CN113008968B - 一种IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在检测IL-1β潜在抑制剂中的应用 - Google Patents

一种IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在检测IL-1β潜在抑制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在检测IL‑1β潜在抑制剂中的应用，其特征在于，所述IL‑1β‑AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器是以AlGaAs/GaAs HEMT器件为换能器，以修饰在HEMT器件上的白介素1β蛋白为识别原件，通过自组装单层，构建IL‑1β‑AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器，用于辨识IL‑1β的潜在抑制剂，检测浓度低至pM级，检测范围涵盖五个数量级，具有高灵敏度和强专属性。

Description

一种IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在检测IL-1β潜在 抑制剂中的应用
技术领域
本发明属于中药领域，具体涉及一种IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在检测IL-1β潜在抑制剂中的应用。
背景技术
过敏反应，又称Ⅰ型超敏反应，是异常免疫反应的结果，会引发炎症，血管舒张，神经过敏等。据统计全世界约有3亿人患有哮喘，超过5亿人患有变应性鼻炎，湿疹及特异性皮炎患者约有4亿人。调查结果表名，我国过敏性鼻炎的患病率短短五年时间已经从11.1％上升到17.6％，部分城市高达百分之二十以上；湿疹分急性、亚急性、慢性三期，难治愈，易复发，多发于婴幼儿，严重影响婴幼儿的健康；过敏性紫癜是小儿常见的出血性疾病之一，发病年龄多为3-14岁，有较高致死率，临床治疗仍存在困难。过敏性疾病威胁着全球30-40％人口的生活质量，已成为临床上亟待攻克的关键难题之一。
过敏反应最常见的症状是炎症反应，而白介素1β(IL-1β)作为常见的炎症因子，在炎症反应多条调节通路中具有重要作用，被认为是炎性疾病的关键调节剂及重要生物标志物。前期研究数据表明，调节过敏体质方药过敏康方干预过敏性鼻炎患者血液中IL-1β的含量显著下降，表明IL-1β是过敏康用于治疗过敏性鼻炎的重要靶点之一。其抑制剂的检测及靶向药物开发对于过敏性疾病的治疗具有重要作用。
对于抑制剂的识别与筛选，生物传感器为分子间相互作用的识别提供了前沿技术支撑。光学型和电化学型生物传感器是目前使用最广泛的两大类生物传感器。而对于小分子化合物与生物分子间亲和作用的识别，电化学型生物传感器优势更加突出。高电子迁移率晶体管(High Electron Mobility Transistor,HEMT)作为第三代电化学型器件，具有压电极化和自发极化等电学特性，使其在二元界面上产生高的电子迁移率和二维电子气密度(2DEG)，从而使得对外加应力极其敏感。器件表面条件的状态改变，如结合生物分子，都会改变HEMT通道中2DEG的变化，进而改变电流。因此，HEMT生物传感器以其更高的灵敏度和更强的专属性为分子间相互作用的识别提供了关键的前沿技术支撑。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，开发高效抗过敏药物，提高IL-1β抑制剂识别的准确性和灵敏度，本发明的首要目的在于提供一种IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在检测IL-1β抑制剂中应用。
一种用于识别IL-1β抑制剂的IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器的制备，包括以下步骤：
(1)以AlGaAs/GaAs HEMT半导体材料为载体，采用CHI-660E电化学工作站，测定AlGaAs/GaAs HEMT器件各通道的IDS-VDS曲线，判断比较各通道性能，选择性能优良的通道作为测试载体；
(2)以AlGaAs/GaAs HEMT半导体材料为载体，将干净的AlGaAs/GaAs HEMT器件置于含巯基试剂中，于室温下浸泡，在AlGaAs/GaAs HEMT器件表面生成Au-S键，形成自组装单层；
(3)用去离子水洗去AlGaAs/GaAs HEMT器件表面的巯基试剂，加入碳酰二亚胺盐酸盐(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)的混合水溶液，活化反应15-30min，生成稳定的胺类活化产物，用于活化羧基；
