0.990。
表2
样本比 理论值mg/L 3次测定均值mg/L
低值 0 0.00
3:1 100 101.00
1:1 200 201.01
1:3 300 301.05
高值 400 400.98
3.精密度评估
使用两个不同SAA含量的人血清样品，测定本发明检测试剂盒的批内精密度。使用3个批号试剂盒分别测定两个样品20次，计算本发明检测试剂盒的批内精密度和批间相对极差。结果表明，本发明检测试剂盒的批内精密度为0.40％和0.55％(见表3)，而批间相对极差为2.26％(见表4)。
表3
批次1 样品1 样品2
测定次数 20 20
平均值mg/L 178.00 233.00
最小值mg/L 170.00 228.00
最大值mg/L 184.00 239.00
标准差 0.7140 1.2912
批内CV（%） 0.40 0.55
表4
4.准确性评估
选择两个不同水平的质控品，分别测定3次，结果表明，本发明检测试剂盒的相对偏差分别为-0.70%、-0.04%。(见表5)
表5
质控品1 mg/L 质控品2 mg/L
靶值 154.00 198.00
测定值1 152.20 197.25
测定值2 153.00 198.52
测定值3 153.57 198.00
平均值 152.92 197.92
相对偏差 -0.70% -0.04%

Claims (6)

1.一种人血清淀粉样蛋白A检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括试剂R1、试剂R2，所述的试剂R1为适当的缓冲液；所述的试剂R2是用人血清淀粉样蛋白A抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒、置于适当的缓冲液中组成。
2.根据权利要求1人血清淀粉样蛋白A检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒所采用的检测原理为胶乳增强免疫比浊法。
3.根据权利要求1所述的人血清淀粉样蛋白A检测试剂盒，其特征在于：所述的缓冲液包括PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、氯化铵缓冲液以及其他具有相似性质的缓冲液中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的人血清淀粉样蛋白A检测试剂盒，其特征在于：所述的聚苯乙烯胶乳颗粒的平均粒径为0.01～1.5μm。
5.根据权利要求5所述的人血清淀粉样蛋白A检测试剂盒，其特征在于：所述的聚苯乙烯胶乳颗粒的平均粒径为0.05～0.5μm。
6.根据权利要求1所述的人血清淀粉样蛋白A检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂R2是用血清淀粉样蛋白A抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，置于适当的缓冲液中组成，该试剂R2的制备步骤包括：
(1)胶乳颗粒的激活：在带有羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒即胶乳中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺，混合反应后加入己二酸二酰肼，继续混合反应，得到激活的胶乳颗粒；
(2)抗体的氧化：用高碘酸钠将抗体非结合活性区域Fc端羧基氧化成醛基；
(3)抗体与胶乳颗粒的偶联：将步骤(1)激活的胶乳颗粒和步骤(2)氧化的抗体混合反应，待反应结束后，再加入葡萄糖封闭胶乳微球上未反应的基团，得到偶联抗体的胶乳微球，置于适量的缓冲液中。
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