CN108722507A - 一种炎症四项标志物磁微粒微流控生物芯片、检测方法 - Google Patents
一种炎症四项标志物磁微粒微流控生物芯片、检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108722507A CN108722507A CN201810646559.XA CN201810646559A CN108722507A CN 108722507 A CN108722507 A CN 108722507A CN 201810646559 A CN201810646559 A CN 201810646559A CN 108722507 A CN108722507 A CN 108722507A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- magnetic
- inflammation
- antibody
- marker
- biosensor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
- B01L2200/10—Integrating sample preparation and analysis in single entity, e.g. lab-on-a-chip concept
Abstract
本发明涉及一种炎症四项标志物磁微粒微流控生物芯片,属于POCT检测技术领域,包括生物传感器,生物传感器为晶元平台以及晶元平台上包被的点样抗体,点样抗体能够与磁珠偶联的抗体和标志物蛋白形成免疫复合物,通过测定晶元平台上复合物磁阻信号强弱判断标志物蛋白浓度,点样抗体为炎症四项标志物PCT、IL‑6、CRP、SAA单克隆抗体。该技术方案中磁珠具有较大的比表面积,可结合更多的蛋白/抗体,提高了检测的灵敏度。本发明还提供了一种应用上述生物芯片的检测方法,该检测方法达到第四代进口化学发光法POCT产品灵敏度、线性范围、检测下限、准确度及特异性水平,同时产品结构更小巧,更便携,更灵敏,更准确,检测时间短,未来更适用于基层社区医院检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物芯片,主要用于检测血液样品中(全血/血浆/ 血清/指血)炎症四项标志物检测,本发明还提供了一种应用上述生物芯片的检测方法,属于POCT检测技术领域。
背景技术
炎症(inflammation):具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应为炎症,血管反应是炎症过程的中心环节。炎症,就是平时人们所说的“发炎”,是机体对于刺激的一种防御反应,表现为红、肿、热、痛和功能障碍。炎症,可以是感染引起的感染性炎症,也可以不是由于感染引起的非感染性炎症。通常情况下,炎症是有益的,是人体的自动的防御反应,但是有的时候,炎症也是有害的,例如对人体自身组织的攻击、发生在透明组织的炎症等等。
在炎症过程中,一方面损伤因子直接或间接造成组织和细胞的破坏,另一方面通过炎症充血和渗出反应,以稀释、杀伤和包围损伤因子。同时通过实质和间质细胞的再生使受损的组织得以修复和愈合。因此可以说炎症是损伤和抗损伤的统一过程。炎症主要分为细菌性感染和病毒性感染。
感染是临床的常见病,近半数的感染者发生感染性休克,严重感染者的发病率为11%。每年76~110例/10万人,病死率30%~70%,严重威胁患者的生命。如何早期识别,明确诊断,如何准确的客观的评价感染患者的严重程度,是临床治疗中的基础环节。上世纪九十年代科学提供PCT、CRP、IL-6、SAA等血清标准物作为炎症、脓血症、病毒感染等标志物,有助于临床鉴别细菌感染病毒感染,感染性疾病非感染性疾病,局部感染与全身重度感染及如何使用抗生素等对临床医生进行用药指导。
感染因子检测POCT主要用于炎症的分析检测,主要检测项目有 CRP、PCT、IL-6、SAA等。目前市场规模8-10亿元(主要是CRP和 PCT),增长率25%。
CRP(C-反应蛋白)是指在机体受到感染或组织损伤时血浆中一些急剧上升的急性期反应蛋白,是一种非特异性的免疫应答组分。CRP可以激活补体和加强吞噬细胞的吞噬而起调理作用,从而清除入侵机体的病原微生物和损伤,坏死,凋亡的组织细胞,在机体免疫过程中发挥重要的保护作用。CRP在炎症开始数小时就升高,48小时即可达峰值,随着病变消退、组织、结构和功能的恢复降至正常水平。此反应不受放疗、化疗、皮质激素治疗的影响。因此,CRP的检测在临床应用相当广泛,包括急性感染性疾病的诊断和鉴别诊断,手术后感染的监测;抗生素疗效的观察;病程检测及预后判断等。
PCT(降钙素原)是一种蛋白质,当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的水平升高。自身免疫、过敏和病毒感染时PCT不会升高。PCT反映了全身炎症反应的活跃程度。影响PCT水平的因素包括被感染器官的大小和类型、细菌的种类、炎症的程度和免疫反应的状况。
近年来国内抗生素滥用导致病人耐药性的普遍现象造成了非常严重的医疗后果。据上海、北京和全国各地的儿童医院资料统计,门诊就诊患儿已使用抗生素者比例80%~85%,其中呼吸道感染占儿科疾病发病率的首位,占儿科门诊总数的90%,大多数都有发烧、咳嗽的表现,90%以上的呼吸道感染是由病毒引起,用抗生素无效。因此,对于患者C-反应蛋白、PCT的定量快速检测可以在短时间内判断患者的症状是由病毒还是由细菌引起,从而避免了抗生素的滥用。
感染因子检测POCT市场受国家政策影响比较大,近年来主管部门开始大力推动限制抗生素使用,使得感染因子检测市场急剧放量,行业连续保持超高速增长。除此之外,从医院的角度来说,医院进行感染因子的检测动力十足,自身利益也有一定的诉求,也促进了行业的快速发展。
从竞争格局来看,CRP市场中国产品牌国赛生物在2006年就开始进入感染因子检测市场,在国产CRP产品中占据市场份额最多。PCT市场中,因为技术原因,目前几乎被国外产品占据,但是主流国产品牌已经开始进行布局。目前国内市场格局由深圳国赛、河北禾柏、上海奥普、广州万孚、深圳西莱恒等构成。目前感染因子标志物方面主要发展趋势为血常规+CRP一体机,随着市场教育的逐渐深入,指标检测价值逐渐深入人心,捆绑操作也成为科室习惯,但更简单、更方便的操作,节约样本周转时间、提高质控管理效率将成为科室的需求点,一体机可以解决以上问题,同时对于超敏C反应蛋白的检测方法学要求限制,检验科将更青睐一体机的使用。
目前,POCT临床检测技术包括:
第一代检测技术竞争法(放射免疫分析法,RIA):受影响因素较多,RIA样品需要量较多,由于检测前通常需要先萃取,不但增加了操作步骤,而且由于萃取的回收率通常只有80%~90%,变差系数(CV) 相对较大,降低了检测的精密度;
第二代检测方法非竞争法(放射免疫分析法,RIA):采用双抗体夹心的免疫分析,无须萃取,抗体特异性高,其灵敏性、精密性和特异性比竞争法要好,但耗时仍较长,难以适用于自动化;
第三代检测方法酶免疫分析法,固定相免疫层析法:采用双抗体加心法免疫分析固相层析法包括胶体金,免疫荧光等,抗体特异性高,其灵敏性、精密性和特异性优于非竞争法,可以实现设备检测半自动检测,只能实现定量/半定量检测,操作和样品及物理性能对检测的特性灵敏度影响较大,具有较大的批间批内差,变异系数一般在15%~30%;
第四代检测方法化学发光方法,一种超高灵敏度的微量测定技术,它具有高灵敏度、检测范围宽、操作简便快速、标记物稳定性好、无污染、仪器简单经济等优点。但是该检测方法仍然具有以下不足:光背景噪音,样品光漂白现象,光信号衰减等现象将对检测的灵敏度和特异性起到干扰作用,同时设备无法小型化和POCT化,主要由专业人员操作,无法实现床边检测,急救车检测及家庭检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种炎症四项标志物磁微粒微流控生物芯片,具有检测灵敏度高,检测时间短的优点。具体技术方案如下:
一种炎症四项标志物磁微粒微流控生物芯片,包括生物传感器,所述生物传感器为晶元平台以及晶元平台上包被的点样抗体,所述点样抗体能够与磁珠偶联的抗体和标志物蛋白形成免疫复合物,通过测定晶元平台上复合物上磁阻信号强弱判断标志物蛋白浓度,所述点样抗体为炎症四项标志物PCT、IL-6、CRP、SAA抗体1,所述偶联抗体为炎症四项标志物PCT、IL-6、CRP、SAA抗体2。
作为上述技术方案的改进,当血液样品(全血/血浆/血清/指血)中含有炎症四项标志物蛋白时,包被有点样抗体的晶元平台上将形成磁珠复合物聚集。
作为上述技术方案的改进,所述生物传感器通过金线作为信号传输载体。
作为上述技术方案的改进,该生物芯片包括PCB板,所述PCB板上具有微流通道,所述生物传感器设置于微流通道内,所述微流通道包括进液端和出液端,所述PCB板上依次设置有第一层和第二层,所述第一层上开设有贯穿的进样孔和废液孔,所述第二层上具有混合区和废液区,所述混合区一侧连接横向微流通道,所述横向微流通道上远离混合区的一端具有与进样孔相连,所述PCB板上的生物传感器与微流通道组成生物传感器反应区,生物芯片内流体按照以下顺序单向流动:混合区→横向微流通道→进样孔→进液端→微流通道→生物传感器反应区→出液端→废液孔→废液区。
作为上述技术方案的改进,所述第二层上方还设置有微流通道密闭层和全血过滤层。
作为上述技术方案的改进,所述第二层、微流通道密闭层和全血过滤层上的混合区周围开设有贯穿的加样区、第一囊泡加样孔、第二囊泡加样孔和第三囊泡加样孔,所述加样区、第一囊泡加样孔、第二囊泡加样孔和第三囊泡加样孔和混合区之间分别设置有连通的引流通道。
作为上述技术方案的改进,所述生物传感器通过惠斯通电桥方式连接,所述生物传感器包括一个输入端和两个输出端,每组输出端的电路中含有0.1uM2~100uM2巨磁阻材料,所述生物芯片外侧具有磁场激发装置,在点样抗体与磁珠偶联的抗体和标志物蛋白形成免疫复合物后,清洗生物传感器上多余的未结合的磁珠和抗体蛋白,此时磁场激发装置自动开启激发均匀磁场使磁珠磁化,所述生物传感器上被磁化的磁珠产生的磁场引起巨磁阻材料电阻的变化,进而判断生物传感器上磁珠的位置和浓度,通过标准曲线算法定量炎症标志物蛋白浓度。
