CN104820099A - 一种同时检测血浆中TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT和抵抗素含量的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时检测测定血浆中TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT和抵抗素含量的试剂盒，所述试剂盒包括检测溶液R1、检测溶液R2、抗生物标志物阳性质控血清、抗生物标志物阴性质控血清和浓缩洗液通过联合检测人血浆中胰蛋 TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT和抵抗素的含量，实现对急性胰腺炎、其它腹腔脏器炎症性病变、急性消化道溃疡穿孔等引发急症腹痛疾病的排查，其检测方法是基于胶乳增强免疫比浊法，实现多指标联合检测达到引起常见急症腹痛疾病鉴别的目的。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种采用胶乳增强免疫比浊法同时测定血浆中胰蛋白酶原-2(TPSⅡ)、血清淀粉样蛋白A(SSA)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、降钙素原(PCT)与抵抗素含量的检测试剂盒，实现对急症腹痛常见疾病的排查，为临床医生做出及时合理的诊断提供辅助信息。
背景技术
急症腹痛(acute abdominal pain)是急诊患者最常见的病症之一。其就诊全年均可出现，高峰分别是秋季(9～11月)和夏季(6～8月)，就诊年龄集中在15～44岁之间(占就诊总数的72.7％)。常涉及内、外、儿、妇产甚至神经、精神各科的疾病。其主要病因是腹腔内脏器官发生病变、结构机能失常、腹外邻近器官损伤和/或全身性疾病所致。据统计，非创伤性急症腹痛疾病中急性胰腺炎的发病率最高，其次是急性胃肠炎、急性肠梗阻、急性阑尾炎、急性胆管炎、溃疡急性穿孔等。该类疾病往往具有发病急、变化快、病情复杂且严重等特点，加之，目前医院急诊科临床医生趋于年轻化，在急诊诊断方面经验不足，容易诊断有误或治疗欠妥，这样可能造成不良后果，甚至死亡。因此，对急症腹痛的诊断要求较高，能否及时做出明确的诊断，进行合理的治疗，将直接影响着疾病的治疗与预后。针对此现象，本发明提出将血清中胰蛋白酶原-2(TPSⅡ)、血清淀粉样蛋白A(SSA)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、降钙素原(PCT)与抵抗素进行联合检测的急症腹痛排查方案，研制相应的检测试剂盒，对急症腹痛常见的急性胰腺炎、急性阑尾炎、急性腹膜炎、急性胃肠炎与溃疡性急性穿孔进行排除。
目前，国外在临床急症腹痛的检测方面，主要通过结合患者病史，进行体格检查、实验室辅助检查，根据患者病情选择性地进行血糖、妊娠试验、血电解质、肝肾功能、腹部CT检查、腹腔诊断性穿刺以及腹水分析等检查分析，然后综合考虑，提出相应的治疗方案。此外，还采用对急症腹痛患者尿胰蛋白酶原-2的检测，进行急性胰腺炎的排查，但对于急症腹痛相关的其他疾病的排查尚没有相关生物标记物的报道。在国内，对于急症腹痛的临床检测与国外临床检测相似，但TPSⅡ在国外临床诊断中的应用开展较早，而在国内是近两年陆续才开始在三级甲等医院走入临床应用，它的临床应用价值依旧处于进一步的探索中。本发明通过对急症腹痛患者血清中TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT与抵抗素进行联合定量检测，对急症腹痛常见疾病进行排查，为临床医生做出及时合理的诊断提供辅助工具。
发明内容
发明目的：本发明在于提供一种同时测定血浆中TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT与抵抗素的试剂盒及其应用，通过建立一种多指标联合检测的免疫分析方法，为急症腹痛的相关疾病的排查提供一种灵敏度高、精确性好并且方便快速的试剂盒分析方法，帮助临床医生对急症腹痛相关疾病做出及时诊断，也为病情评估或预后判断进行辅助判断。