(4)用磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗AlGaAs/GaAs HEMT器件，加入IL-1β的PBS溶液，置4℃冷藏反应至少2小时，即得IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器；
(5)采用XPS技术测定IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT上修饰IL-1β前后元素的变化，并采集其IDS-VDS信号。
本发明进一步提供了上述IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在识别IL-1β抑制剂中的应用，具体步骤如下：
(1)分别精密称取苦杏仁苷标准品置于容量瓶中，分别加入10mM PBS溶液配置成1mM苦杏仁苷标准品溶液作为母液，按十倍梯度稀释母液至0.1pM，制备6-11个浓度梯度苦杏仁苷标准品梯度浓度样品溶液；
(2)按上述AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器制备方法制备IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器，并以此为反应器件，按化合物浓度由低到高的顺序依次向IL-1β-AlGaAs/GaAsHEMT器件上加入苦杏仁苷标准品溶液，采用电化学装置记录源极-漏极间的电流强度IDS；
(3)分别以苦杏仁苷溶液浓度的对数Lg为横坐标，以电流变化相对值(I-I0)/I0为纵坐标，进行线性拟合；
(4)分别以苦杏仁苷标准品溶液的浓度([C])为横坐标，以浓度([C])/电流变化(I-I0)为纵坐标，进行线性拟合，求得小分子化合物与IL-1β相互作用的解离常数，判断小分子化合物是否可作为IL-1β的抑制剂。
本发明还提供了IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻苷、天麻素与IL-1β相互作用强度检测中的应用。
本发明的有益效果是：
IL-1β参与过敏反应及多种肿瘤的炎症反应通路，是重要的疾病治疗靶点之一，其抑制剂的识别成为研究热点。生物传感器以其高灵敏度和强专属性为分子间相互作用的识别提供重要技术支撑。本发明将IL-1β修饰于AlGaAs/GaAs HEMT器件之上，构建IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器，直接识别IL-1β抑制剂，检测浓度低至pM级，检测范围涵盖5个数量级，具有很高的灵敏度。此外，IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器具有很高的专属性，能够直观反应化合物与IL-1β相互作用情况，在抑制剂的识别中具有独特优势。
附图说明
图1蛋白修饰结果。
图2不同浓度苦杏仁苷与IL-1β结合的IDS-VDS信号变化。
图3不同浓度苦杏仁苷与IL-1β结合的线性拟合结果。
图4不同浓度5-O-甲基维斯阿米醇苷与IL-1β结合的线性拟合结果。
图5不同浓度升麻苷与IL-1β结合的线性拟合结果。
图6(a)不同浓度天麻素与IL-1β结合的IDS-VDS信号变化；(b)不同浓度天麻素和IL-1β结合的线性拟合结果。
具体实施方式
实施例1一种IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器的制备
(1)采用CHI-660E电化学工作站工作站，测定GaAs/GaAs HEMT器件各通道的IDS-VDS曲线，判断比较各通道性能。
(2)将干净的AlGaAs/GaAs HEMT器件置于3-巯基丙酸(3-MPA)水溶液，于室温下浸泡，在AlGaAs/GaAs HEMT器件表面生成Au-S键，形成自组装单层；
(3)用去离子水洗去AlGaAs/GaAs HEMT器件表面的3-MPA，加入20mM碳酰二亚胺盐酸盐(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)和50mMN-羟基丁二酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)体积比为1:1的混合水溶液，生成稳定的胺类活化产物用于活化羧基；
(4)用PBS清洗AlGaAs/GaAs HEMT器件，加入IL-1β，反应完成，即得IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT器件生物传感器。
(5)采用X射线能谱测定AlGaAs/GaAs HEMT上修饰IL-1β前后元素的变化，并采用CHI-660E电化学工作站其IDS-VDS信号，结果如图1所示，由图可知，IL-1β修饰之后，电流发生明显改变，表明IL-1β成功修饰于AlGaAs/GaAs HEMT器件之上，IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器成功构建。