上述生物芯片磁珠具有较大的比表面积,能够结合更多的抗体,从而提高了检测的灵敏度;同时生物分子和蛋白是不具有磁性的,未结合在传感器上的磁珠也无法激发磁场产生磁阻信号,特异性要高于第四代化学发光法。
本发明还提供了一种应用上述炎症四项标志物磁微粒微流控生物芯片的检测方法,包括以下步骤:
步骤一,生物芯片前处理,在生物传感器上包被炎症四项标志物 (PCT/IL-6/CRP/SAA)点样抗体;
步骤二,30nm+50nm磁珠制备及抗体偶联分离纯化系统:
Ⅰ、30nm+50nm磁珠混合液的制备:取Fe3O4溶液加入超纯水中使得四氧化三铁溶液终浓度0.01%~0.03%,在非磁性震荡高温加热系统上加热至200℃~300℃,加入10%醋酸钠溶液,使得醋酸钠终浓度为 0.2%~0.3%,高温下反应得到30nm的四氧化三铁超顺磁磁珠黑色胶体状态悬浊液;
取Fe3O4溶液加入超纯水中使得四氧化三铁溶液终浓度0.01%~ 0.03%,在非磁性震荡高温加热系统上加热至200℃~300℃,加入10%醋酸钠溶液,使得醋酸钠终浓度为0.1%~0.2%,高温下反应得到50nm 的四氧化三铁超顺磁磁珠黑色胶体状态悬浊液;
将30nm的四氧化三铁超顺磁磁珠黑色胶体状态悬浊液和50nm的四氧化三铁超顺磁磁珠黑色胶体状态悬浊液1:1混合待用;
将30nm和50nm四氧化三铁超顺磁磁珠黑色胶体状态混合悬浊液放在磁块上,轻柔吸取去上清液,并用乙醇和超纯水清洗,将洗涤好的 30nm和50nm四氧化三铁超顺磁磁珠分散于乙醇、超纯水、氨水的混合液中后加入正硅酸四乙酯,搅拌形成核壳式二氧化硅层;
Ⅱ、环氧基功能化集团的共价键结合,加入由γ―(2,3-环氧丙氧) 丙基三甲氧基硅烷、甲醇、超纯水组成的混合液,经过加热、清洗并烘干后,获得含有环氧基活化的30nm+50nm超敏磁珠;
Ⅲ、超顺磁超敏磁珠偶联蛋白偶联及分离纯化:
(1)30nm+50nm超敏磁珠的活化,将30nm+50nm超敏磁珠加入 Sulfo-SMCC(SS-磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环乙烷-1- 羧酸酯),加入偶联缓冲液,超声分散磁珠;
(2)将经巯基再活化的30nm+50nm超敏磁珠置于磁分离器中分离,吸除上清液,加入偶联缓冲液清洗,再重复磁分离纯化操作之后用偶联缓冲液重新悬浮磁珠,超声分散待用;
(3)偶联用链酶亲和素/单克隆抗体的活化;
(4)超顺磁超敏磁珠偶联链酶亲和素/单克隆抗体:将活化好的链酶亲和素/单克隆抗体加入到已活化的磁珠中,加入偶联缓冲液,超声分散,然后将试管置于强磁铁上分离磁珠;
(5)超长链生物单克隆抗体偶联:用超纯水溶解生物素,然后与单克隆抗体溶液混合孵育一段时间,离心分离去除上清液,得到超长链生物偶联单克隆抗体;
步骤三,生物素亲和素反应体系检测:取血液样品(全血/血浆/血清/指血),加入生物素偶联单克隆抗体静置混合,加入生物芯片中,芯片上预分装磁珠偶联亲和素囊泡被刺破,与生物素偶联的抗体进行混合反应后进入反应区(生物芯片传感器),如果样本中含有炎症四项标志物蛋白,生物传感器上将形成磁珠的复合物聚集 (Ab2-Ag-Ab1-bio-SA-MB),通过测定磁阻信号定量反应出磁珠浓度,通过标准曲线算法将磁珠浓度转化成蛋白浓度,进而判断炎症四项标志物蛋白的浓度。
作为上述技术方案的改进,所述步骤一具体包括以下三步:
Ⅰ、生物芯片表面功能化:
(1)活化聚合剂的配制,在活性化合物中加入延缓聚合剂,加入纯水混匀超声;
(2)保护涂层溶液配制,将异丙醇、活化聚合剂、第二聚合光敏剂和交联剂均匀混合;
(3)通过全自动点样系统将保护涂层均匀分布到生物芯片的生物传感器表面,通过紫外线激发光敏物质,释放催化中的功能基团,催化单体聚合反应,通过紫外照射使得保护涂层在生物传感器表面形成稳定的固态功能保护层;
(4)生物传感器的清洗,将固化后的芯片分别放入异丙醇和纯化水中超声清洗,去除芯片传感器表面的残留物,通过氮气吹干后保存待用;
Ⅱ、生物芯片点样及孵育:
(1)抗体保护液配制,在磷酸钾缓冲液体系下加入聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮,加入吐温20、吐温80、吐温100混合均匀;
(2)阴性对照物质配制,用抗体保护液配置BSA溶液;
(3)点样抗体配制,用抗体保护液配制炎症四项标志物 (PCT/IL-6/CRP/SAA)抗体,超声混匀;
(4)通过全自动微量点样系统将抗体和阴性对照分别点在不同的生物传感器上,通过高倍显微镜系统在线查看液体形态和在生物传感器上的分布情况;
(5)将点样后的生物芯片放入含有饱和氯化钾和铝块的密闭容器中孵育,使抗体蛋白与生物传感器的表面功能基团稳定结合;
Ⅲ、生物芯片的封闭:
(1)芯片封闭液的配制,在三羟甲基甲氨基甲烷盐酸缓冲液中加入吐温20/80/100溶液和乙醇胺溶液,混匀后过滤备用;
(2)封闭保护液配制,在磷酸盐缓冲体系下加入氯化钾和氯化钠,混匀后过滤备用;
(3)生物芯片的封闭系统,将封闭液注入微流通道,封闭生物传感器上多余位点;
(4)生物芯片封闭后的清洗及保护:将封闭液保护液注入微流通道,清洗多余封闭液残留成份;
(5)生物芯片的干燥,将封闭后的生物芯片放入干燥箱干燥,使得生物传感器上的抗体或者蛋白完全脱水处于低能稳定的状态,干燥后密闭抽真空保存。
作为上述技术方案的改进,将“步骤三,生物素亲和素反应体系检测”替换为:“免疫学双抗体夹心法反应体系检测”,所述“免疫学双抗体夹心法反应体系检测”具体包括:取血液样品(全血/血浆/血清/指血),将血液样品加入到生物芯片加样区中,预先分装在生物芯片上磁珠偶联抗体的囊泡被刺破混合,如果样本中含有炎症四项标志物蛋白,生物传感器上将形成磁珠的复合物聚集(Ab2-Ag-Ab1-MB),通过测定磁阻信号定量反应出磁珠浓度,通过标准曲线算法将磁珠浓度转化成蛋白浓度,进而判断炎症四项标志物蛋白的浓度。
上述检测方法具有以下五个方面的优点:
(1)可以适用全血/血浆/血清/指血样品检测,能实现微量(20-40ul) 加样微量检测,可实现指血检测功能;检测时间在15分钟~20分钟,并实现最高30~50项免疫蛋白/分子生物标志物检测,缩短诊断时间,增加患者的抢救时间,该检测方法可同时定量检测炎症标志物,并提高了检测的灵敏度(检测下限),扩宽了检测的线性范围,有效地避免了漏检和假阴性现象,且检测时间短,操作简单,安全无污染,适用于检验科,急诊,ICU及床边检测,应用范围广泛;
(2)传统的临床炎症诊断是PC组合(PCR+CRP)主要用于临床住院和门诊,目前的临床炎症诊断是PI组合(PCT+IL-6)和CS组合 (CRP+SAA);PI组合加强了住院病人炎症的早期发现,抗生物用药检测及术后愈后检测等;CS组合强化了CRP炎症门诊检测,使其优势更加明显,并在验证早期可区分细菌感染和病毒感染,为临床医生制订治疗方案(结合常规血检)和防止药物滥用提供有利的依据;
(3)本发明炎症标注物四联检代表着炎症检测的未来趋势,发挥了常规组装的优势,避免了PI和CS劣势(两种组合使用场景单一),同时适用于门诊检测,住院检测,社区及家庭医生检测。患者一次采血/微量采血(全血/血清/血浆/指血)进行炎症常规四项检测,并同时判断炎症的起源(病毒感染/细菌感染),发展程度及预后检测及对于炎症的早期发现和治疗等提供了临床参考数据并指导和监测临床医生对于抗生素的使用;
(4)同时本发明炎症标志物四项联合检测对于肿瘤发生发展及预后,移植术后炎症及排斥等积进行监测,同时对于冠心病等心血管疾病的检测发展和预后进行辅助性评估,结合心肌标志物六项检测对于心血管疾病的风险及治疗进行判断;
(5)本发明炎症四项标志物(PCT、IL-6、CRP、SAA)磁微粒微流控生物芯片定量检测方法的灵敏度、线性范围、检测下限、准确度及特异性均高于传统的层析法POCT产品,达到第四代进口化学发光法 POCT产品灵敏度、线性范围、检测下限、准确度及特异性水平,同时,本发明炎症标志物四项(PCT、IL-6、CRP、SAA)磁微粒微流控生物芯片定量检测设备更小巧,更便携,更灵敏,更准确,检测时间更短 (15-20分钟),样品采集更微量(全血/血清/血浆/指血,20-50ul),未来更适用于家庭化检测(社区门诊,家庭医生,患者自检等),应用范围广泛。
附图说明
图1为本发明一种炎症四项标志物磁微粒微流控生物芯片的结构示意图。
图2为本发明的生物芯片中第二层的另一种实施例的结构示意图。
图3为实施例四中降钙素原(PCT)质控品检测直线回归曲线。
图4为实施例四中白介素6(IL-6)质控品检测直线回归曲线图。
图5为实施例四中C反应蛋白(CRP)质控品检测直线回归曲线图。
图6为实施例四中人血清淀粉样蛋白A(SAA)质控品检测直线回归曲线图。
具体实施方式
如图1所示,本发明提供了一种炎症四项标志物磁微粒微流控生物芯片,包括生物传感器,生物传感器为晶元平台20以及晶元平台20上包被的点样抗体,点样抗体能够与磁珠偶联的抗体和标志物蛋白形成免疫复合物,通过测定不同生物传感器上复合物磁阻信号强弱定量判断标志物蛋白浓度,所述点样抗体为炎症四项标志物PCT、IL-6、CRP、 SAA抗体1,所述偶联抗体为炎症四项标志物PCT、IL-6、CRP、SAA 抗体2,当血液样品中含有炎症四项标志物蛋白时,包被有点样抗体的生物传感器上将形成磁珠复合物聚集。
该生物芯片包括PCB板10,所述PCB板10上具有微流通道11,所述生物传感器设置于微流通道11内,微流通道11包括进液端12和出液端13,所述PCB板10上依次设置有第一层30、第二层40、微流通道密闭层50和全血过滤层60,第一层30上开设有贯穿的进样孔31和废液孔 32,第二层40上具有混合区41和废液区44,混合区41一侧连接横向微流通道42,横向微流通道42上远离混合区41的一端具有与进样孔31相连,生物芯片内流体按照以下顺序单向流动:混合区41→横向微流通道 42→进样孔31→进液端12→微流通道11(图1中所示的微流通道内设置有36个生物传感器)→出液端13→废液孔32→废液区44,为了实现生物芯片中流体的单向流动,可以在废液区44的位置设置微阀和微泵,通过微阀和微泵产生负压控制流体的流动和流动方向,各区域可以通过检测仪微型负压气泵及其自控程序进行控制。