技术手段：为实现上述技术目的，本发明提出了一种同时检测测定血浆中TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT和抵抗素含量的试剂盒，所述试剂盒包括检测溶液R1、检测溶液R2、抗生物标志物阳性质控血清、抗生物标志物阴性质控血清和浓缩洗液，其中，所述的检测溶液R1包括磷酸缓冲液和聚乙二醇6000；所述的检测溶液R2包括磷酸缓冲液、偶联有生物标志物抗体的致敏胶乳和稳定剂；所述的生物标志物包括TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT和抵抗素。
具体地，所述的致敏胶乳由乳胶颗粒与生物标志物抗体通过物理吸附和/或共价结合得到。
具体地，所述的致敏胶乳通过如下方法制备得到：
(1)胶乳活化：本专利选用的胶乳粒径为80nm---200nm，胶乳加入适量的MES缓冲液中，超声破碎后，在搅拌的条件下向其中缓慢加入EDA和NHS，恒温孵育一段时间后，离心，去上清，再向沉淀中加入PBS缓冲液，进行超声破碎，从加入PBS到进行超声破碎的步骤重复进行1次，得到胶乳颗粒；
(2)抗体交联：向胶乳颗粒中加入PBS，进行超声破碎后，向其中分别加入生物标志物的单克隆抗体(加入量为1.5-6mg/ml)，混匀后，置于室温下孵育一段时间，至反应液呈均匀分布状态，致敏胶乳；
(3)封闭：用PBS缓冲液配制浓度为3.3％mg/ml的甘氨酸，将甘氨酸溶液与致敏胶乳按照体积比100:5混匀，超声破碎后，在25℃下孵育40～50min，然后向其中加入pH 7.5、50mM包含0.05wt％BSA的PBS缓冲液，混匀后，25℃下孵育过夜；离心后，向其中加入PBS，超声破碎；离心去上清，加入0.05％吐温，经超声破碎后再次离心，去上清，加入0.05％的BSA后，进行超声破碎后，继续加入0.05％的BSA和0.1％的Proclin300，进行超声破碎，超声破碎的条件为100Hz，0.8s/次，共进行2分钟，然后4℃保存待用。
其中，所述的胶乳颗粒为羧基聚苯乙烯微球、磁性聚苯乙烯微球、氨基聚苯乙烯微球、二甲氨基聚苯乙烯微球、磺化聚苯乙烯微球、聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球等中的任意一种。
优选地，所述的标志物抗体均为单克隆抗体，所述单克隆抗体均通过单克隆杂交瘤细胞技术制备得到或者通过噬菌体抗体技术筛选得到。
所述的生物标志物阳性质控血清是在正常人血清中分别添加TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT和抵抗素标准品制得，添加量为正常血清中TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT和抵抗素含量的临界值的3倍；其中，正常血清中TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT与抵抗素含量的临界值分别为50μg/L，0.5ng/mL，3mg/L，0.5ng/mL，14ng/mL；所述的生物标志物阴性质控血清是正常人血清。其中正常人血清TPSⅡ的含量低于50μg/L，SSA的含量低于0.5ng/mL，hs-CRP含量低于3mg/L，PCT的含量低于0.5ng/mL，抵抗素的含量低于14ng/mL。
优选地，所述试剂盒包含五种不同颜色标记的检测杯，分别对血清中TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT和抵抗素的检测，检测的线性范围依次为2.5μg/L～1250μg/L、0.1ng/mL～300ng/mL、0.3mg/L～150mg/L、0.1ng/mL～250ng/mL、1ng/mL～200ng/mL。
本发明进一步提出了上述试剂盒在制备用于排查急症腹痛相关疾病的试剂上的应用。
其中，所述的急症腹痛相关疾病为急性胰腺炎、急性腹膜炎、消化性溃疡急性穿孔、急性阑尾炎和败血症中的任意一种。
本发明提出血浆中TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT与抵抗素的检测方案，通过将待检物质的相应抗体与胶乳颗粒进行偶联，通过抗原与抗体的特异结合，使得胶乳颗粒发生凝集，改变抗原抗体反应体系的浊度，提高检测的灵敏度，具体检测：
通过血清TPSⅡ与hs-CRP的联合检测，对急性胰腺炎急性排查；