实施例2一种IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在IL-1β与苦杏仁苷分子间相互作用检测中的应用
(1)以实施例2制备好的IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT为反应器件，配置小分子溶液浓度范围为0.1pM-1.0mM，按浓度由低到高的依次向IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT器件上加入苦杏仁苷标准溶液，采用电化学装置记录源极-漏极间的电流强度(IDS)，不同浓度下的IDS-VDS信号如图2所示；由图可知，当浓度范围为0.1pM-1.0μM时，IDS信号的绝对值不断下降；当浓度超过1.0μM时，IDS信号变化无规律；
(2)以苦杏仁苷标准溶液浓度的对数(Lg[Ag])为横坐标，以电流变化相对值(I-I0)/I0为纵坐标，进行线性拟合，结果表明当浓度范围为1.0pM-10nM时，线性关系较好；取1.0pM-10nM五个浓度点进行线性拟合，结果如图3所示，由图可知，线性关系良好，方程为y＝-0.02820x-0.4190(R2＝0.9996)；
(3)根据(2)的浓度范围，以苦杏仁苷标准溶液的浓度([Ag])为横坐标，以浓度([Ag])/电流变化(I-I0,ΔI)为纵坐标，进行线性拟合，得到线性方程为y＝4924.6x+3E-08,(R2＝0.9996)；根据公式
Figure GDA0003621545030000051
Figure GDA0003621545030000052
Figure GDA0003621545030000053
其中[Ab]为IL-1β浓度，[Ag]为苦杏仁苷的浓度[C]，K及KA为结合常数，KD为解离常数，ΔI为电流变化值，ΔImax为电流最大变化值。
计算苦杏仁苷与IL-1β相互作用的解离常数KD，得KD＝6.092×10-12M。
实施例3一种IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在IL-1β与5-O-甲基维斯阿米醇苷分子间相互作用检测中的应用
(1)以实施例2制备好的IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT为反应器件，配置小分子溶液浓度范围为0.1pM-1.0mM，按浓度由低到高的依次向IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT器件上加入5-O-甲基维斯阿米醇苷标准溶液，采用电化学装置记录源极-漏极间的电流强度(IDS)，不同浓度下的IDS-VDS信号如图2所示；由图可知，当浓度范围为0.1pM-1.0μM时，IDS信号的绝对值不断下降；当浓度超过1.0μM时，IDS信号变化无规律；
(2)以5-O-甲基维斯阿米醇苷标准溶液浓度的对数(Lg[Ag])为横坐标，以电流变化相对值(I-I0)/I0为纵坐标，进行线性拟合，结果表明当浓度范围为1.0pM-10nM时，线性关系较好；取1.0pM-10nM五个浓度点进行线性拟合，结果如图4所示，由图可知，线性关系良好，方程为y＝-0.01410x-0.0861(R2＝0.9914)；
(3)根据(2)的浓度范围，以5-O-甲基维斯阿米醇苷标准溶液的浓度([Ag])为横坐标，以浓度([Ag])/电流变化(I-I0,ΔI)为纵坐标，进行线性拟合，得到线性方程为y＝-218.8x+2E-07,(R2＝0.9991)；根据公式
Figure GDA0003621545030000054
Figure GDA0003621545030000055
Figure GDA0003621545030000056
其中[Ab]为IL-1β浓度，[Ag]为5-O-甲基维斯阿米醇苷的浓度[C]，K及KA为结合常数，KD为解离常数，ΔI为电流变化值，ΔImax为电流最大变化值。
计算5-O-甲基维斯阿米醇苷与IL-1β相互作用的解离常数KD，得KD＝0.9141×10- 9M。
实施例4一种IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在IL-1β与升麻苷分子间相互作用检测中的应用
(1)以实施例2制备好的IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT为反应器件，配置小分子溶液浓度范围为0.1pM-1.0mM，按浓度由低到高的依次向IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT器件上加入升麻苷标准溶液，采用电化学装置记录源极-漏极间的电流强度(IDS)，不同浓度下的IDS-VDS信号如图2所示；由图可知，当浓度范围为0.1pM-1.0mM时，IDS信号的整体变化趋势为绝对值不断下降；浓度在1.0nM-10μM时，IDS信号变化规律性较强；
(2)以升麻苷标准溶液浓度的对数(Lg[Ag])为横坐标，以电流变化相对值(I-I0)/I0为纵坐标，进行线性拟合，结果表明当浓度范围为1.0nM-10μM时，线性关系较好；取1.0nM-10μM五个浓度点进行线性拟合，结果如图5所示，由图可知，线性关系良好，方程为y＝-0.01710x-0.2842(R2＝0.9827)；
(3)根据(2)的浓度范围，以5-O-甲基维斯阿米醇苷标准溶液的浓度([Ag])为横坐标，以浓度([Ag])/电流变化(I-I0,ΔI)为纵坐标，进行线性拟合，得到线性方程为y＝-715.4x+3E-05,(R2＝0.9999)；根据公式
Figure GDA0003621545030000061
Figure GDA0003621545030000062
Figure GDA0003621545030000063
其中[Ab]为IL-1β浓度，[Ag]为升麻苷标准品的浓度[C]，K及KA为结合常数，KD为解离常数，ΔI为电流变化值，ΔImax为电流最大变化值。
计算升麻苷与IL-1β相互作用的解离常数KD，得KD＝4.193×10-8M。
实施例5一种IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在IL-1β与天麻素分子间相互作用检测中的应用
(1)以实施例2制备好的IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT为反应器件，配置天麻素标准品小分子溶液浓度范围为0.1pM-1.0mM，按浓度由低到高的依次向IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器上加入天麻素标准溶液，采用电化学装置记录源极-漏极间的电流强度(IDS)，各浓度天麻素标准品溶液IDS-VDS如图6(a)所示，由图可知，IDS信号基本不受浓度影响。
(2)以天麻素标准品溶液浓度的对数(Lg[Ag])为横坐标，以电流变化相对值(I-I0)/I0为纵坐标，进行线性拟合，并对比苦杏仁苷测定结果(图6(b))，由图6(b)可知，天麻素与IL-1β基本无亲和作用。

Claims (3)

1.一种IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在检测IL-1β抑制剂中应用，其特征在于，具体步骤如下：
步骤1：制备IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器，依次加入浓度由低到高的化合物溶液，采用电化学装置记录源极-漏极间的电流强度；
步骤2：以化合物浓度的对数为横坐标，以电流变化相对值为纵坐标，进行线性拟合，确定IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器用于检测对应化合物的浓度范围；根据公式计算化合物与IL-1β相互作用强度，判断化合物对IL-1β的潜在抑制作用；
步骤1中的IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器，所述IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器的制备方法为：
(1-1)将干净的AlGaAs/GaAs HEMT器件置于含巯基试剂中，于室温下浸泡，在AlGaAs/GaAs HEMT器件表面生成Au-S键，形成自组装单层；
(1-2)用去离子水洗去AlGaAs/GaAs HEMT器件表面的巯基试剂，加入羧基活化剂，生成稳定的胺类活化产物用于活化羧基；
(1-3)用PBS清洗AlGaAs/GaAs HEMT器件，加入IL-1β，反应完成，即得IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器；
所述化合物为苦杏仁苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和升麻苷。
2.根据权利要求1中所述的IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在检测IL-1β抑制剂中应用，其特征在于，步骤1中化合物的浓度范围为0.1pM–10μM，测量电压范围为0–5V。
3.根据权利要求1所述的IL-1β-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在检测IL-1β抑制剂中应用，其特征在于，步骤(1-2)中的羧基活化剂为碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，活化时间为15-30min，步骤(1-3)中IL-1β的反应温度为4℃，反应时间不低于2小时。
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