如图2所示,第二层40、微流通道密闭层50和全血过滤层60上的混合区41周围可以开设有加样区43、第一囊泡加样孔45、第二囊泡加样孔46和第三囊泡加样孔47,第二层40上的加样区43、第一囊泡加样孔45、第二囊泡加样孔46和第三囊泡加样孔47和混合区41之间分别设置有连通的引流通道48,加样区43、第一囊泡加样孔45、第二囊泡加样孔46和第三囊泡加样孔47这四个加样孔在使用时分别加入血液样品(全血/血浆/血清/指血)、生物素偶联抗体2(bio-Ab2)、链霉亲和素偶联的磁珠(SA-MB)、清洗缓冲液。其中生物素偶联抗体2、链霉亲和素偶联的磁珠、清洗缓冲液均预先分装在囊泡内,在检测过程中囊泡被检测仪自动刺破,使生物素偶联二抗和链霉亲和素偶联的磁珠进入到混合区41与血液样品进行混合。
上述方案中生物传感器进行检测的原理是,利用巨磁阻(GMR)的原理,通过测定生物传感器上磁珠的磁场信号及电阻信号,计算磁场信号和电阻信号变化反应结合在传感器上磁珠的浓度,通过标准曲线算法定量测量炎症标志物蛋白浓度。本系统可定量检测炎症患者的临床样品 (全血/血清/血浆/指血)炎症标志物蛋白浓度,判断患者炎症分类(病毒感染、细菌感染)和感染程度,是否需要使用抗生素等,为临床医生的后续检查及抗生素的使用提供有力证据。
该生物芯片可以采用以下两种检测方法:
方法一,生物素亲和素反应体系检测方法
取10ul~30ul样品(全血/血清/血浆/指血),加入生物芯片的加样区中,通过微阀和微泵控制样本流速,当达到样品混合区(混合区41)时,预分装生物素偶联单克隆抗体囊泡被自动刺破进入混合区震动混合10 秒~30秒,预分装磁珠偶联链酶亲和素的囊泡被自动刺破进入混合区,与样品和生物素偶联抗体混合物混合反应10秒~30秒;
通过微阀控制通道开关进入生物传感器内(预先包被炎症标志物抗体1),反应时间100秒~120秒;检测系统自动刺破清洗缓冲液囊泡清洗未结合的磁珠和样本复合物,清洗时间1分钟~2分钟;如果样本中含有炎症标志物蛋白,将在传感器上形成Ab1-Ag-Ab2-bio-SA-磁珠复合物聚集,通过测定磁阻信号定量反应出较高磁珠浓度,如果样本中不含有/ 极微量炎症标志物蛋白,通过测定的磁阻信号定量反应出较弱的磁珠浓度。通过检测系统内的标准曲线算法软件将磁珠浓度转化成蛋白浓度,并自动定量判断炎症标志物蛋白的浓度。高浓度的炎症标志物代表炎症的种类及感染进程及抗生素的使用,在参考值范围以下的代表没有炎症发生,参考值范围附近代表具有轻微炎细菌/病毒感染。整体检测时间将在15-20分钟内完成。
方法二,免疫学双抗体夹心法反应体系
取10ul~30ul样品(全血/血清/血浆/指血)加入芯片加样区43,通过微阀微泵控制样本流速,当达到样品混合区时,存有磁珠偶联抗体的囊泡被刺破进入混合区,与样品混合物震动混合反应10秒~30秒;
通过微阀控制通道开关进入生物传感器内(预先包被炎症标志物抗体1),反应时间100秒~120秒;检测系统自动刺破清洗缓冲液囊泡清洗未结合的磁珠和样品,清洗时间1分钟~2分钟;如果样本中含有炎症标志物蛋白将在传感器上形成Ab1-Ag-Ab2-磁珠复合物聚集,通过测定磁阻信号定量反应出较高磁珠浓度,如果样本中不含有/极微量炎症标志物蛋白,通过测定的磁阻信号定量反应出较弱的磁珠浓度。换算过程与方法一相同。
本发明所涉及的磁微粒微流控芯片的定量检测系统主要包括硬件部分和软件部分。硬件部分主要包括:设备外壳,显示器,电池及单片机电路板和磁场电阻信号感应器,微型负压机械电机,二维码扫描系统等,从模块划分为,材料配备模块,传感器感应模块,液路控制模块,机械传动模块,温控模块,磁阻信号检测模块,电路集成控制模块,蓝牙模块和GPS模块;
材料配备模块包括:囊泡加样孔(分别预分装生物素偶联抗体、链霉亲和素偶联的磁珠、清洗缓冲液等),加样孔,混合区,废液回收等系统;
传感器感应模块:生物芯片的生物传感器接触触点(晶元平台20) 和信号传传输系统,二维码读取及其信号读取,传输,存储系统及其辅助电路;
液路控制模块:包括加样后的混合震动,微阀,微泵,混合池的混合震动,负压气孔,微型负压机械电机等;
温控模块:包括温度控制,孵育反应时间控制等;
机械传动模块:进出仓装置,微电机,传感器,运输轨道,机械臂等;
磁阻信号检测模块:均匀磁场发生装置(亥姆赫兹线圈),磁阻信号的读取装置,模拟数字转换装置,存储装置,信号分析系统及信号显示系统;
电路集成模块:传感器信号感应电路,传输电路,放大电路,滤波电路,去噪电路,各模块链接控制驱动等电路系统;
蓝牙模块:具有将检测信号与有线/无线传输的模块及其电路系统;
GPS模块:具有GPS信号全球定位的功能及其辅助电路系统;
打印模块:微型热敏打印机及其辅助电路连接系统
软件部分:磁微粒微流控生物芯片的定量检测系统的软件编制,主要包括机械驱动程序,显示系统程序,磁场激发程序,液路控制程序,检测程序,分析算法,标准曲线读取,转换,打印驱动等程序。
磁信号定量检测仪的检测原理:微流控生物芯片含有多个彼此平行,断面倒梯形结构的蛇形微流通道11,每个微流通道内设置有一个或多个生物传感器(本申请附图1和图2中采用36个生物传感器进行示例),生物传感器采用晶元平台20的结构,每个晶元平台20正上方成凸型结构,每个生物传感器有单独的金线传输装置和地址码,可单独记录其产生的信号,以惠斯通电桥的方式量化传感器的产生的信号。生物传感器以惠斯通电桥的方式连接,包括一个输入,两个输出,每组输出电路中含有0.1uM2~100uM2巨磁阻材料。
生物芯片传感器信号反应:在清洗生物传感器上多余的未结合的磁珠和蛋白后,检测仪自动激发均匀磁场发生装置产生均匀的强磁场磁化磁珠,当磁珠偶联的抗体/长链亲和素偶联的抗体在生物传感器结合聚集时,固定在生物传感器上的磁珠被磁化。生物传感器上被磁化的磁珠产生的磁场引起巨磁阻材料电阻的变化,通过感应生物传感器自身电阻变化来测量生物传感器上磁珠的数量和位置。
生物传感器信号的传输和处理:微流控生物芯片上含有一系列的输入输出管脚,直流供电电路,调控电路,磁场电路,信号放大电路等;每个生物传感器上都有输出巨磁阻效应信号的一个惠斯通电桥,当有外加磁场加在生物传感器固定的磁珠上,生物传感器的多层膜巨磁阻材料结构将感应的电阻变化通过惠斯通电桥将电阻信号转变为电压信号输出,通过磁信号定量检测仪中的生物传感器接口及其辅助电路(放大电路和去噪电路)将电压信号传输至模数转换装置转换成数字信号。
生物传感器信号分析:模数转换器输出的数字信号在地址译码器等辅助电路作用下,输入微处理芯片,利用存储器中的分析软件和标准曲线读取分析软件对于数字信号进行处理。
生物传感器信号输出:生物传感器信号分析结果可通过显示芯片或者其它的输出设备(LED,VGA显示器)进行显示,也可以通过控制打印电路直接打印或者通过外接有线设备/蓝牙系统对外传输检测结果。
下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式进行描述,以便更好的理解本发明。
实施例一
本发明涉及一种炎症四项标志物磁微粒微流控生物芯片,生物传感器预先包被了炎症四项标志物(PCT/IL-6/CRP/SAA)点样单克隆抗体,然后将第一层30、第二层40、微流通道密闭层50和全血过滤层60按照顺序黏贴在PCB板10的微流通道11上方,从而封闭微流通道11,使反应在密闭的条件下进行,达到微全实验室的效果。第一层30为生物传感器密闭层,含有进样孔31和废液孔32;第二层40为微流通道层,连接进样孔31、生物传感器和废液孔32的通路,同时通过微泵引导待测样品由混合区41向检测区(生物传感器所在的位置)、废液区44单向流动;微流通道密闭层50为第三层,保证样品在一个密闭的管路中流动,同时全血过滤层60靠近混合区41的位置含有全血滤过系统,起到阻止红血球进入微流通道11,避免堵塞通道,提高检测结果的精确性。
本发明炎症四项标志物(PCT/IL-6/CRP/SAA)检测的生物芯片, 30nm+50nm磁珠偶联链酶亲和素用量:0.1ug~0.3ug,抗体1用量: 0.1ug~0.3ug,生物素化抗体2用量:0.1ug~0.3ug,BSA用量:0.1ug~0.25ug。其中标志物单克隆抗体有两种,抗体1用于点样,抗体2用于偶联。
实施例二
本发明炎症四项标志物(PCT/IL-6/CRP/SAA)检测的生物芯片制备方法:
采用超顺磁纳米磁微粒偶联的方法,超顺磁纳米磁微粒颗粒包括直径为30nm和直径为50nm的混合磁珠,纳米磁微粒的偶联机理是通过共价键结合,四氧化三铁在不同浓度的醋酸钠的作用还原成30nm和50nm 黑色胶体超顺磁超敏磁微粒混合悬浊液,和带有氨基的抗体/亲和素偶联。定量检测试剂制备步骤如下,
1、30nm+50nm超顺磁超敏磁微粒的制备:
(1)30nm磁珠制备:取0.75ml~2.25ml 4%Fe3O4溶液加入300ml 超纯水中使得四氧化三铁溶液终浓度0.01%~0.03%,在非磁性震荡高温加热系统上加热至200℃~300℃,加入6ml~10ml 10%醋酸钠 (CH3COONa)溶液使得醋酸钠(CH3COONa)终浓度为0.2%~0.3%,高温下反应12小时得到30nm的四氧化三铁超顺磁磁珠黑色胶体状态悬浊液。
(2)50nm磁珠制备:取0.75ml~2.25ml 4%Fe3O4溶液加入300ml 超纯水中使得四氧化三铁溶液终浓度0.01%~0.03%,在非磁性震荡高温加热系统上加热至200℃~300℃,加入3ml~6ml 10%醋酸钠 (CH3COONa)溶液使得醋酸钠(CH3COONa)终浓度为0.1%~0.2%,高温下反应12小时得到50nm的四氧化三铁超顺磁磁珠黑色胶体状态悬浊液。
(3)30nm和50nm磁珠混合:将30nm的四氧化三铁超顺磁磁珠黑色胶体状态悬浊液和50nm的四氧化三铁超顺磁磁珠黑色胶体状态悬浊液1:1混合待用。
