CN112432985A - 一种AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在识别MIF潜在抑制剂中的应用 - Google Patents

一种AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在识别MIF潜在抑制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器的制备及其在识别MIF潜在抑制剂中的应用。所述HEMT生物传感器包括换能器和识别原件，换能器为AlGaAs/GaAs HEMT器件，识别原件是修饰在HEMT器件上的MIF抗体，通过自组装单层，将MIF修饰于HEMT器件之上，构建MIF‑AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器，并应用于识别MIF潜在抑制剂，检测浓度低至pM级，检测范围涵盖五个数量级，具有高灵敏度和强专属性。

Description

一种AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在识别MIF潜在抑制剂中 的应用
技术领域
本发明涉及一种AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器的制备及其在识别MIF潜在抑制剂中的应用。
背景技术
巨噬细胞游走抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)是一种由活化的T淋巴细胞分泌的可抑制巨噬细胞/单核细胞移动的细胞因子，广泛表达于巨噬细胞、淋巴细胞、肥大细胞、粒细胞等炎性相关细胞，在炎症反应多条调节通路中具有重要作用，被认为是炎性疾病的关键调节剂及重要生物标志物。前期数据临床数据表明，调节过敏体质方药过敏康干预过敏性鼻炎患者血液中MIF的含量显著下降，表明MIF是过敏康用于治疗过敏性鼻炎的重要靶点之一。此外，MIF在与肿瘤的发展关系密切。研究表明相对正常组织，MIF在肺癌，结肠癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌等实体瘤中表达明显上调。因此，其抑制剂的识别及靶向治疗成为炎症调节和肿瘤治疗的热点话题。
抗炎中药中的天然小分子成分是MIF抑制剂的重要来源。对于抑制剂的识别与筛选，生物传感器为分子间相互作用的识别提供了前沿技术支撑。光学型和电化学型生物传感器是目前使用最广泛的两大类生物传感器。而对于小分子化合物与生物分子间亲和作用的识别，电化学型生物传感器优势更加突出。高电子迁移率晶体管(High ElectronMobility Transistor,HEMT)作为第三代电化学型器件，具有压电极化和自发极化等电学特性，使其在二元界面上产生高的电子迁移率和二维电子气密度(2DEG)，从而使得对外加应力极其敏感。器件表面条件的状态改变，如结合生物分子，都会改变HEMT通道中2DEG的变化，进而改变电流。因此，HEMT生物传感器以其更高的灵敏度和更强的专属性为分子间相互作用的识别提供了关键的前沿技术支撑。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，提高MIF潜在抑制剂识别的准确性和灵敏度，本发明的首要目的在于提供一种AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在识别MIF潜在抑制剂中的应用。
一种用于识别MIF潜在抑制剂的AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器的制备，包括以下步骤：
(1)以AlGaAs/GaAs HEMT半导体材料为载体，将干净的AlGaAs/GaAs HEMT器件置于含巯基试剂中，于室温下浸泡，在AlGaAs/GaAs HEMT器件表面生成Au-S键，形成自组装单层；
(2)用去离子水洗去AlGaAs/GaAs HEMT器件表面的巯基试剂，碳酰二亚胺盐酸盐(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)的混合水溶液，活化反应15-30min；
(3)用PBS清洗AlGaAs/GaAs HEMT器件，加入巨噬细胞游走抑制因子(MIF)抗体的PBS溶液，置4℃冷藏反应至少2小时，即得MIF-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器；
(4)采用X射线能谱(XPS)测定AlGaAs/GaAs HEMT上修饰MIF抗体前后元素的变化，并采集其IDS-VDS信号。
一种用于识别MIF潜在抑制剂的AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器的制备，具体步骤进一步优选为：
(1)以AlGaAs/GaAs HEMT半导体材料为载体，采用CHI-660E电化学工作站，测定AlGaAs/GaAs HEMT器件各通道的IDS-VDS曲线，判断比较各通道性能，选择性能优良的通道作为测试载体；
(2)以AlGaAs/GaAs HEMT半导体材料为生物芯片载体，将一个透明的超薄石英玻璃管(高10mm，内径4mm)粘连在芯片的表面作为样品池；
(3)向样品池中加入巯基试剂，室温下浸泡反应17-24h，在AlGaAs/GaAs HEMT器件表面生成Au-S键，形成自组装单层；
(4)用去离子水洗去AlGaAs/GaAs HEMT器件表面的巯基试剂，加入碳酰二亚胺盐酸盐(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)的混合水溶液，活化反应15-30min，生成稳定的胺类活化产物，用于活化羧基；
(5)用磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗AlGaAs/GaAs HEMT器件，加入巨噬细胞游走抑制因子(MIF)抗体的PBS溶液，置4℃冷藏反应至少2小时，即得MIF-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器；
(6)采用XPS技术测定AlGaAs/GaAs HEMT上修饰MIF抗体前后元素的变化，并采集其IDS-VDS信号。
本发明还提供了上述AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在识别MIF潜在抑制剂中的应用，具体步骤如下：
(1)分别精密称取抗炎中药中有效成分5-O-甲基维斯阿米醇苷标准品置于容量瓶中，分别加入10mM PBS溶液配置成1mM 5-O-甲基维斯阿米醇苷标准品溶液作为母液，按十倍梯度稀释母液至0.1pM，制备6-11个浓度梯度5-O-甲基维斯阿米醇苷标准品梯度浓度样品溶液；