通过联合检测血清中PCT与hs-CRP的含量，及时、有效地完成急性腹膜炎的诊断排查，有助于临床疗效的观察；
通过血清SSA与hs-CRP的联合检测，对急性阑尾炎进行排查；
通过对患者血清中抵抗素与hs-CRP的含量的检测，对溃疡性急性穿孔进性排查；
此外，血清hs-CRP的水平对急性胃肠炎、急性胆管炎及急性肠梗阻等炎症疾病的早期诊断也存在有效价值。
在使用时的操作步骤如下：将TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT与抵抗素标准品或EDTA抗凝血液离心后得到的血清样本分别与所制备的含有相应抗体的致敏胶乳进行混合，使抗原抗体充分反应，待抗原抗体反应一段时间后，用全自动生化仪测定反应液的吸光度，对照标准曲线即可分别确定检测样品中TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT与抵抗素的含量。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有优点：
(1)TPSⅡ作为急性胰腺炎的筛查指标，具有敏感性强、特异性高，在急性胰腺炎的临床诊断上具有很高的价值；
(2)hs-CRP与PCT的联合检测，可以提高急性腹膜炎的诊断特异性和灵敏度；
(3)本发明将抵抗素这一新兴检测指标进行检测，有助于对急症腹痛中消化性溃疡急性穿孔的排查；
(4)通过血清中SSA与hs-CRP的联合检测，对急性阑尾炎进行排查；
(5)将血清TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT与抵抗素多个指标进行联合检测，可以得到及时有效的诊断结果，对急性腹痛的的常见疾病进行筛查，帮助临床医生做出及时有效的治疗措施，也为疾病的预后提供有价值的临床数据；
(6)本发明所有的检测试剂灵敏度高，检测所用的样本量控制在5μL，实现了临床检验样本的微量化，解决了样本采集困难的问题；
(7)基于胶乳增强免疫比浊法的多指标联合检测方法统一了多个指标的检测方法，使得它们可以在同一反应体系中被检测出来，节约了样本的消耗量，同时也节省了人力、物力与财力。
附图说明
图1致敏胶乳的制备过程；
图2胶乳增强免疫比浊法的检测原理。
具体实施方式
实施例1血清TPSⅡ、hs-CRP、SSA、PCT及抵抗素免疫比浊法检测试剂盒的制备。
一种用于同时测定血清TPSⅡ、hs-CRP、SSA、PCT及抵抗素的试剂盒，该试剂盒包括如下部件：试剂一(R1)，其中包含磷酸缓冲液与聚乙二醇；试剂二(R2)，其中包含磷酸缓冲液、偶联有抗TPSⅡ的单克隆抗体a(下文中简称单抗a)的致敏胶乳、偶联有抗hs-CRP的单克隆抗体b(下文中简称单抗b)的致敏胶乳、联有抗SSA的单克隆抗体c(下文中简称单抗c)的致敏胶乳稳定剂、联有抗PCT的单克隆抗体d(下文中简称单抗d)的致敏胶乳、联有抗抵抗素的单克隆抗体e(下文中简称单抗e)的致敏胶乳；TPSⅡ、hs-CRP、SSA、PCT及抵抗素阳性质控血清；TPSⅡ、hs-CRP、SSA、PCT及抵抗素阴性质控血清。其中，TPSⅡ、hs-CRP、SSA、PCT及抵抗素阳性质控血清是在正常人血清中分别添加中添加TPSⅡ、hs-CRP、SSA、PCT及抵抗素标准品制得，添加量为正常血清中TPSⅡ、hs-CRP、SSA、PCT及抵抗素含量的临界值的3倍；其中，正常血清中TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT与抵抗素含量的临界值分别为50μg/L，0.5ng/mL，3mg/L，0.5ng/mL，14ng/mL；所述的生物标志物阴性质控血清是正常人血清。其中正常人血清TPSⅡ的含量低于50μg/L，SSA的含量低于0.5ng/mL，hs-CRP含量低于3mg/L，PCT的含量低于0.5ng/mL，抵抗素的含量低于14ng/mL。
其中，各个部分通过如下方法制备：
(1)识别TPSⅡ的单抗a的制备：通过单克隆杂交瘤细胞技术制备得到(通过增量培养法扩增保藏杂交瘤细胞株，然后通过辛酸-饱和硫酸铵法纯化培养液中的单克隆抗体)或者通过噬菌体抗体技术筛选得到(将由筛选后得到的高亲和力克隆构建而成的表达载体经转染、表达、提纯后得到高亲和力的单克隆抗体)。本发明中，TP SⅡ单克隆抗体a选择抗人胰蛋白酶原-2(TPSⅡ)单克隆抗体(货号FR-A-021，购买自上海研拓生物科技公司)。