(4)30nm和50nm磁珠混合胶体悬浊液的硅化层制备:将 30nm+50nm四氧化三铁超顺磁磁珠黑色胶体混合液放在磁块上,轻柔吸取去除上清液,沉淀物即为30nm+50nm四氧化三铁超顺磁超敏磁珠,置于密闭容器放入恒温箱内,40℃~70℃烘干8小时~12小时。将干燥的 30nm+50nm四氧化三铁超顺磁超敏磁珠复溶于HCl溶液中超声分散50 分钟,分散的30nm+50nm四氧化三铁超顺磁超敏磁珠用超纯水反复洗涤至中性,用PH值试纸检测PH达到7.0即可。洗涤好的30nm+50nm四氧化三铁超顺磁磁珠分散于乙醇、超纯水、氨水的混合液中(体积比例为75:25:1),向上述30nm+50nm四氧化三铁超顺磁超敏磁珠混合液中加入正硅酸四乙酯(TEOS),四氧化三铁(Fe3O4)与TEOS(正硅酸四乙酯)的加入比例为10:1~10:3室温无磁机械搅拌12小时~18小时形成核壳式二氧化硅层(SiO2);
2、30nm+50nm超顺磁超敏磁微粒环氧基功能化集团的共价键结合:
(1)30nm+50nm磁珠活化操作:用乙醇和超纯水分别将 30nm+50nm超顺磁超敏磁微粒清洗3次~5次,加入由γ―(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(15%)、甲醇(75%)、超纯水(10%)体积比组成的混合液,用HCL调节PH值至4,50℃水浴反应12小时~18 小时,用甲苯和丙酮分别清洗3次~5次,60℃烘干后获得含有100umol/g~300umol/g环氧基活化的30nm+50nm超敏磁珠;
(2)30nm+50nm磁珠分离纯化:
将1.1mg~1.5mg(浓度3mg/ml~5mg/ml)的超顺磁超敏30nm+50nm 磁珠加入0.6ml的Sulfo-SMCC(SS-磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环乙烷-1-羧酸酯),将5×偶联缓冲液(包括5×PBS,PH7.4 25mM EDTA,0.05%吐温20)按照4:1比例加入上述磁珠溶液,超声1~5分钟分散磁珠,将已溶解在DMSO中的SS溶液(25mg/mL)20uL添加至磁珠(ul/mg),涡旋和超声波磁珠30s,在室温下反应1小时,连续摇匀。每20分钟超声处理磁珠30s。
将经巯基再活化的30nm+50nm超敏磁珠置于磁分离器中4℃分离90 分钟~120分钟,尽量缓慢吸除上清液,不要触碰聚集的磁珠。加入 400ul~800ul的偶联缓冲液反复清洗3次~5次,再重复磁分离纯化操作之后用100ul的偶联缓冲液重新悬浮磁珠,超声分散待用;
3、偶联用单克隆抗体/链酶亲和素活化:
(1)液体配制:
反应缓冲液:1*PBS,pH8.0,5mM EDTA
保存缓冲液:1*PBS,pH7.2,5mM EDTA;
Traut's试剂(TR-2-亚胺基硫烷盐酸盐):预先称量在4℃储存的 1.6mL试管中=(TR,Mw=137.63)
(2)链酶亲和素/单克隆抗体的活化:
①将待活化的链酶亲和素/单克隆抗体用反应缓冲液稀释至 1mg/ml~3mg/ml;
②按照TR摩尔:链酶亲和素/单克隆抗体=40:1的比例计算TR溶液(0.5mg/ml~1mg/ml)的添加量;
③将0.5mg/ml~1mg/ml TR溶液加入链酶亲和素/单克隆抗体溶液中,室温孵育1小时~2小时;
④将蛋白加入脱盐离心柱内,2000转旋转3分钟~5分钟;
⑤用紫外分光光度计测量硫醇化的链酶亲和素/单克隆抗体的浓度;
4、磁珠偶联链酶亲和素/单克隆抗体:
1)将活化好的链酶亲和素/单克隆抗体加入到5mg/ml的100ul的已活化30nm+50nm磁珠中,加入100ul的偶联缓冲液,旋涡超声30秒至1 分钟;
2)室温下反应3小时~5小时,每隔10分钟~30分钟超声一次;
3)将10ul NEM(N-乙基马来酰亚胺)缓冲液(50mg/ml,在DMSO 中溶解的NEM)加入磁珠溶液中,室温反应30分钟至1小时;(NEM: N-乙基马来酰亚胺;DMSO:二甲基亚砜)
4)将磁珠试管至于强磁铁上分离磁珠,分离环境4℃,分离时间1 小时~2小时;
5)缓慢将上清液吸尽,不要触碰聚集的磁珠;
6)分离磁珠的洗涤:加入400ul~800ul的PBST缓冲液(1xPBS, pH7.2,5mM EDTA,0.01%~0.05%吐温20)旋涡混合后,将磁珠试管至于强磁铁上分离磁珠,分离环境4℃,分离时间1小时~2小时;反复洗涤5次~8次,去除未结合的磁珠和链酶亲和素/单克隆抗体;
7)将磁珠重新悬浮于400ul~600ul PBST缓冲液中,浓度调整为 2mg/ml~5mg/ml;
5、超长链生物素单克隆抗体偶联:
(1)超长链生物素溶液配制:用超纯水溶解生物素至4ug/ul~ 5ug/ul,过0.22um滤膜待用;
(2)炎症标志物单克隆抗体溶液配制:将炎症四项标志物抗体分别稀释至1ug/ul~2ug/ul,过0.22um滤膜待用;
(3)超长链生物素单克隆抗体偶联:将超长链生物素缓慢加入所偶联的单克隆抗体溶液中混匀振荡器上孵育30分钟~60分钟;
(4)超长链生物素单克隆抗体偶联分离纯化:加入离心柱中1500 转离心1分钟,小心吸取上清液,加入300ul~500ul PBS,1500转,再次离心1分钟,重复三次;去除上清液,用PBS稀释超长链生物偶联单克隆抗体至500-1000ug/ml,4℃保存待用;
6、生物芯片的加工工艺:
(1)生物芯片的生产加工:生物芯片的生产加工过程在十万级洁净度条件下进行,将晶元平台20,PCB板10(印刷电路板),金属传输线通过全自动球焊键合系统(绑定),全自动固晶系统,全自动点胶系统,全自动UV固话系统,全自动芯片清洗系统等全自动芯片加工模块自动生产自动在线监测生物芯片的加工。本发明生物芯片和传感器的金属传输线使用的是金线作为信号传输载体,保证了信号传输的准确性,减少信号传输的损失和丢失,提高了检测的灵敏度和特异性。
(2)生物芯片的检测:
在线监测:在高倍显微镜下,对于流水线生产的芯片进行抽检,进行外观检测,微观检测,物理检测(检测芯片信号传输通路,检测平均变异);
(3)中间体检测:按照取样原则取样质检,包括外观检测,微观结构检测,物理检测(信号传导性通路,不同点位不同芯片的信号值变异等);
7、生物芯片结构件加工:
(1)生物芯片结构件加工:根据芯片规格设计结构件结构图,根据结构同用激光切割机分别切割不同层的结构件(3~4层结构);
(2)生物芯片结构件加工:在线监测的不同结构件层加工的外观、尺寸、规格;
(3)生物芯片结构件的组装:用异丙醇清洗不同层的结构,按照组装图分别将各层黏贴组装在一起,对于每个结构件的定位进行检测;
(4)组装后的结构件的清洁:组装后的结构件用异丙醇进行清洁;
8、生物芯片的表面功能化:
(1)表面功能化液体配制:
活化聚合剂的配制:5mg~20mg活性化合物,加入50%~100%的异丙醇溶液(延缓聚合剂),加入纯化水混匀超声;
保护涂层溶液配制:保护涂层溶液包括体积比1%~5%的异丙醇,10%~30%活化聚合剂,5%~20%第二聚合光敏剂;5%~15%交联剂;
(2)表面保护涂层剂在芯片传感器上的点样:通过德国先进的全自动点样系统将保护涂层均匀分布于芯片,每个传感器点样需要5nl~10nl 表面涂层保护剂,通过设备对液滴形态,液滴位置,传感器上液滴分布均匀度进行在线监测;通过紫外线(200nm~300nm,50Mw~100Mw) UV固化1分钟~3分钟;
(3)芯片传感器的清洗:将固化后的芯片分别放入异丙醇和纯化水中超声清洗,去除芯片传感器表面的残留物,通过氮气吹干;
(4)表面功能化后的生物芯片的检测:对表面功能化的芯片进行抽检外观,微观结构,电子显微镜下观测芯片传感器的表面功能化层的形态,分布,UV固化效果等进行检测;
9、炎症四项标志物抗体的点样:
(1)抗体保护液配制:在磷酸盐缓冲液体系下加入1%~5%PVA(聚乙烯醇)或PVP(聚乙烯吡咯烷酮),加入0.1%~0.5%吐温20、吐温80,吐温100(聚氯乙烯20/80/100山梨酸酐单月桂酸酯),混匀后0.22um 滤膜过滤;
(2)阴性对照物质配制:用抗体保护液配置0.5mg/ml~2mg/ml BSA 溶液,混匀0.22um滤膜过滤
(3)点样抗体配制:用抗体保护液配制浓度在0.5mg/ml~2mg/ml 的炎症标志物点样抗体,超声混匀0.22um滤膜过滤。
(4)炎症四项标志物抗体和阴性对照在芯片传感器上的分布系统:通过全自动微量点样系统将抗体和阴性对照分别点在不同传感器上,每个传感器点样5nl~10nl,全自动点样系统可以同时通过高倍显微镜系统对液体形态,液滴位置,液滴在传感器上的分布情况进行在线质量检测;
(5)炎症四项标志物抗体点样后传感器的孵育结合:将富含炎症四项标志物抗体和阴性对照芯片传感器放入含有饱和氯化钾和铝块的密闭容器中4℃过夜孵育,蛋白与芯片传感器的功能集团充分,稳定的结合。
10、点样后生物芯片的封闭:
(1)芯片封闭液的配制:在Tris(三羟甲基甲氨基甲烷)盐酸缓加入0.1%~0.5%吐温20/80/100溶液,加入1%~5%乙醇胺溶液,混匀后 0.22um滤膜过滤;
(2)封闭保护液配制:在磷酸盐缓冲体系下加入0.1%~0.5%氯化钾,加入5%~10%氯化钠,混匀后0.22um滤膜过滤;
(3)生物芯片结构件的组装:将结构件与芯片传感器上的定位孔对齐,用特制的胶组装密闭。形成完整的密闭的混合区、微流通道,传感器反应区,废液区的微全实验反应系统,通过电镜系统对于每个组装后的芯片进行在线监测,包括外观,微粒通道的完整性,通道的通过性,各部分的位置等;
(4)微流控生物芯片的封闭:利用全自动微量高通量的芯片封闭全自动系统,设置流速1ul/分钟~5ul/分钟流速,使用50ul~100ul的封闭液封闭微流通道及不同传感器位点,封闭非特异性位点,封闭时间10分钟~30分钟;
(5)微流控生物芯片封闭后的清洗及保护:将封闭液排空,清洗封闭管路,加入100ul的封闭保护液,流速设置1ul/分钟~5ul/分钟流速, 50ul~80ul的封闭液保护液,清洗多余封闭液残留成份,保护点样抗体的微环境和微结构的稳定性,保护液通过时间为10分钟~30分钟;