(2)按上述AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器制备方法制备MIF-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器，并以此为反应器件，按化合物浓度由低到高的顺序依次向MIF-AlGaAs/GaAsHEMT器件上加入5-O-甲基维斯阿米醇苷标准品溶液，采用电化学装置记录源极-漏极间的电流强度IDS；
(3)分别以5-O-甲基维斯阿米醇苷溶液浓度的对数Lg为横坐标，以电流变化相对值(I-I0)/I0为纵坐标，进行线性拟合；
(4)分别以5-O-甲基维斯阿米醇苷标准品溶液的浓度([C])为横坐标，以浓度([C])/电流变化(I-I0)为纵坐标，进行线性拟合，求得小分子化合物与MIF相互作用的解离常数，判断小分子化合物是否可作为MIF的潜在抑制剂。
本发明的有益效果是：
MIF参与过敏反应及多种肿瘤的炎症反应通路，是重要的疾病治疗靶点之一，其抑制剂的识别成为研究热点。生物传感器以其高灵敏度和强专属性为分子间相互作用的识别提供重要技术支撑。本发明将MIF修饰于AlGaAs/GaAs HEMT器件之上，构建MIF-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器，直接识别MIF潜在抑制剂，检测浓度低至pM级，检测范围涵盖5个数量级，具有很高的灵敏度。此外，MIF-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器具有很高的专属性，能够直观反应化合物与MIF相互作用情况，在抑制剂的识别中具有独特优势。
附图说明
图1蛋白修饰结果，(a)电信号表征结果；(b)XPS表征结果。
图2不同浓度5-O-甲基维斯阿米醇苷与MIF结合的IDS-VDS信号变化。
图3不同浓度5-O-甲基维斯阿米醇苷与MIF结合的线性拟合结果。
具体实施方式
实施例1一种MIF-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器的制备
(1)采用CHI-660E电化学工作站工作站，测定GaAs/GaAs HEMT器件各通道的IDS-VDS曲线，判断比较各通道性能。
(2)将干净的AlGaAs/GaAs HEMT器件置于3-巯基丙酸(3-MPA)水溶液，于室温下浸泡，在AlGaAs/GaAs HEMT器件表面生成Au-S键，形成自组装单层；
(3)用去离子水洗去AlGaAs/GaAs HEMT器件表面的3-MPA，加入20mM碳酰二亚胺盐酸盐(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)和50mMN-羟基丁二酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)体积比为1:1的混合水溶液，生成稳定的胺类活化产物用于活化羧基；
(4)用PBS清洗AlGaAs/GaAs HEMT器件，加入巨噬细胞游走抑制因子(MIF)抗体，反应完成，即得MIF-AlGaAs/GaAs HEMT器件生物传感器。
实施例2一种MIF-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器的制备
(1)采用CHI-660E电化学工作站工作站，测定GaAs/GaAs HEMT器件各通道的IDS-VDS曲线，判断比较各通道性能。
(2)以AlGaAs/GaAs HEMT半导体材料为生物芯片载体，将一个透明的超薄石英玻璃管(高10mm，内径4mm)粘连在芯片的表面作为样品池；
(3)向样品池中加入3-巯基丙酸(3-MPA)水溶液，室温下浸泡反应24h，在AlGaAs/GaAs HEMT器件表面生成Au-S键，形成自组装单层(SAM)；
(4)用去离子水洗去AlGaAs/GaAs HEMT器件表面的3-MPA，加入20mM碳酰二亚胺盐酸盐(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)和50mMN-羟基丁二酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)体积比为1:1的混合水溶液60μL，活化反应15min，生成稳定的胺类活化产物，用于活化羧基；
(5)用10mM磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗AlGaAs/GaAs HEMT器件，加入100mg/mL巨噬细胞游走抑制因子(MIF)抗体的PBS溶液，置4℃冷藏反应2小时，即得MIF-AlGaAs/GaAsHEMT生物传感器；
(6)采用X射线能谱测定AlGaAs/GaAs HEMT上修饰MIF抗体前后元素的变化，并采用CHI-660E电化学工作站其IDS-VDS信号，结果如图1所示，由图可知，MIF修饰之后，电流发生明显改变，表明MIF成功修饰于AlGaAs/GaAs HEMT器件之上，MIF-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器成功构建。
实施例3一种AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在MIF与5-O-甲基维斯阿米醇苷分子间相互作用检测中的应用
(1)以实施例2制备好的MIF-AlGaAs/GaAs HEMT为反应器件，配置小分子溶液浓度范围为0.1pM-1.0mM，按浓度由低到高的依次向MIF-AlGaAs/GaAs HEMT器件上加入5-O-甲基维斯阿米醇苷标准溶液，采用电化学装置记录源极-漏极间的电流强度(IDS)，不同浓度下的IDS-VDS信号如图2所示；由图可知，当浓度范围为0.1pM-1.0μM时，IDS信号的绝对值不断下降；当浓度超过1.0μM时，IDS信号变化无规律；
(2)以5-O-甲基维斯阿米醇苷标准溶液浓度的对数(Lg[Ag])为横坐标，以电流变化相对值(I-I0)/I0为纵坐标，进行线性拟合，结果表明当浓度范围为1.0pM-10nM时，线性关系较好；取1.0pM-10nM五个浓度点进行线性拟合，结果如图3所示，由图可知，线性关系良好，方程为y＝-0.0378x-0.5585(R2＝0.9994)；
(3)根据(2)的浓度范围，以5-O-甲基维斯阿米醇苷标准溶液的浓度([Ag])为横坐标，以浓度([Ag])/电流变化(I-I0,ΔI)为纵坐标，进行线性拟合，得到线性方程为y＝214.59x+1E-08,(R2＝0.9997)；根据公式
Figure BDA0002178912600000041
Figure BDA0002178912600000042
Figure BDA0002178912600000051
其中[Ab]为MIF浓度，[Ag]为5-O-甲基维斯阿米醇苷的浓度[C]，K及KA为结合常数，KD为解离常数，ΔI为电流变化值，ΔImax为电流最大变化值。
计算5-O-甲基维斯阿米醇苷与MIF相互作用的解离常数KD，得KD＝4.660×10-11M。

