CN103698284B - 一种测定Lambda游离轻链浓度的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定Lambda游离轻链浓度的试剂盒及方法。该试剂盒包括反应缓冲液和Lambda游离轻链抗体溶液，所述的Lambda游离轻链抗体溶液中吐温-20的浓度为11～16ml/L。本发明的试剂盒解决了Lambda游离轻链比浊测定中的非特异反应问题，为临床医生提供可靠的Lambda游离轻链测定结果作为诊断参考，以便充分发挥胶乳增强免疫比浊方法学速度快、通量高的优势，缩短检测时间，利于临床应用和病人诊断。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种测定Lambda游离轻链浓度的试剂盒及方法。
背景技术
免疫球蛋白（Ig）轻链分为κ（kappa）和λ（lambda）2个型别，每个Ig分子上只有一个型别的轻链，人类κ（kappa）和λ（lambda）的比例为6：4。轻链为能自由通过肾小球基底膜的小分子蛋白质，在肾小管被重吸收回到血液循环中，所以正常人尿中只有少量轻链存在。当人体发生代谢失调和多发性骨髓瘤时，血液中出现大量游离轻链，并由尿中排出，即为Bence-Jones蛋白（本周蛋白）。在正常人体内，血清κ型游离轻链为3～19mg/L，λ型游离轻链为6～26mg/L，κ/λ比值为0.26～1.65。异常情况的κ型游离轻链以及和κ/λ比值、或异常λ型游离轻链和κ/λ比值、或同时三者均异常等情况，对单克隆性γ球蛋白增多症（monoclonal gammopathies,MGP）的敏感性为88%～98%；对非分泌性骨髓瘤（nonsecretory myeloma,NSM）的敏感性为65%～70%，有助于单克隆轻链病、AL-淀粉样变的早期诊断，也可用于化疗或自身外周血干细胞移植后是否复发的监测，如果化疗或移植效果好，则病患血清κ型游离轻链、λ型游离轻链以及κ/λ比值均在正常水平或相比治疗前有明显改善。
胶乳增强比浊方法可在全自动生化仪上测定λ型游离轻链，速度快、通量高。对于游离轻链的测定，国内目前主要使用英国Binding site公司的Freelite系列测定试剂，可以通过胶乳增强比浊方法测定Lambda游离轻链；但在临床应用中，Freelite系列的Lambda游离轻链测定试剂存在大量的非特异反应，造成很多结果与病人实际情况不符合，不仅不能给医生诊断带来参考，还容易误导医生判断，目前在国内医院推广应用很有限。
同时，发明人使用按照常规方式制备的Lambda游离轻链试剂，在未使用该特殊发明方法时也出现与Freelite试剂类似的非特异反应情况；由于不论是Freelite系列Lambda游离轻链测定试剂还是发明人自行制备的Lambda游离轻链试剂，均存在临床测定非特异反应严重的问题，因此，可以认为非特异反应严重是Lambda游离轻链比浊测定试剂盒制备中一大共同难点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于为了克服现有的Lambda游离轻链测定非特异反应的缺陷，提供了一种测定Lambda游离轻链浓度的试剂盒及方法。本发明的测定方法可以得到可靠的Lambda游离轻链测定结果。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
本发明提供了一种采用胶乳增强比浊方法测定Lambda游离轻链浓度的试剂盒，其包括反应缓冲液（R1试剂）和Lambda游离轻链抗体溶液（R2试剂），其特征在于，所述的Lambda游离轻链抗体溶液中吐温-20的浓度为11～16ml/L。
其中，所述的Lambda游离轻链抗体溶液中的Lambda游离轻链抗体较佳地为兔抗人多克隆Lambda游离轻链抗体，更佳地为Dako公司的兔抗人多克隆Lambda游离轻链抗体（即Dako公司的Polyclonal Rabbit Anti-HumanLambda Free Light Chains，货号为A0101）。
其中，所述的Lambda游离轻链抗体溶液的组成较佳地为Dako公司的兔抗人多克隆Lambda游离轻链抗体（货号为A0101）0.5mg/ml、胶乳微球3mg/ml、吐温-2011～16ml/L和防腐剂Proclin-3000.3ml/L。上述组成中，胶乳微球可购于国际知名胶乳供应商，如Bangslab公司或JSR公司。