(6)微流控生物芯片的干燥系统:将封闭后的芯片放入37℃恒温干燥箱干燥1小时~2小时,使得芯片传感器上的抗体或者蛋白完全脱水处于低能稳定的状态。干燥后密闭抽真空保存待用;
11、炎症四项标志物磁微粒微流控生物芯片定量检测试剂中间体检测:
(1)中间体包括:已点样的生物芯片,已分装的样品稀释液,已分装偶联亲和素的30nm+50nm的磁珠囊泡,已分装的偶联生物素的抗体囊泡,已分装的清洗液缓冲液囊泡,将以上中间体和芯片组装后进行中间体检测;
(2)中间体检测:分别取企业内控品(5个~7个不同抗原浓度点) 25ul-50ul加入芯片加样区插入微流控生物芯片检测仪,选择相应的检测菜单进行检测,检测仪自动刺破偶联生物素的抗体囊泡与样品和混合池自动混合30秒;检测仪自动刺破偶联亲和素(工作浓度为1mg/ml~ 2mg/ml)30nm+50nm磁珠(工作浓度为1mg/ml~2mg/ml)反应3分钟~ 5分钟,检测仪自动刺破清洗液囊泡自动清洗(1分钟~3分钟)清洗未结合的磁珠,抗原,生物素偶联抗体。检测仪自动进行数据检测与分析读数;
(3)中间体的检测数据分析:通过标准曲线拟合计算每项检测物的最低检出限,线性范围,相关性,精密度,准确性,特异性进行数据分析;性能检测要符合设定的技术要求标准;
12、炎症四项标志物检测的微流控生物芯片定量检测试剂已偶联亲和素的磁珠,已偶联生物素的抗体,清洗液缓冲液的分装:通过全自动微量分装系统,囊泡封口系统对液体进行封装;
将已偶联亲和素的30nm+50nm磁珠用稀释液稀释成工作浓度(1 mg/ml~2mg/ml),每个芯片囊泡分装量为25ul~30ul;生物素偶联的抗体稀释至工作浓度1mg/ml~2mg/ml每个芯片囊泡分装量为25ul~ 30ul,洗液为1*PBS,分装量30-50ul/囊泡;
设置全自动分装封口系统的参数,进行芯片囊泡分装液体分装封口,设备在线监测系统监测液体分装量,囊泡检漏等进行监测。
质量在线抽检芯片囊泡,对封装量,封口密闭性等进行检测;
13、标准曲线的制作:将已溯源企业标准品在相应的软件上制作拟合标准曲线,将标准曲线数据读写至芯片读取触点相应位置;
14、炎症四项标志物检测的生物芯片定量检测生物芯片半成品检测:
根据技术要求的标准组装后的半成品进行抽样检测;
包括外观检测,物理检测和性能检测
性能检测:将企业内控品平衡至室温,分别取不同浓度的内控品,交叉内控品,精密度内控品,特异性内控品,全血内控品等25ul加入相应的半成品芯片加样区内,插入设备芯片入口,启动相应的检测菜单分别对炎症标志物质控品进行检测,检测仪在15分钟~20分钟自动读取结果;
检测可接受标准:检测项目符合技术要求的参数要求(检测下限,线性范围,相关性,精密度,准确度,特异性等),全血阴性标本测试值显示为阴性,对于检测值没有干扰。
实施例三
本发明炎症四项标志物检测的具体步骤:
(1)将企业质控品和生物芯片定量检测试剂盒从冰箱取出,平衡至室温;
(2)将芯片检测仪打开,进行系统自检和预热5分钟;
(3)将所需装有芯片铝箔袋撕开取出生物芯片,在ID信息位置标注检测质控品种类,浓度等信息。
(4)加样:用100ul微量移液器分别移取炎症四项标志物的内控品 25ul加入相应芯片加样区内,将芯片插入检测仪;
(5)检测:选择检测仪相应炎症标志物检测模块启动检测,设备将在15分钟~20分钟自动读取结果;
(6)线性分析:将读取的阳性数据在标准曲线上分析数据,包括检测下限,线性范围,相关系数,精密性等进行分析;
(7)质量评价依据:检测的结果符合企业产品技术标准的要求。
实施例四
本发明炎症四项标志物检测的生物芯片定量检测试剂盒质控品的配制及检测结果说明:
1、本发明线性标准品及质控品的制备方法:
(1)线性标准品(5~7个):将不同抗原用冻干保护液分别稀释成不同浓度点,振动器混合待用。
(2)PCT线性质控品(6个浓度):0.02ng/ml~100ng/ml (0.02ng/ml,0.5ng/ml;5ng/ml;25ng/ml;50ng/ml;100ng/ml)
(3)IL-6线性质控品:0.5pg/ml~1500pg/ml(0.5pg/ml,5pg/ml; 25pg/ml;250pg/ml;750pg/ml;1500pg/ml)
(4)CRP线性质控品:0.1mg/L~200mg/L(0.1mg/L;5mg/L; 10mg/L;50mg/L;100mg/L;200mg/L)
(5)SAA线性质控品:5mg/L~300mg/L(5mg/L;10mg/L; 50mg/L;150mg/L;;300mg/L)
(6)冻干缓冲液的配制:100mM Tris-HCL缓冲液体系下,加入 1%~3%BSA,1%~5%甘氨酸,5%~10%海藻糖,0.1%~0.5%硫酸新霉素,5%~10%马血清,0.1%~0.3%Proclin-300,过0.22um滤膜待用。
降钙素原(PCT)/血清样淀粉蛋白(SAA)标准品的配制及冻干 (1000ul/支):
(1)将降钙素原(PCT)纯品抗原冻干粉稀释至1000ng/ml;将血清样淀粉蛋白(SAA)按照下表配制不同浓度标准品;
(2)按照下表分别加入高浓度的标准品和相应的冻干缓冲液,充分混匀;
(3)冻干:分装成100ul/放置在冻干机上冻干后-80℃保存待用,有效期为2年。
肌钙蛋白I(CTNI)/肌红蛋白(MYO)标准品配制表
PCT | 纯品抗原(ul) | 冻干缓冲液(ul) | SAA | 纯品抗原 | 冻干缓冲液(ul) |
0.02ng/ml | 4(取5.0ng/ml) | 996 | 5mg/L | 16.7ul(取300mg/L) | 983.3 |
0.5ng/ml | 5(取100ng/ml) | 995 | 10mg/L | 33ul(取300mg/L) | 967 |
5ng/ml | 25(取1000ng/ml) | 975 | 50mg/L | 167ul(取300mg/L) | 833 |
25ng/ml | 5(取1000ng/ml) | 995 | 150mg/L | 0.15mg | 至1000 |
50ng/ml | 50(取1000ng/ml) | 950 | 200mg/L | 0.2mg | 至1000 |
100ng/ml | 100(取1000ng/ml) | 900 | 300mg/L | 0.6mg | 至2000 |
C反应蛋白(CRP)/白介素-6(IL-6)标准品的配制及冻干(1000ul/ 支):
(1)将C反应蛋白(CRP)纯品抗原冻干粉稀释至10000ng/ml;
(2)将白介素-6(IL-6)纯品抗原冻干粉稀释至10ng/ml (10000pg/ml);
(3)按照下表分别加入高浓度的标准品和相应的冻干缓冲液,充分混匀;
冻干:分装成100ul/放置在冻干机上冻干后-80℃保存待用,有效期为2年
C反应蛋白(CRP)/白介素-6(IL-6)标准品配制表
CRP | 纯品抗原 | 冻干缓冲液(ul) | IL-6 | 纯品抗原(ul) | 冻干缓冲液(ul) |
0.1mg/L | 2ul(取50mg/L) | 998 | 0.5pg/ml | 2(取250pg/ml) | 998 |
5mg/L | 25ul(取200mg/L) | 990 | 5pg/ml | 3.3(取1500pg/ml) | 996.7 |
10mg/L | 50ul(取200mg/L) | 950 | 25pg/ml | 2.5(取10000pg/ml) | 997.5 |
50mg/L | 250ul(取200mg/L) | 750 | 250pg/ml | 25(取10000pg/ml) | 975 |
100mg/L | 0.1mg | 1000 | 750pg/ml | 76.9(取10000pg/ml) | 923.1 |
200mg/L | 0.4mg | 2000 | 1500pg/ml | 149(取10000pg/ml) | 851 |
备注:标准品/质控品的溯源依据以下标准进行标准品/质控品溯源,赋值,传递等:
《GB 21415-2008-T校准品和控制物质计量学溯源》;
《GB/T 19702-2005/ISO 15193:2002体外诊断医疗器械生物源性样品中量的测量参考测量程序的说明》
《GB/T 19703-2005/ISO 15194:2002体外诊断医疗器械生物源性样品中量的测量参考物质的说明》;
《体外诊断试剂校准品、质控品研究技术指导原则》
《体外诊断试剂分析性能评估系列指导原则》
(2)质控品的配制
质控品缓冲液:是经过处理混合人血清/血浆(50-100人混合)或者小牛血清模拟临床检测样本环境
阳性质控品的配制:每个项目选择高中低值及最低检出限企业标准冻干品4份,精密度质控品10份,用质控品稀释体系(混合人血清/血浆 /小牛血清)不同浓度的标准品干粉,4℃保存待用,有效期1个月。
具体见下表:
PCT | IL-6 | CRP | SAA |
0.02ng/ml | 0.5pg/ml | 0.1mg/L | 5mg/L |
0.5ng/ml | 5pg/ml | 5mg/L | 10mg/L |
5ng/ml | 25pg/ml | 10mg/L | 50mg/L |
25ng/ml | 250pg/ml | 50mg/L | 150mg/L |
50ng/ml | 750pg/ml | 100mg/L | 200mg/L |
100ng/ml | 1500pg/ml | 200mg/L | 300mg/L |
特异性质控品:
交叉质控品:将各项目纯品抗原稀释至1000ng/ml,4℃保存待用,有效期1个月。
经过处理混合人血清/血浆或者小牛血清阴性质控品:分装至100ul/ 支,-80℃保存有效期1年。
干扰物质质控品:将甘油三酯,血红蛋白,胆红素按照下表方法稀释,分装100ul/支,4℃保存,效期1个月。
名称 | 甘油三脂 | 血红蛋白 | 胆红素 | 备注 |
浓度 | 10mg/ml | 10mg/ml | 0.6mg/ml | |
纯品量 | 10mg | 10mg | 0.6mg | |
PBS | 1000ul | 50ng/ml | 1000ng/ml |
全血质控品:新鲜的全血样品5份,4℃保存待用,有效期2周。