Claims (7)

1.一种AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在识别MIF潜在抑制剂中的应用，其特征在于，所述AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器包括换能器和识别原件，换能器为AlGaAs/GaAs HEMT器件，识别原件是修饰在HEMT器件上的MIF抗体。
2.一种权利要求1中所述AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器的制备方法，具体步骤如下：
(1)将干净的AlGaAs/GaAs HEMT器件置于含巯基试剂中，于室温下浸泡，在AlGaAs/GaAs HEMT器件表面生成Au-S键，形成自组装单层；
(2)用去离子水洗去AlGaAs/GaAs HEMT器件表面的巯基试剂，加入羧基活化剂，生成稳定的胺类活化产物用于活化羧基；
(3)用PBS清洗AlGaAs/GaAs HEMT器件，加入巨噬细胞游走抑制因子抗体，反应完成，即得MIF-AlGaAs/GaAs HEMT器件生物传感器。
3.根据权利要求2所述的AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的羧基活化剂包括碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，活化时间为15-30min。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中巨噬细胞游走抑制因子抗体的反应温度为4℃，反应时间不低于2小时。
5.一种权利要求1所述的AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在识别MIF潜在抑制剂中的应用，其特征在于，具体步骤如下：
(1)根据权利要求2-4任一项所述制备方法制备MIF-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器，依次加入浓度由低到高的化合物溶液，采用电化学装置记录源极-漏极间的电流强度；
(2)以化合物浓度的对数为横坐标，以电流变化相对值为纵坐标，进行线性拟合，确定MIF-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器用于检测对应化合物的浓度范围；
(3)以化合物的浓度为横坐标，以(2)中确定浓度范围的浓度/电流变化为纵坐标，进行线性拟合，根据公式
Figure FDA0002178912590000011
Figure FDA0002178912590000012
Figure FDA0002178912590000013
其中[Ab]为MIF浓度，[Ag]为化合物浓度[C]，K及KA为结合常数，KD为解离常数，ΔI为电流变化值，ΔImax为电流最大变化值；
求得化合物与MIF相互作用的解离常数，判断化合物对MIF的潜在抑制作用。
6.根据权利要求5中所述的AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在识别MIF潜在抑制剂中的应用，其特征在于，步骤(1)中化合物的浓度范围为1pM–10nM。
7.根据权利要求5中所述的AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在识别MIF潜在抑制剂中的应用，其特征在于，步骤(1)中测量电压范围为0–2V。
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