(2)识别hs-CRP的单抗b的制备：该单克隆抗体亦可以通过单克隆杂交瘤细胞技术制备得到(通过增量培养法扩增保藏杂交瘤细胞株，然后通过辛酸-饱和硫酸铵法纯化培养液中的单克隆抗体)或者通过噬菌体抗体技术筛选得到(将由筛选后得到的高亲和力克隆构建而成的表达载体经转染、表达、提纯后得到高亲和力的单克隆抗体)。本发明中选用抗hs-CRP单克隆抗体b选择抗人超敏C反应蛋白(hs-CRP)单克隆抗体(货号TM011，购买自大庆麦伯康生物技术有限公司)。
(3)识别SSA的单抗c的制备：通过单克隆杂交瘤细胞技术制备得到(通过增量培养法扩增保藏杂交瘤细胞株，然后通过辛酸-饱和硫酸铵法纯化培养液中的单克隆抗体)或者通过噬菌体抗体技术筛选得到(将由筛选后得到的高亲和力克隆构建而成的表达载体经转染、表达、提纯后得到高亲和力的单克隆抗体)。本发明中，抗SSA的单抗c选择抗人血清淀粉样蛋白A(SSA)单克隆抗体(货号A90885Hu01，购买自上海武昊经贸有限公司)。
(4)识别PCT的单抗d的制备：通过单克隆杂交瘤细胞技术制备得到(通过增量培养法扩增保藏杂交瘤细胞株，然后通过辛酸-饱和硫酸铵法纯化培养液中的单克隆抗体)或者通过噬菌体抗体技术筛选得到(将由筛选后得到的高亲和力克隆构建而成的表达载体经转染、表达、提纯后得到高亲和力的单克隆抗体)。本发明中，抗PCT的单抗d选择抗人血清降钙素原(PCT)单克隆抗体(货号901010，购买自广州市格瑞林生物科技有限公司)。
(5)识别抵抗素的单抗e的制备：通过单克隆杂交瘤细胞技术制备得到(通过增量培养法扩增保藏杂交瘤细胞株，然后通过辛酸-饱和硫酸铵法纯化培养液中的单克隆抗体)或者通过噬菌体抗体技术筛选得到(将由筛选后得到的高亲和力克隆构建而成的表达载体经转染、表达、提纯后得到高亲和力的单克隆抗体)。本发明中，抗抵抗素的单抗e选择抗人血清抵抗素单克隆抗体(货号A90847Hu01，购买自上海武昊经贸有限公司)。
(6)致敏胶乳颗粒的制备，制备过程如图1：
胶乳活化(胶乳货号PM001和PM005，购买自南京基蛋生物科技有限公司)：将乳胶加入适量的MES缓冲液中，超声破碎后，在搅拌的条件下向其中缓慢加入EDA和NHS，恒温孵育一段时间后，离心，去上清，再向沉淀中加入PBS缓冲液，进行超声破碎(该操作重复进行1次)，即得到工作微球。
抗体交联：向工作微球中加入PBS，进行超声破碎后，向其中分别加入一定量的单抗a、单抗b、单抗c、单抗d和单抗e(加入的量分别是0.65mg/ml、0.85mg/ml、1mg/ml、1mg/ml、1.2mg/ml)，混匀后，置于室温下孵育至反应液呈均匀分布状态，此即致敏胶乳。
封闭：将一定量的甘氨酸溶于PBS缓冲液后，取适量与致敏胶乳混匀，超声破碎后，进行孵育；孵育一段时间后，向其中加入溶有BSA的PBS缓冲液，混匀后，孵育过夜；离心后，向其中加入PBS，超声破碎；离心去上清，加入吐温，经超声破碎后再次离心，去上清，加入BSA后，进行超声破碎后，继续加入BSA和叠氮三钠，进行超声破碎后，4℃保存待用。
检测方法与工作过程：
本发明采用胶乳增强免疫比浊法，利用上述试剂盒联合检测TPSⅡ、hs-CRP、SSA、PCT及抵抗素的含量，检测原理如图2所示，包括如下步骤：
1)设定特定蛋白分析仪基本参数：两点终点法，波长600nm，基本参数如表1所示；
2)将5μL的待测样本加入200μLR1中，混匀后孵育300秒，然后将50μLR2加入其中，测第一吸光度A1，混匀后孵育300秒，测第二吸光度A2，复合物的浊度对应的吸光度值为Δ(A2-A1)。全自动生化分析仪自带自身的程序参数输入法，上述的基本参数需结合全自动生化分析仪自带的程序参数输入法，进行上机参数输入后试剂才能配套仪器自动测定。
3)同时按上述方法检测阳性、阴性质控血清，37℃孵育30min。
4)测定结束后，分析并分别绘制TPSⅡ、hs-CRP、SSA、PCT及抵抗素的标准曲线。
表1全自动特定蛋白分析仪测定基本参数
| 样本量 | 试剂量(R1/R2) | 反应温度 | 反应时间(T1/T2) |
| 5μL | 200μL/50μL | 37℃ | 300秒/300秒 |
| 单位 | 反应方向 | 标准曲线模拟方程 |
| mg/L | 向上 | 多点定标，非线性计算模式 |