2、测试本发明一种炎症四项标志物(PCT/IL-6/CRP/SAA)磁微粒微流控生物芯片定量检测试剂盒测试数据,测试结果如下:
(1)降钙素原(PCT)质控品测试数据
降钙素原(PCT)质控品检测直线回归曲线见图3。
肌钙蛋白I(CTNI)质控品检测直线回归方程数据统计表
方程:y=a+b*x,a=-0.26440,b=0.94450,r2=0.99927。
X | Y-反应值 | Y-计算值 | Y-残差 |
0.0200 | 0.0150 | -0.2455 | -0.2605 |
0.5000 | 0.4000 | 0.2079 | -0.1921 |
5.0000 | 4.5000 | 4.4581 | -0.0419 |
25.0000 | 24.0000 | 23.348 | -0.6519 |
50.0000 | 45.0000 | 46.9607 | 1.9607 |
100.0000 | 95.0000 | 94.1857 | -0.8143 |
数据个数:6
残差平方和:5.03872
本发明数据分析结论及阴阳性判定方法:
本发明降钙素原(PCT)质控品线性相关系数:r2=0.99927,精密度 (cv%):3%,线性范围:0.02ng/ml~100ng/ml,阳性符合率:100%阴性符合率:100%,无交叉反应。
阳性判定:大于0.02ng/ml具有感染发生风险;
阴性判定:小于0.02ng/ml是阴性无感染发生。
降钙素原(PCT)已经成为临床全身细菌性感染诊治过程中必不可少的POCT检测项目之一,PCT临床意义:用于鉴别脓血症(Sepsis)和系统性炎症反应综合症(SIRS),检测抗生素治疗效果及病人预后评估;用于区分菌血症和非菌血症;用于区分细菌性和病毒性感染,病毒性感染是PCT浓度在较低水平;检测抗生素治疗效果指导医生对于抗生物使用;
降钙素原(PCT)对抗生素使用的临床指导:
PCT<0.1ng/ml | 感染极不可能发生 | 不建议使用抗生物 |
0.25<PCT<0.1ng/ml | 感染不太可能发生 | 不鼓励使用抗生物 |
0.25<PCT<0.5ng/ml | 感染可能发生 | 建议使用抗生物 |
PCT>0.5ng/ml | 感染可能性较大 | 强烈建议使用抗生物 |
(2)白介素6(IL-6)质控品测试数据
白介素6(IL-6)质控品检测直线回归曲线见图4。
白介素6(IL-6)质控品检测直线回归方程数据统计表:
方程:y=a+b*x,a=-1.51962,b=0.99724,r2=0.99999。
X | Y-反应值 | Y-计算值 | Y-残差 |
0.5000 | 0.4000 | -1.0210 | -1.4210 |
5.0000 | 4.0000 | 3.4666 | -0.5334 |
25.0000 | 24.0000 | 23.4114 | -0.5886 |
250.0000 | 245.0000 | 247.7906 | 2.7906 |
750.0000 | 746.0000 | 746.4109 | 0.4109 |
1500.0000 | 1495.0000 | 1494.3415 | -0.6585 |
数据个数6
残差平方和11.03998
本发明数据分析结论及阴阳性判定方法:
本发明白介素6(IL-6)质控品线性相关系数:r2=0.99999,精密度 (cv%):2.4%,线性范围:0.5--1500pg/ml,阳性符合率:100%阴性符合率:100%,无交叉反应。
阳性判定:大于0.5pg/ml预示具有微小炎症感染风险;
阴性判定:小于0.5pg/ml是阴性结果,预示是正常。
诊断炎症及感染的临床建议
IL-6(pg/ml) | 临床意义 |
<7 | 正常 |
7~150 | 表示轻微炎症或者轻微感染 |
150~250 | 提示具有一般细菌感染或全身性炎症反应 |
>250 | 提示可能有脓血症 |
IL-6的临床意义
①在炎症反应中,IL-6的升高早于其他细胞因子,也早于CRP和 PCT,而且持续时间长,因此可用来辅助急性感染的早期诊断;
②IL-6也可用来评价感染严重程度和判断预后,当IL-6>1000pg/ml 时提示预后不良;
③动态观察IL-6水平也有助于了解感染性疾病的进展和对治疗的反应;
④IL-6指标比CRP在早期感染中更为灵敏,升高更早,恢复时下降更快,幅度更大。在感染早期、微弱的炎症刺激IL-6较CRP更灵敏可提供更好的鉴别。
(3)C反应蛋白(CRP)测试数据
C反应蛋白(CRP)质控品检测直线回归曲线见图5。
C反应蛋白(CRP)质控品检测直线回归方程数据统计表:
方程:y=a+b*x,a=-0.29596,b=0.99676,r2=0.99996。
X | Y-反应值 | Y-计算值 | Y-残差 |
0.1000 | 0.0900 | -0.1963 | -0.2863 |
5.0000 | 4.8500 | 4.6878 | -0.1622 |
10.0000 | 9.7000 | 9.6716 | -0.0284 |
50.0000 | 49.5000 | 49.5419 | 0.0419 |
100.0000 | 98.5000 | 99.3797 | 0.8797 |
200.0000 | 199.5000 | 199.0553 | -0.4447 |
数据个数:6
残差平方和:1.08240
数据分析结论及阴阳性判定方法:
本发明C反应蛋白(CRP)质控品线性相关系数:r2=0.99996,精密度(cv%):2.7%,线性范围:0.1mg/L~200mg/L,阳性符合率: 100%,阴性符合率:100%,无交叉反应。
阳性判定:大于0.1mg/L预示是具有炎症发生的风险;
阴性判定:小于0.1mg/L是阴性结果,预示是正常人群。
CRP的临床意义:CRP通常在细菌感染时浓度升高,病毒感染时浓度不升高。通常作为鉴别细菌感染和病毒感染的首选指标。
CRP的临床应用:主要应用于对炎症过程的筛选过程;用于诊断和检测感染;用于风湿病的处理;用于诊断胃肠道症状;用于儿童性疾病诊断。
CRP临床应用指导意义:
(4)人血清淀粉样蛋白A(SAA)测试数据
人血清淀粉样蛋白A(SAA)质控品检测直线回归曲线见图6。
人血清淀粉样蛋白A(SAA)质控品检测直线回归方程数据统计表:
方程:y=a+b*x,a=1.04512,b=0.97389,r2=0.99957。
X | Y-反应值 | Y-计算值 | Y-残差 |
5.0000 | 4.9000 | 5.9146 | 1.0146 |
10.0000 | 9.7000 | 10.7840 | 1.0840 |
50.0000 | 49.5000 | 49.7395 | 0.2395 |
150.0000 | 149.5000 | 147.1282 | -2.3718 |
200.0000 | 199.0000 | 195.8225 | -3.1775 |
300.0000 | 290.0000 | 293.2113 | 3.2113 |
数据个数6
残差平方和28.29559
数据分析结论及阴阳性判定方法:
本发明人血清淀粉样蛋白A(SAA)质控品线性相关系数:r2= 0.99957,精密度(cv%):2%,线性范围:5mg/L~300mg/L,阳性符合率:100%阴性符合率:100%,无交叉反应。
阳性判定:大于5mg/L预示是具有炎症发生的风险;
阴性判定:小于5mg/L是阴性结果,预示是正常人群。
SAA的临床意义:
①SAA指标比CRP更为灵敏
SAA在细菌和病毒感染中都会急速升高,CRP只在细菌感染的时候会升高,基于这种特点SAA和CRP的联合检测比单独测CRP更有独特的意义。如因物理因素所致的发热和病毒感染引起的感冒的两个病例, CRP都可能是正常,加测SAA如增高(SAA的特点是病毒感染时明显增高),可提示病毒感染的趋向性增加。
②肿瘤与SAA的相关性
研究表明,许多肿瘤如肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌等患者体内的SAA均有不同程度升高,SAA水平与肿瘤的活动期、恶性程度及转移有明显的相关性,恶性肿瘤转移阶段SAA升高通常比肿瘤稳定期显示更高的数值。因此SAA作为非特异性指标可作为肿瘤患者的疗效及预后动态观察的指标。
③移植排斥反应观察的首选指标
SAA浓度变化对于移植排异,是一个相当灵敏的指标。研究显示, 97%发生肾移植排异的检查依据是SAA的升高,而CRP浓度变化较小。因此SAA浓度可作为首选指标用于排斥反应的监测。
④SAA对冠心病风险预测的意义
SAA和hs-CRP浓度的升高对预测健康人群未来发生心血管事件危险性的可能性呈正相关,因此SAA均可以作为心血管事件危险因素的趋向性和预后的评估指标,二个指标的全部增高将对预测发生心血管事件危险性的意义更大。
以上实施例中,多组份溶液混合在没有特别说明的情况下均按照体积百分比进行混合。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种炎症四项标志物磁微粒微流控生物芯片,其特征在于,包括生物传感器,所述生物传感器为晶元平台以及晶元平台上包被的点样抗体,所述点样抗体能够与磁珠偶联的抗体和标志物蛋白形成免疫复合物,通过测定晶元平台上复合物磁阻信号强弱判断标志物蛋白浓度,所述点样抗体为炎症四项标志物PCT、IL-6、CRP、SAA抗体1,所述偶联抗体为炎症四项标志物PCT、IL-6、CRP、SAA抗体2。
2.如权利要求1所述的一种炎症四项标志物磁微粒微流控生物芯片,其特征在于,当血液样品(全血/血浆/血清/指血)中含有炎症四项标志物蛋白时,包被有点样抗体的晶元平台上将形成磁珠复合物聚集。
3.如权利要求1所述的一种炎症四项标志物磁微粒微流控生物芯片,其特征在于,所述生物传感器通过金线作为信号传输载体。