其中，所述的反应缓冲液可为本领域Lambda游离轻链浓度测定方法中胶乳增强比浊方法常规使用的反应缓冲液，优选反应缓冲液的组成为4-羟乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）100mmol/L、氯化钠150mmol/L、吐温-201ml/L和防腐剂Proclin-300 0.3ml/L。
本发明还提供了一种测定Lambda游离轻链浓度的方法，其包括下述步骤：采用胶乳增强比浊方法，将待测样品与上述反应缓冲液和Lambda游离轻链抗体溶液混合后，计算吸光度变化ΔA，与标准品的工作曲线比较即可得到待测样品的Lambda游离轻链浓度，其特征在于，所述的Lambda游离轻链抗体溶液中吐温-20的浓度为11～16ml/L。
本发明中，所述的胶乳增强比浊方法是指一种在全自动生化仪上测定Lambda游离轻链浓度的常用方法，一般在相同的基本参数下（波长、方法学、样本试剂比例、反应时间），先使用确定浓度的标准品在全自动生化仪使用对应的测定试剂进行校准测试，得到对应的测定试剂的校准曲线（工作曲线），然后，使用相同的测定试剂，在全自动生化仪上测试待测样品，由全自动生化仪对照校准曲线自动计算出待测样品中被测物含量；具体操作可参见《全国临床检验操作规程第三版》（东南大学出版社，书号：9787564105839，2006年11月）及各仪器使用说明书。
其中，所述的全自动生化仪较佳地为型号为Olympus AU480或Hitachi7170的全自动生化仪。
其中，所述的反应缓冲液可为本领域Lambda游离轻链浓度测定方法中胶乳增强比浊方法常用的反应缓冲液（R1试剂）；所述的Lambda游离轻链抗体溶液可为本领域Lambda游离轻链浓度测定方法中胶乳增强比浊方法常用的Lambda游离轻链抗体溶液（R2试剂）。
其中，所述的吸光度变化ΔA可由下述方法得到：将待测样品与反应缓冲液混合后，37℃恒温5分钟，再加入Lambda游离轻链抗体溶液，30秒后测定吸光度为A1；37℃恒温4分30秒，测定吸光度为A2，计算吸光度变化ΔA=A2-A1。
其中，所述的工作曲线可由下述方法得到：将确定浓度的标准品与反应缓冲液混合后，37℃恒温5分钟，再加入Lambda游离轻链抗体溶液，30秒后测定吸光度为A01；37℃恒温4分30秒，测定吸光度为A02，计算吸光度变化ΔA0=A02-A01，以ΔA0与标准品的确定浓度作图，即可。
其中，所述的待测样品较佳地为血清和/或骨髓分离血清。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
（1）本发明解决了Lambda游离轻链比浊测定中的非特异反应问题，为临床医生提供可靠的Lambda游离轻链测定结果作为诊断参考，以便充分发挥胶乳增强免疫比浊方法学速度快、通量高的优势，缩短检测时间，利于临床应用和病人诊断。
（2）本发明使用的方法简单有效，原料无毒且方便购买，利于生产放大和推广应用。
附图说明
图1为A试剂盒的工作曲线。
图2为A-a试剂盒的工作曲线。
图3为A-b试剂盒的工作曲线。
图4为A-a试剂盒与A-b试剂盒的测定结果的相关性曲线。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中的全自动生化仪为型号为Olympus AU480的全自动生化仪。
本发明采用胶乳增强比浊方法在全自动生化仪上测定Lambda游离轻链浓度的操作可参见《全国临床检验操作规程第三版》（东南大学出版社，书号：9787564105839，2006年11月）。
A试剂盒（购于上海艾柯特医疗产品有限公司）中的反应缓冲液（R1试剂）和Lambda游离轻链抗体溶液（R2试剂）的组成如下：
A试剂盒中反应缓冲液（R1试剂）的组成
| 成分 | 名称 | 浓度 |
| 1 | 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（Hepes） | 100mmol/L |
| 2 | 氯化钠（NaCl） | 150mmol/L |
| 3 | 吐温-20 | 1ml/L |
| 4 | 防腐剂Proclin-300 | 0.3ml/L |
A试剂盒中Lambda游离轻链抗体溶液（R2试剂）的组成
| 成分 | 名称 | 浓度 |
| 1 | Lambda游离轻链抗体 | 0.5mg/ml |
| 2 | 胶乳微球 | 3mg/ml |
| 3 | 吐温-20 | 1ml/L |
| 4 | 防腐剂Proclin-300 | 0.3ml/L |
上述A试剂盒中的Lambda游离轻链抗体为丹麦Dako公司的PolyclonalRabbit anti HUM Lambda free light chains，其货号为A0101；乳胶微球来源于日本JSR公司，其货号为P0112。
采用胶乳增强比浊方法，将3μl确定浓度的标准品与A试剂盒中的150μl反应缓冲液混合后，37℃恒温5分钟，再加入A试剂盒中的150μl Lambda游离轻链抗体溶液，30秒后测定吸光度为A01（检测波长：600nm），37℃恒温4分30秒，测定吸光度为A02（检测波长：600nm），计算吸光度变化ΔA0=A02-A01，以ΔA0与标准品的确定浓度作图，即得到A试剂盒的工作曲线，如图1所示。
下述实施例中的标准品来源于英国Randox公司（朗道实验诊断有限公司）特定蛋白质控SP286LPC（货号），待测样品来源于上海曙光医院。
Freelite试剂购于英国Binding site公司。
实施例1
对A试剂盒进行改进，改变Lambda游离轻链抗体溶液（R2试剂）中的吐温-20的浓度为11ml/L，其他组成成分的浓度不变，记为A-a试剂盒，具体组成如下：
A-a试剂盒中反应缓冲液（R1试剂）的组成
| 成分 | 名称 | 浓度 |
| 1 | 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（Hepes） | 100mmol/L |
| 2 | 氯化钠（NaCl） | 150mmol/L |
| 3 | 吐温-20 | 1ml/L |
| 4 | 防腐剂Proclin-300 | 0.3ml/L |
A-a试剂盒中Lambda游离轻链抗体溶液（R2试剂）的组成
| 成分 | 名称 | 浓度 |
| 1 | Lambda游离轻链抗体 | 0.5mg/ml |
| 2 | 胶乳微球 | 3mg/ml |
| 3 | 吐温-20 | 11ml/L |
| 4 | 防腐剂Proclin-300 | 0.3ml/L |
工作曲线的绘制：
采用胶乳增强比浊方法，将3μl确定浓度的标准品与A-a试剂盒中的150μl反应缓冲液混合后，37℃恒温5分钟，再加入A-a试剂盒中的150μlLambda游离轻链抗体溶液，30秒后测定吸光度为A01（检测波长：600nm），37℃恒温4分30秒，测定吸光度为A02（检测波长：600nm），计算吸光度变化ΔA0=A02-A01，以ΔA0与标准品的确定浓度作图，即得到A-a试剂盒的工作曲线，如图2所示。
采用胶乳增强比浊方法，将3μl待测样品与A-a试剂盒中的150μl反应缓冲液混合后，37℃恒温5分钟，再加入A-a试剂盒中的150μl Lambda游离轻链抗体溶液，30秒后测定吸光度为A1（检测波长：600nm），37℃恒温4分30秒，测定吸光度为A2（检测波长：600nm），计算吸光度变化ΔA=A2-A1，与标准品的工作曲线（图2）比较即得到待测样品的Lambda游离轻链浓度，测定结果如表1所示。
同样采取胶乳增强比浊方法，使用A试剂盒以及Freelite试剂进行待测样品的测试，测定结果列于表1中。
表1采用不同的试剂盒的测定结果
实施例2
对A试剂盒进行改进，改变Lambda游离轻链抗体溶液（R2试剂）中的吐温-20的浓度为16ml/L，其他组成成分的浓度不变，记为A-b试剂盒，具体组成如下：
A-b试剂盒中反应缓冲液（R1试剂）的组成
| 成分 | 名称 | 浓度 |
| 1 | 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（Hepes） | 100mmol/L |
| 2 | 氯化钠（NaCl） | 150mmol/L |
| 3 | 吐温-20 | 1ml/L |
| 4 | 防腐剂Proclin-300 | 0.3ml/L |
A-b试剂盒中Lambda游离轻链抗体溶液（R2试剂）的组成
| 成分 | 名称 | 浓度 |
| 1 | Lambda游离轻链抗体 | 0.5mg/ml |
| 2 | 胶乳微球 | 3mg/ml |
| 3 | 吐温-20 | 16ml/L |
| 4 | 防腐剂Proclin-300 | 0.3ml/L |
工作曲线的绘制：
采用胶乳增强比浊方法，将3μl确定浓度的标准品与A-b试剂盒中的150μl反应缓冲液混合后，37℃恒温5分钟，再加入A-b试剂盒中的150μlLambda游离轻链抗体溶液，30秒后测定吸光度为A01（检测波长：600nm），37℃恒温4分30秒，测定吸光度为A02（检测波长：600nm），计算吸光度变化ΔA0=A02-A01，以ΔA0与标准品的确定浓度作图，即得到A-b试剂盒的工作曲线，如图3示。
采用胶乳增强比浊方法，将3μl待测样品与A-b剂盒中的150μl反应缓冲液混合后，37℃恒温5分钟，再加入A-b试剂盒中的150μl Lambda游离轻链抗体溶液，30秒后测定吸光度为A1（检测波长：600nm），37℃恒温4分30秒，测定吸光度为A2（检测波长：600nm），计算吸光度变化ΔA=A2-A1，与标准品的工作曲线（图3）比较即得到待测样品的Lambda游离轻链浓度，测定结果如表2所示。
同样采取胶乳增强比浊方法，使用A试剂盒以及Freelite试剂进行待测样品的测试，测定结果列于表2中。
表2采用不同的试剂盒的测定结果
从表1和表2可以看到，本发明的两个实施例中，吐温-20浓度为11ml/L和16ml/L时，测定结果更加符合临床，即正常人以及非λ型轻链病的其他疾病患者测定结果落在6-26mg/L的参考值范围内，λ型轻链病患者测定结果>26mg/L，κ型轻链病患者（重症）患者测定结果也低于6mg/L的下限；而未使用本发明的试剂以及Freelite试剂均出现不同程度的非特异反应，测定结果不符合临床，测定结果偏高非常多，出现不同程度的假阳性（FalsePositive）。
考察实施例1和实施例2中，Lambda游离轻链抗体溶液中吐温-20的浓度为11ml/L和16ml/L时，测定结果的相关性：以吐温-20的浓度为11ml/L时测定结果为x轴，以吐温-20的浓度为16ml/L时测定结果为y轴，得分析数据图如图4所示。通过分析可以看到，两种实施例测定结果相关性良好，相关性系数R2=1，这说明Lambda游离轻链抗体溶液中吐温-20的浓度在11～16ml/L区间内测定结果差异不大；且通过两实施例结果可以看到，本发明很好的解决了临床标本的非特异反应问题，与病人实际情况相符度高。可以为医生临床诊断提供可靠的参考，并可充分发挥胶乳增强免疫比浊方法学速度快、通量高的优势，缩短检测时间，利于临床应用和病人诊断。
Claims (8)
1.一种采用胶乳增强比浊方法测定Lambda游离轻链浓度的试剂盒，其包括反应缓冲液和Lambda游离轻链抗体溶液，其特征在于，所述的Lambda游离轻链抗体溶液中吐温-20的浓度为11～16ml/L，所述的Lambda游离轻链抗体溶液中的Lambda游离轻链抗体为Dako公司的兔抗人多克隆Lambda游离轻链抗体。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的Lambda游离轻链抗体溶液的组成为Dako公司的兔抗人多克隆Lambda游离轻链抗体0.5mg/ml、胶乳微球3mg/ml、吐温-20 11～16ml/L和防腐剂Proclin-300 0.3ml/L。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的反应缓冲液的组成为4-羟乙基哌嗪乙磺酸100mmol/L、氯化钠150mmol/L、吐温-20 1ml/L和防腐剂Proclin-300 0.3ml/L。
4.一种非疾病诊断或治疗目的测定Lambda游离轻链浓度的方法，其包括下述步骤：采用胶乳增强比浊方法，将待测样品与如权利要求1～3中任一项所述的试剂盒中的反应缓冲液和Lambda游离轻链抗体溶液混合后，计算吸光度变化ΔA，与标准品的工作曲线比较即可得到待测样品的Lambda游离轻链浓度。
5.如权利要求4所述的测定Lambda游离轻链浓度的方法，其特征在于，所述的吸光度变化ΔA由下述方法得到：将待测样品与反应缓冲液混合后，37℃恒温5分钟，再加入Lambda游离轻链抗体溶液，30秒后测定吸光度为A1；37℃恒温4分30秒，测定吸光度为A2，计算吸光度变化ΔA＝A2-A1。
6.如权利要求4所述的测定Lambda游离轻链浓度的方法，其特征在于，所述的工作曲线由下述方法得到：将确定浓度的标准品与反应缓冲液混合后，37℃恒温5分钟，再加入Lambda游离轻链抗体溶液，30秒后测定吸光度为A01；37℃恒温4分30秒，测定吸光度为A02，计算吸光度变化ΔA0＝A02-A01，以ΔA0与标准品的确定浓度作图，即可。
7.如权利要求4所述的测定Lambda游离轻链浓度的方法，其特征在于， 所述的待测样品为血清。
8.如权利要求4所述的测定Lambda游离轻链浓度的方法，其特征在于，所述的待测样品为骨髓分离血清。
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