实施例2血清TPSⅡ、hs-CRP、SSA、PCT及抵抗素两联胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒的准确度
(1)准确度和精密度
选择高、中、低三个浓度的标准品，各含有TPSⅡ、hs-CRP、SSA、PCT及抵抗素浓度为500ng/ml、200ng/ml、450ng/ml、450ng/ml及300ng/ml，200ng/ml、150ng/ml、180ng/ml、170ng/ml及140ng/ml，50ng/ml、30ng/ml、100ng/ml、70ng/ml及75ng/ml。用本发明设计的胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒对上述样本进行，每个浓度检测10次，将所得结果进行比较，确定本试剂盒的准确度和精密度，得到的检测结果如下表2：
表2.TPSⅡ、hs-CRP、SSA、PCT及抵抗素检测结果比较
对本组数据做配对样本的T检验，得P＞0.05，得出检测组所得结果之间的差别无统计学意义，说明本项目所采用的胶乳免疫比浊法无论在高、中或者低浓度的TPSⅡ、hs-CRP、SSA、PCT及抵抗素检测中，均能得到准确度较高的结果。
同时，本方法在高、中、低浓度下多指标的重复检测结果的变异系数均小于10％，具有较好精密度。
(2)试剂盒稳定性试验：
试剂盒保存条件为2-8℃，保存6个月后，测定试剂盒的各项指标，发现均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置6天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2～8℃至少可以保存6个月以上。
以上所述尽是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种同时检测测定血浆中TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT和抵抗素含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测溶液R1、检测溶液R2、抗生物标志物阳性质控血清、抗生物标志物阴性质控血清，其中，所述的检测溶液R1包括磷酸缓冲液和聚乙二醇6000；所述的检测溶液R2包括磷酸缓冲液、偶联有生物标志物抗体的致敏胶乳和稳定剂Proclin300；所述的生物标志物包括TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT和抵抗素。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的致敏胶乳由乳胶颗粒与生物标志物抗体通过物理吸附和/或共价结合得到。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的致敏胶乳通过如下方法制备得到：
（1）胶乳活化：将乳胶加入适量的MES缓冲液中，超声破碎后，在搅拌的条件下向其中缓慢加入EDA和NHS，恒温孵育一段时间后，离心，去上清，再向沉淀中加入PBS缓冲液，进行超声破碎，从加入PBS到进行超声破碎的步骤重复进行1次，得到胶乳颗粒；
（2）抗体交联：向胶乳颗粒中加入PBS，进行超声破碎后，向其中分别加入生物标志物的单克隆抗体,加入量为1.5~6mg/ml，混匀后，置于室温下孵育至反应液呈均匀分布状态，致敏胶乳；
（3）封闭：用PBS缓冲液配制浓度为3.3% mg/ml的甘氨酸，将甘氨酸溶液与致敏胶乳按照体积比100:5混匀，超声破碎后，在25℃下孵育40~50 min，然后向其中加入pH 7.5、50mM包含0.05wt%BSA的PBS缓冲液，混匀后，25℃下孵育过夜；离心后，向其中加入PBS，超声破碎；离心去上清，加入0.05%吐温，经超声破碎后再次离心，去上清，加入0.05%的BSA后，进行超声破碎后，继续加入0.05%的BSA和0.1%的稳定剂Proclin300，进行超声破碎，超声破碎的条件为100Hz，0.8s/次，共进行2分钟，然后4℃保存待用。