4.如权利要求1所述的一种炎症四项标志物磁微粒微流控生物芯片,其特征在于,该生物芯片包括PCB板,所述PCB板上具有微流通道,所述生物传感器设置于微流通道内,所述微流通道包括进液端和出液端,所述PCB板上依次设置有第一层和第二层,所述第一层上开设有贯穿的进样孔和废液孔,所述第二层上具有混合区和废液区,所述混合区一侧连接横向微流通道,所述横向微流通道上远离混合区的一端具有与进样孔相连,所述PCB板上的生物传感器与微流通道组成生物传感器反应区,生物芯片内流体按照以下顺序单向流动:混合区→横向微流通道→进样孔→进液端→微流通道→生物传感器反应区→出液端→废液孔→废液区。
5.如权利要求4所述的一种炎症四项标志物磁微粒微流控生物芯片,其特征在于,所述第二层上方还设置有微流通道密闭层和全血过滤层。
6.如权利要求5所述的一种炎症四项标志物磁微粒微流控生物芯片,其特征在于,所述第二层、微流通道密闭层和全血过滤层上的混合区周围开设有贯穿的加样区、第一囊泡加样孔、第二囊泡加样孔和第三囊泡加样孔,所述加样区、第一囊泡加样孔、第二囊泡加样孔和第三囊泡加样孔和混合区之间分别设置有连通的引流通道。
7.如权利要求1所述的一种炎症四项标志物磁微粒微流控生物芯片,其特征在于,所述生物传感器通过惠斯通电桥方式连接,所述生物传感器包括一个输入端和两个输出端,每组输出端的电路中含有0.1uM2~100uM2巨磁阻材料,所述生物芯片外侧具有磁场激发装置,在点样抗体与磁珠偶联抗体和标志物蛋白形成免疫复合物后,清洗生物传感器上多余的未结合的磁珠和抗体蛋白,此时磁场激发装置自动开启激发均匀磁场使磁珠磁化,所述生物传感器上被磁化的磁珠产生的磁场引起巨磁阻材料电阻的变化,进而判断生物传感器上磁珠的位置和浓度,通过标准曲线算法定量炎症标志物蛋白浓度。
8.应用权利要求1所述的一种炎症四项标志物磁微粒微流控生物芯片的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一,生物芯片前处理,在生物传感器上包被炎症四项标志物(PCT/IL-6/CRP/SAA)点样抗体;
步骤二,30nm+50nm磁珠制备及抗体偶联分离纯化系统:
Ⅰ、30nm+50nm磁珠混合液的制备:取Fe3O4溶液加入超纯水中使得四氧化三铁溶液终浓度0.01%~0.03%,在非磁性震荡高温加热系统上加热至200℃~300℃,加入10%醋酸钠溶液,使得醋酸钠终浓度为0.2%~0.3%,高温下反应得到30nm的四氧化三铁超顺磁磁珠黑色胶体状态悬浊液;
取Fe3O4溶液加入超纯水中使得四氧化三铁溶液终浓度0.01%~0.03%,在非磁性震荡高温加热系统上加热至200℃~300℃,加入10%醋酸钠溶液,使得醋酸钠终浓度为0.1%~0.2%,高温下反应得到50nm的四氧化三铁超顺磁磁珠黑色胶体状态悬浊液;
将30nm的四氧化三铁超顺磁磁珠黑色胶体状态悬浊液和50nm的四氧化三铁超顺磁磁珠黑色胶体状态悬浊液1:1混合待用;
将30nm和50nm四氧化三铁超顺磁磁珠黑色胶体状态混合悬浊液放在磁块上,轻柔吸取去上清液,并用乙醇和超纯水清洗,将洗涤好的30nm和50nm四氧化三铁超顺磁磁珠分散于乙醇、超纯水、氨水的混合液中后加入正硅酸四乙酯,搅拌形成核壳式二氧化硅层;
Ⅱ、环氧基功能化集团的共价键结合,加入由γ-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷、甲醇、超纯水组成的混合液,经过加热、清洗并烘干后,获得含有环氧基活化的30nm+50nm超敏磁珠;
Ⅲ、超顺磁超敏磁珠偶联蛋白偶联及分离纯化:
(1)30nm+50nm超敏磁珠的活化,将30nm+50nm超敏磁珠加入Sulfo-SMCC(SS-磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环乙烷-1-羧酸酯),加入偶联缓冲液,超声分散磁珠;
(2)将经巯基再活化的30nm+50nm超敏磁珠置于磁分离器中分离,吸除上清液,加入偶联缓冲液清洗,再重复磁分离纯化操作之后用偶联缓冲液重新悬浮磁珠,超声分散待用;
(3)偶联用链酶亲和素/单克隆抗体的活化;
(4)超顺磁超敏磁珠偶联链酶亲和素/单克隆抗体:将活化好的链酶亲和素/单克隆抗体加入到已活化的磁珠中,加入偶联缓冲液,超声分散,然后将试管置于强磁铁上分离磁珠;
(5)超长链生物单克隆抗体偶联:用超纯水溶解生物素,然后与单克隆抗体溶液混合孵育一段时间,离心分离去除上清液,得到超长链生物偶联单克隆抗体;
步骤三,生物素亲和素反应体系检测:取血液样品(全血/血浆/血清/指血),加入生物芯片中,芯片上预分装生物素偶联单克隆抗体,磁珠偶联亲和素囊泡分别延迟10秒~30秒被刺破,与生物素偶联的抗体和磁珠偶联亲和素进行混合反应后,进入反应区(生物芯片传感器),如果样本中含有炎症四项标志物蛋白,生物传感器上将形成磁珠的复合物聚集(Ab2-Ag-Ab1-bio-SA-MB,Ab1:偶联抗体;Ab2:点样抗体),通过测定磁阻信号定量反应出磁珠浓度,通过标准曲线算法将磁珠浓度转化成蛋白浓度,进而判断炎症四项标志物蛋白的浓度。
9.如权利要求8所述的检测方法,其特征在于,所述步骤一具体包括以下三步:
Ⅰ、生物芯片表面功能化:
(1)活化聚合剂的配制,在活性化合物中加入延缓聚合剂,加入纯水混匀超声;
(2)保护涂层溶液配制,将异丙醇、活化聚合剂、第二聚合光敏剂和交联剂均匀混合;
(3)通过全自动点样系统将保护涂层均匀分布到生物芯片的生物传感器表面,通过紫外线激发光敏物质,释放催化中的功能基团,催化单体聚合反应,通过紫外照射使得保护涂层在生物传感器表面形成稳定的固态功能保护层;
(4)生物传感器的清洗,将固化后的芯片分别放入异丙醇和纯化水中超声清洗,去除芯片传感器表面的残留物,通过氮气吹干后保存待用;
Ⅱ、生物芯片点样及孵育:
(1)抗体保护液配制,在磷酸钾缓冲液体系下加入聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮,加入吐温20、吐温80、吐温100混合均匀;
(2)阴性对照物质配制,用抗体保护液配置BSA溶液;
(3)点样抗体配制,用抗体保护液配制炎症四项标志物(PCT/IL-6/CRP/SAA)抗体,超声混匀;
(4)通过全自动微量点样系统将抗体和阴性对照分别点在不同的生物传感器上,通过高倍显微镜系统在线查看液体形态和在生物传感器上的分布情况;
(5)将点样后的生物芯片放入含有饱和氯化钾和铝块的密闭容器中孵育,使抗体蛋白与生物传感器的表面功能基团稳定结合;
Ⅲ、生物芯片的封闭:
(1)芯片封闭液的配制,在三羟甲基甲氨基甲烷盐酸缓冲液中加入吐温20/80/100溶液和乙醇胺溶液,混匀后过滤备用;
(2)封闭保护液配制,在磷酸盐缓冲体系下加入氯化钾和氯化钠,混匀后过滤备用;
(3)生物芯片的封闭系统,将封闭液注入微流通道,封闭生物传感器上多余位点;
(4)生物芯片封闭后的清洗及保护:将封闭液保护液注入微流通道,清洗多余封闭液残留成份;
(5)生物芯片的干燥,将封闭后的生物芯片放入干燥箱干燥,使得生物传感器上的抗体或者蛋白完全脱水处于低能稳定的状态,干燥后密闭抽真空保存。
10.如权利要求8或9所述的检测方法,其特征在于,将“步骤三,生物素亲和素反应体系检测”替换为:“免疫学双抗体夹心法反应体系检测”,所述“免疫学双抗体夹心法反应体系检测”具体包括:取血液样品(全血/血浆/血清/指血),将血液样品加入到生物芯片的加样区中,预先分装在生物芯片囊泡中磁珠偶联抗体被刺破混合10秒~30秒,如果样本中含有炎症四项标志物蛋白,生物传感器上将形成磁珠的复合物聚集(Ab2-Ag-Ab1-MB,Ab1:偶联抗体;Ab2:点样抗体),通过测定磁阻信号定量反应出磁珠浓度,通过标准曲线算法将磁珠浓度转化成蛋白浓度,进而判断炎症四项标志物蛋白的浓度。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810646559.XA CN108722507A (zh) | 2018-06-21 | 2018-06-21 | 一种炎症四项标志物磁微粒微流控生物芯片、检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810646559.XA CN108722507A (zh) | 2018-06-21 | 2018-06-21 | 一种炎症四项标志物磁微粒微流控生物芯片、检测方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108722507A true CN108722507A (zh) | 2018-11-02 |
Family
ID=63930376
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201810646559.XA Pending CN108722507A (zh) | 2018-06-21 | 2018-06-21 | 一种炎症四项标志物磁微粒微流控生物芯片、检测方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN108722507A (zh) |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110244036A (zh) * | 2019-07-01 | 2019-09-17 | 北京乐普医疗科技有限责任公司 | 一种用于免疫检测的微流控检测芯片及方法 |
WO2020199786A1 (zh) * | 2019-04-02 | 2020-10-08 | 京东方科技集团股份有限公司 | 微流控芯片、液态样本检测装置和方法 |
CN112147199A (zh) * | 2020-08-31 | 2020-12-29 | 济南大学 | 一种基于CoS2/MoS2-Pd的微流控电化学传感器的制备 |
CN112432985A (zh) * | 2019-08-26 | 2021-03-02 | 北京中医药大学 | 一种AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在识别MIF潜在抑制剂中的应用 |
CN112904028A (zh) * | 2021-01-21 | 2021-06-04 | 宁波职业技术学院 | 一种血清淀粉样蛋白a质控品及其制备方法 |
CN113203863A (zh) * | 2021-04-28 | 2021-08-03 | 北京美联泰科生物技术有限公司 | 一种适用于白介素-6检测的缓冲液 |
CN113504374A (zh) * | 2021-06-08 | 2021-10-15 | 复旦大学 | 一种利用Fe3O4@MXene核壳结构纳米复合物实现β-淀粉样蛋白精确检测的方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080309332A1 (en) * | 2005-07-21 | 2008-12-18 | Koninklijke Philips Electronics N. V. | Microchip Assembly With Short-Distance Interaction |
CN103386282A (zh) * | 2013-07-17 | 2013-11-13 | 江阴泽成生物技术有限公司 | 一种表面环氧基活化的具有超顺磁性微球的合成以及环氧基与蛋白连接的方法 |
CN104820099A (zh) * | 2015-04-14 | 2015-08-05 | 南京格耀生物科技有限公司 | 一种同时检测血浆中TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT和抵抗素含量的试剂盒及其应用 |
CN105241871A (zh) * | 2015-10-26 | 2016-01-13 | 深圳华迈兴微医疗科技有限公司 | 一种用于全血样品检测的磁微粒化学发光微流控芯片 |
-
2018
- 2018-06-21 CN CN201810646559.XA patent/CN108722507A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080309332A1 (en) * | 2005-07-21 | 2008-12-18 | Koninklijke Philips Electronics N. V. | Microchip Assembly With Short-Distance Interaction |
CN103386282A (zh) * | 2013-07-17 | 2013-11-13 | 江阴泽成生物技术有限公司 | 一种表面环氧基活化的具有超顺磁性微球的合成以及环氧基与蛋白连接的方法 |
CN104820099A (zh) * | 2015-04-14 | 2015-08-05 | 南京格耀生物科技有限公司 | 一种同时检测血浆中TPSⅡ、SSA、hs-CRP、PCT和抵抗素含量的试剂盒及其应用 |
CN105241871A (zh) * | 2015-10-26 | 2016-01-13 | 深圳华迈兴微医疗科技有限公司 | 一种用于全血样品检测的磁微粒化学发光微流控芯片 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
冯清: "表面光聚合反应制备三维基因芯片及蛋白微阵列研究", 《中国优秀硕士学位论文》 * |
廉洁等: "多靶标生物标志物检测的微流体磁敏生物传感器研制", 《分析化学》 * |
李文静等: "常用炎性指标在细菌感染性疾病诊断中的应用", 《中国实验诊断学》 * |
杨峰: "自旋阀GMR传感器及免疫磁珠检测", 《测试技术学报》 * |
王永进等: "GMR生物传感器的原理及研究现状", 《微纳电子技术》 * |
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2020199786A1 (zh) * | 2019-04-02 | 2020-10-08 | 京东方科技集团股份有限公司 | 微流控芯片、液态样本检测装置和方法 |
CN110244036A (zh) * | 2019-07-01 | 2019-09-17 | 北京乐普医疗科技有限责任公司 | 一种用于免疫检测的微流控检测芯片及方法 |
CN110244036B (zh) * | 2019-07-01 | 2024-04-12 | 北京乐普诊断科技股份有限公司 | 一种用于免疫检测的微流控检测芯片及方法 |
CN112432985A (zh) * | 2019-08-26 | 2021-03-02 | 北京中医药大学 | 一种AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在识别MIF潜在抑制剂中的应用 |
CN112432985B (zh) * | 2019-08-26 | 2022-07-19 | 北京中医药大学 | 一种AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在识别MIF潜在抑制剂中的应用 |
CN112147199A (zh) * | 2020-08-31 | 2020-12-29 | 济南大学 | 一种基于CoS2/MoS2-Pd的微流控电化学传感器的制备 |
CN112904028A (zh) * | 2021-01-21 | 2021-06-04 | 宁波职业技术学院 | 一种血清淀粉样蛋白a质控品及其制备方法 |
CN112904028B (zh) * | 2021-01-21 | 2023-11-24 | 宁波职业技术学院 | 一种血清淀粉样蛋白a质控品及其制备方法 |
CN113203863A (zh) * | 2021-04-28 | 2021-08-03 | 北京美联泰科生物技术有限公司 | 一种适用于白介素-6检测的缓冲液 |
CN113203863B (zh) * | 2021-04-28 | 2022-01-21 | 北京美联泰科生物技术有限公司 | 一种适用于白介素-6检测的缓冲液 |
CN113504374A (zh) * | 2021-06-08 | 2021-10-15 | 复旦大学 | 一种利用Fe3O4@MXene核壳结构纳米复合物实现β-淀粉样蛋白精确检测的方法 |
CN113504374B (zh) * | 2021-06-08 | 2024-03-08 | 复旦大学 | 一种利用Fe3O4@MXene核壳结构纳米复合物实现β-淀粉样蛋白精确检测的方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108722507A (zh) | 一种炎症四项标志物磁微粒微流控生物芯片、检测方法 | |
CN108663525A (zh) | 一种心梗心衰磁微粒微流控生物芯片、检测方法 | |
CN109061207A (zh) | 一种用于心梗标志物检测的生物芯片、检测方法 | |
CN101251540B (zh) | 乙型肝炎病毒e抗原检测微粒、其制备及应用 | |
CN101620229B (zh) | 乙型肝炎病毒e抗体检测试剂盒及检测方法 | |
CN102759631B (zh) | 一种定量检测降钙素原pct的胶乳增强免疫比浊试剂盒 | |
CN106093392B (zh) | 一种尿液外泌体分离、富集及检测的集成检测方法及检测芯片 | |
Ng et al. | Magneto-nanosensor smartphone platform for the detection of HIV and leukocytosis at point-of-care | |
CN104698184B (zh) | 检测糖类抗原的试剂盒 | |
CN106018792B (zh) | 一种胃功能检测用免疫层析试剂盒及其制备方法 | |
CN105181680B (zh) | 一种三聚氰胺的磁珠分离化学发光免疫检测方法 | |
Chiriacò et al. | On-chip screening for prostate cancer: an EIS microfluidic platform for contemporary detection of free and total PSA | |
CN103454412B (zh) | 一种用于过敏原特异性抗体检测的液相芯片及其制备方法 | |
US20110097740A1 (en) | Real-time continuous detection device | |
CN107121548A (zh) | 定量检测肿瘤标志物的试纸、制备方法及检测方法 | |
CN110133281A (zh) | Crp和saa联合检测试剂盒及其制备方法 | |
CN106443003A (zh) | 基于适配体特异识别的荧光淬灭试纸条及制备方法与应用 | |
CN101539576A (zh) | 乙型肝炎病毒前s1抗原化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 | |
CN110170344A (zh) | 微流控芯片及检测装置 | |
Yin et al. | A microfluidic chip-based MRS immunosensor for biomarker detection via enzyme-mediated nanoparticle assembly | |
CN108828231A (zh) | 一种心肺功能标志物磁微粒微流控生物芯片、检测方法 | |
CN106018829A (zh) | 一种血清淀粉样蛋白a的测定试剂及其制备方法 | |
CN108318698A (zh) | 一种便潜血乳胶增强免疫比浊试剂盒 | |
CN108387564A (zh) | 基于微流控芯片的降钙素原检测试剂盒及制备和检测方法 | |
EP3243076A1 (en) | Methods for detecting a marker for active tuberculosis |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20181102 |