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的胶乳颗粒为羧基聚苯乙烯微球、磁性聚苯乙烯微球、氨基聚苯乙烯微球、二甲氨基聚苯乙烯微球、磺化聚苯乙烯微球、聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球等中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的标志物抗体均为单克隆抗体，所述单克隆抗体均通过单克隆杂交瘤细胞技术制备得到或者通过噬菌体抗体技术筛选得到。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的生物标志物阳性质控血清是在正常人血清中分别添加TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT和抵抗素标准品制得，添加量为正常血清中TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT和抵抗素含量的临界值的3倍；所述的生物标志物阴性质控血清是正常人血清。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含五种不同颜色标记的检测杯，分别对血清中TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT和抵抗素的检测，检测的线性范围依次为2.5μg/L~1250μg/L、0.1 ng/mL~300 ng/mL、0.3 mg/L~150 mg/L、0.1ng/mL~250ng/mL、1ng/mL~200ng/mL。
8.权利要求1~6任一项所述试剂盒在制备用于排查急症腹痛相关疾病的试剂上的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的急症腹痛相关疾病为急性胰腺炎、急性腹膜炎、消化性溃疡急性穿孔、急性阑尾炎和败血症中的任意一种。
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20191230 Address after: 312000 211, floor 2, building 9, No. 159, Meilin Road, Qixian street, Keqiao District, Shaoxing City, Zhejiang Province Patentee after: Xinji (Shaoxing) Biotechnology Co.,Ltd. Address before: Lishui District of Nanjing City, Jiangsu province 210012 Yong Yang Town Natural Bridge Road No. 688 Branch Center Patentee before: NANJING GEYAO BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20220323 Address after: 215002 station 420-75, 4th floor, Yuanhe building, No. 959, Jiayuan Road, Yuanhe street, Xiangcheng District, Suzhou City, Jiangsu Province (cluster registration) Patentee after: Suzhou puluoli Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 312000 211, floor 2, building 9, No. 159 Meilin Road, Qixian street, Keqiao District, Shaoxing City, Zhejiang Province Patentee before: Xinji (Shaoxing) Biotechnology Co.,Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170308 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |