CN101769932A

CN101769932A - 全量程c反应蛋白检测试剂盒

Info

Publication number: CN101769932A
Application number: CN201010103429A
Authority: CN
Inventors: 邹炳德; 夏佳音
Original assignee: MEIKANG BIOTECH CO Ltd NINGBO
Current assignee: Medical System Biotechnology Co ltd
Priority date: 2010-01-26
Filing date: 2010-01-26
Publication date: 2010-07-07
Anticipated expiration: 2030-01-26
Also published as: CN101769932B

Abstract

本发明公开一种全量程C反应蛋白检测试剂盒，该试剂盒包含试剂R1、试剂R2，所述的试剂R1为适当的缓冲液；所述的试剂R2为：用抗人C反应蛋白抗体致敏两种或几种不同平均粒径的苯乙烯胶乳，将致敏后的不同平均粒径的苯乙烯胶乳分别置于适当的缓冲液中形成试剂，然后将上述的试剂分别按照不同比例混合起来即为试剂R2，该试剂R2中结合有抗人C反应蛋白抗体的苯乙烯胶乳的含量为0.8～3.5mg/ml。本发明的全量程C反应蛋白检测试剂盒既可以测定低CRP含量，又可以测定高CRP含量，且灵敏度高、稳定性强、测定准确。

Description

全量程C反应蛋白检测试剂盒

技术领域

本发明属于医学免疫学领域，涉及一种免疫检测试剂，进一步地，本发明涉及一种全量程C反应蛋白检测试剂盒。

背景技术

C反应蛋白(CRP)是一种能和肺炎链球菌的荚膜C多糖结合，是机体受到微生物入侵或组织损伤等刺激时肝细胞合成的急性时相蛋白，痕量存在于健康人血清中(约580ng/ml)。当发生炎症疾病或组织发生溃烂或坏死时，会在血液中急速升高，但随着组织结构和功能的复原其含量也恢复正常。因此，高浓度CRP的测定在诊断细菌感染、癌症等疾病的严重性、进程、预后以及治疗效果方面具有广泛临床意义。

另一方面，CRP作为心血管疾病最强的危险指标，其水平可预测将来心肌梗塞及中风的危险性。健康人CRP参考范围基本为0.58～1.13mg/L。CRP含量＞2.1mg/L的人，比较CRP含量≤1mg/L者，将来发生心肌梗塞的危险性为后者的2.9倍；发生缺血性中风的危险性为后者的1.9倍；发生外周动脉血管性疾病的危险性为后者的4.1倍。CRP与血脂(总胆固醇，总胆固醇：高密度脂蛋白胆固醇的比值)的联合测定，较其他的危险因子更能预示发生心、脑血管疾病的危险性，是目前进行冠心病危险评估的最佳模型。最近研究表明，低浓度CRP的测定还可作为新生儿感染，局部感染等疾病以及各种相关疾病如牙周病的诊断标志物。

所谓全量程CRP是基于其测定方法更敏感，测定范围更宽广而命名。临床常规测定CRP的方法为免疫比浊法，测定范围一般为3～200mg/L，但存在灵敏度相对较低，无法准确测定3mg/L以下水平的CRP含量，因此，无法作为心、脑血管疾病的危险指标，预测将来心、脑血管疾病发生的危险性。临床高敏CRP测定范围为0.1～100mg/L，测定范围又相对较窄，无法准确测定高浓度水平下的CRP含量，因此，无法用于感染性疾病的诊断或疗效观察。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种既可以测定低CRP含量，又可以测定高CRP含量，且灵敏度高、稳定性强、测定准确的全量程C反应蛋白检测试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：一种全量程C反应蛋白检测试剂盒，该试剂盒包含试剂R1、试剂R2，所述的试剂R1为适当的缓冲液；

所述的试剂R2为：用抗人C反应蛋白抗体致敏两种或几种不同平均粒径的苯乙烯胶乳(包括平均粒径较大的苯乙烯胶乳和平均粒径较小的苯乙烯胶乳)，然后将致敏后的苯乙烯胶乳分别置于适当的缓冲液中形成试剂，然后将上述试剂按照不同比例混合起来即为试剂R2，试剂R2中结合有抗人C反应蛋白抗体的苯乙烯胶乳的含量为0.8～3.5mg/ml。

上述的抗人C反应蛋白抗体为兔抗人C反应蛋白抗体。

在本发明中，上述所述的缓冲液包括但不限于PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液、氯化铵缓冲液以及其他具有相似性质的缓冲液中的一种或几种。

在本发明所述的全量程C反应蛋白测定试剂盒中，还可包含CRP校准品，所述的CRP校准品中CRP含量间于0～400mg/L。

本发明还包含一种使用说明书(见实施例2)。

本发明上面所述的不同平均粒径的苯乙烯胶乳，其平均粒径在0.01～1.5μm之间，粒径小于0.01μm时，胶乳颗粒聚集产生的光密度变化太小，结果很难达到试验敏感度要求，在制备试剂的时候，需要花费过多的离心时间，延长了试剂生产的时间，增加了试剂成本且不利于重复性。而粒径大于1.5μm的胶乳颗粒在测量高浓度检测物时，其聚集产生的光密度变化超过了检测限，结果很难获得对应于分析物浓度的光密度变化，而且颗粒太大会加速自聚集，导致分散性降低。胶乳颗粒粒径随着试验方法和设备的改变而改变。所选择的颗粒粒径最好是介于0.05～0.5μm之间。

本发明不同平均粒径的苯乙烯胶乳中，平均粒径较小的苯乙烯胶乳颗粒的粒径优选为在0.04～0.1μm之间选择，以保证所制备的检测试剂盒使得抗原抗体反应试验能够在一个较宽的范围内进行，并且能够长时间稳定，适用于利用光密度测定装置的血清学试验。而粒径小于0.04μm会延长试剂生产时间，而粒径大于0.1μm却会增加背景，降低低浓度测定时的准确性。因此，用于制备本发明测定试剂盒的平均较小粒径胶乳颗粒的最佳粒径为0.05～0.095μm之间。

本发明不同平均粒径的苯乙烯胶乳中，平均粒径较大的苯乙烯胶乳颗粒的粒径范围优选为0.15～0.5μm。

本发明采用胶乳凝集反应法检测C反应蛋白，胶乳凝集反应法是一种间接凝集试验，其原理是包被了抗原或抗体的胶乳微粒，与标本中相应抗体或抗原发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物形成所产生的浊度，即可测出标本中被检物的含量。在本发明中，血清中的C反应蛋白与结合在胶乳颗粒表面的抗人C反应蛋白抗体结合，产生抗原抗体反应，使胶乳颗粒形成聚集。在570nm波长处测定吸光度，对照标准曲线可求出C反应蛋白的含量。

本发明的优点和有益效果：

1.普通CRP检测试剂盒仅限于检测3mg/L以上水平的CRP含量，不能用于预测将来心、脑血管疾病发生的危险性以及局部感染或小病灶的检测。然而，本发明的试剂盒不仅可以准确测定3mg/L以下水平的CRP含量，灵敏度可达10μg/L，能够用于心、脑血管疾病发生的危险性预测以及局部感染或小病灶的检测，而且还可以准确测定高浓度水平下的CRP含量(含量高达400mg/L，见表2)，因此能够用于诊断各种感染性和炎症等疾病。

2.本发明是一种抗原抗体反应试验方法，特别之处在于，本发明采用化学交联法，用抗体致敏2种或几种不同平均粒径的胶乳颗粒，然后将致敏后的胶乳颗粒按照不同比例混合起来。小粒径胶乳颗粒使试剂具有宽范围，可以检测高浓度范围内被检测物的含量，而大粒径胶乳颗粒使试剂具有比较高的灵敏度，可以检测到低浓度范围内被检测物的含量。

3.本发明的检测试剂盒是通过使用2种或几种胶乳颗粒所制备的诊断试剂，使得抗原抗体反应试验从低浓度到高浓度这样一个比较宽的范围内具有高敏感度和高准确性，且获得的试剂具有较长时间的稳定性，特别适用于光度检测装置如分光光度计，浊度仪，光散射光度仪等。

4.本发明测定试剂盒为液体双试剂，具有灵敏、准确、特异、抗干扰性强等优点，本发明使得CRP的检测更为经济、方便和快速，适用于自动分析仪测定人血清中CRP的含量。

5.本发明的试剂盒与现有的R1和R2中均含有胶乳颗粒的试剂盒比较，上述现有公开的试剂盒里面其R1、R2溶液中均含有胶乳颗粒，则R1、R2试剂直接与含有抗原物质的血清接触，则血清里面的某些物质会导致胶乳颗粒非特异性聚集，从而导致非特性反应的发生，而本发明的试剂盒里面，R1里面会加入一些物质如去垢剂TritonX-100，进行生化反应的时候，R1首先和血清进行孵育，去除掉血清中那些能够引起胶乳颗粒非特异性聚集的物质，然后再加入R2，这样就可以避免非特异性反应的发生。然而，R1、R2都含有胶乳颗粒的试剂盒，就算是相同的人用相同的操作所制备的试剂盒重复性都不好，因为胶乳试剂的制备中有很多不可控因素，而且由于2个试剂中都含有胶乳颗粒，调节有一定难度。但是，本发明的试剂盒，就算R2的重复性不好，但是，本发明的R1中不含胶乳溶液，可以通过调节R1，很容易地使得试剂盒最终的重复性达到一致。

附图说明

图1显示了7种不同胶乳配比的CRP标准曲线，其中X轴表示CRP的浓度(含量)；Y轴表示吸光度。

具体实施方式

实施例1全量程CRP反应试剂盒的制备

本发明的试剂盒涉及试剂的主要原材料如下：

1.兔抗人CRP抗体(20.5mg/mL)：采用间接ELISA法测定效价为1∶500000以上。

2.胶乳：本发明采用的两种苯乙烯胶乳为带羧基基团的苯乙烯胶乳，苯乙烯胶乳颗粒平均粒径分别为60nm和240nm。其中60nm的购自Bangs公司，240nm为自制的，制备方法为：将4.2595g苯乙烯(St)、0.6000g甲基丙烯酸(MAA)、水加入到三口烧瓶后搅拌10～30min；在搅拌结束后，向混合体系中通入30min的N₂，然后加入50ml含有过硫酸钾和氯化钠的水溶液(其中含有过硫酸钾0.1065g，氯化钠0.0032g)，再继续通入20min的N₂；然后升温至60～80℃，反应12h以上；反应完成后将反应体系冷却到室温后，再用去离子水多次清洗，直至离心出的上清液的电导率与去离子水的相似，经上述纯化后得到固含量为10％的苯乙烯胶乳溶液，苯乙烯胶乳颗粒平均粒径为240nm。

本实施例的主要试剂的配制如下：

试剂R1：含3％PEG(聚乙二醇)，2％NaCl，0.05％TritonX-100的氯化铵缓冲液，该试剂为无色透明溶液。

试剂R2：用兔抗人CRP抗体分别致敏平均粒径为60nm和240nm两种胶乳颗粒，致敏后置于适当的缓冲液中形成试剂，然后再按一定比例将上述试剂混合起来即为试剂R2，具体过程如下：在1ml苯乙烯胶乳(以胶乳颗粒平均粒径为60nm，胶乳固含量为10％的苯乙烯胶乳为例)中，加入碳化二亚胺(EDAC)至终浓度为11.5mg/ml，然后再加入NHS(N-羟基琥珀酰亚胺或称N-羟基丁二酰亚胺)至终浓度为11.5mg/ml(上述两个11.5mg/ml分别为EDAC和NHS最终在胶乳溶液中的浓度)；在25℃混匀20min；12000rpm，4℃离心25min；弃上清液，加入10ml 0.05M(M表示mol/L，以下同)pH5.5的2-吗啉乙磺酸(MES)溶液，超声重悬；然后再用0.05M pH5.5的2-吗啉乙磺酸溶液(或称缓冲液)稀释兔抗人胱抑素C抗体，得到10ml 5mg/ml的抗体稀释液；将10ml上述的抗体稀释液快速加入到10ml超声重悬后的胶乳中，混匀；4℃混匀过夜；然后再加入50μl乙醇胺，25℃混匀20min；12000rpm，4℃离心25min；弃上清液，再加入10ml0.15M、pH7.4的PBS缓冲液(又称磷酸盐缓冲溶液)(PBS缓冲液含有1％牛血清白蛋白BSA)，超声重悬，25℃混匀30min；12000rpm，4℃离心25min，弃上清液，加入0.15M、pH7.4的PBS缓冲液(含有0.1％BSA，0.1％NaN₃)，使得其中结合有兔抗人C反应蛋白抗体的苯乙烯胶乳的含量为1.8mg/ml，超声重悬；

平均粒径为240nm的苯乙烯胶乳以和上述平均粒径为60nm的苯乙烯胶乳相同方法处理；

各取少量经上述过程处理的胶乳，分别以小颗粒(平均粒径为60nm)胶乳比大颗粒(平均粒径为240nm)胶乳的体积比为1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，2∶1，3∶1，4∶1的比例分别混合起来，测定标准曲线(图1)，根据测定的标准曲线，然后选择上述体积比2∶1的混合试剂(从标准曲线即图1可以看出，当小粒径与大粒径体积比为2∶1时，低浓度和高浓度均可以测定)，该试剂为乳白色溶液即作为试剂R2。

C反应蛋白校准品为：在含2％牛血清白蛋白的PBS缓冲液中加入不同含量的CRP蛋白，除菌过滤。这些校准品均为无色透明液体。

实施例2C反应蛋白的测定

检测工具：日立7060型自动分析仪。

分析方法：2点终点法；主波长：570nm，副波长：700nm：样品量：4.0μl(微升)；R1：140μl；R2：140μl；校准方式：样条函数Spline；反应方向：上升；测定温度：37℃；样品与R1混匀后，于第10秒读取吸光度A₁；于3-5分钟时加入R2，于5分钟时读取吸光度A₂。反应吸光度的计算为A₂与A₁的校准差值。

计算方法：多点定标，以样条函数作为计算模式，根据吸光度与参考血清的值作剂量/响应曲线，样品含量可根据其吸光度值在剂量/响应曲线上算出。

参考范围：血清C反应蛋白＜8.2mg/L，健康人无感染时C反应蛋白＞1mg/L，能预示将来发生心、脑血管疾病的危险性；血清＞8.2mg/L，用于感染性疾病的诊断或疗效观察。

实施例3全量程CRP检测试剂盒各项性能指标测试

1.灵敏度试验

测定6种不同CRP含量的样品，每个样品测10次，通过计算均值和SD值，从表1可见，本发明检测试剂盒的灵敏度为0.3mg/L。

表1

CRP(mg/L)	测定次数	均值	2.6SD	M+2.6SD	M-2.6SD
CRP(mg/L)	测定次数	均值	2.6SD	M+2.6SD	M-2.6SD	0	10	0.0000	0.031	0.05	-0.02

CRP(mg/L)	测定次数	均值	2.6SD	M+2.6SD	M-2.6SD
CRP(mg/L)	测定次数	均值	2.6SD	M+2.6SD	M-2.6SD	0.1	10	0.0904	0.044	0.10	0.01
0.2	10	0.1878	0.056	0.16	0.04	0.1	10	0.0904	0.044	0.10	0.01
0.2	10	0.1878	0.056	0.16	0.04	0.3	10	0.2915	0.058	0.21	0.08
0.4	10	0.3977	0.044	0.23	0.12	0.3	10	0.2915	0.058	0.21	0.08
0.4	10	0.3977	0.044	0.23	0.12	0.5	10	0.4912	0.032	0.25	0.15

2.高值线性测定

测定10种不同CRP含量的样品，每个样品测2次，从表2可见，本发明检测试剂盒的最高检测范围可达到400mg/L。

表2

	CRP理论值(mg/L)	CRP实际值(mg/L)
	CRP理论值(mg/L)	CRP实际值(mg/L)	1	0	0.11
2	50	51.24	1	0	0.11
2	50	51.24	3	100	101.78
4	150	152.41	3	100	101.78
4	150	152.41	5	200	200.6
6	250	248.9	5	200	200.6
6	250	248.9	7	300	302.0
8	350	348.7	7	300	302.0
8	350	348.7	9	400	492.9
10	450	421.3	9	400	492.9

3.精密度试验

使用2种不同CRP含量的人血清样品，测定本发明检测试剂盒的批内和批间精密度。结果表明，本发明检测试剂盒的批内精密度为4.55％和3.23％(见表3)，而批间精密度则为7.42％和5.79％(见表4)。

表3

	样品1	样品2
	样品1	样品2	测定次数	20	20
平均值(mg/L)	1.21	80.25	测定次数	20	20
平均值(mg/L)	1.21	80.25	最小值(mg/L)	1.15	79.88
最大值(mg/L)	1.26	81.70	最小值(mg/L)	1.15	79.88
最大值(mg/L)	1.26	81.70	标准差(SD)	0.055	2.590
变异系数(CV％)	4.55	3.23	标准差(SD)	0.055	2.590

表4

批间精密度	样品1	样品2
批间精密度	样品1	样品2	测定次数	20	20
平均值(mg/L)	1.25	80.11	测定次数	20	20
平均值(mg/L)	1.25	80.11	最小值(mg/L)	1.19	79.80
最大值(mg/L)	1.24	81.77	最小值(mg/L)	1.19	79.80
最大值(mg/L)	1.24	81.77	标准差(SD)	0.093	4.638
变异系数(CV％)	7.42	5.79	标准差(SD)	0.093	4.638

4.干扰试验

在同一份人血清样品中分别加入不同含量的干扰物质后进行测定。加入干扰物质后的测定值除以加入干扰物质前的测定值即为影响率，试验结果表明游离胆红素，结合胆红素，血红蛋白以及乳糜微粒的浓度分别在200mg/dl，200mg/dl，5000mg/dl以及21000FTU以下时，它们对测定结果的干扰均在2％以下(见表5)。

表5

5.稳定性试验

在2～8℃贮存条件下，分别在0月、4月、8月、12月和14月对同一血清样本进行测定，每个样本测5次，取均值(结果见表6)。结果表明，4月、8月、12月和14月与0月相比，测得值差异很小，说明本发明的检测试剂盒在2～8℃贮存条件下可稳定一年。

表6

项目	0月	4月	8月	12月	14月
项目	0月	4月	8月	12月	14月	试剂空白吸光度A₀	0.6875	0.6789	0.6899	0.6901	0.6887
样本测得值(％)	21.60	22.11	22.05	21.98	21.77	试剂空白吸光度A₀	0.6875	0.6789	0.6899	0.6901	0.6887
样本测得值(％)	21.60	22.11	22.05	21.98	21.77	批内CV(％)	1.25	1.09	1.48	1.65	2.15

试剂开封后，在35天内，35次测定同一份血清样本的吸光度均值、最小值、最大值、标准差和吸光度日间变异(见表7)，可见本发明中使用的试剂即使在开封后，可稳定一个月以上。

表7

吸光度均值	吸光度最小值	吸光度最大值	吸光度标准差	日间变异CV(％)
吸光度均值	吸光度最小值	吸光度最大值	吸光度标准差	日间变异CV(％)	0.6854	0.6785	0.6972	4.4551	6.5

Claims

1.一种全量程C反应蛋白检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含试剂R1、试剂R2，所述的试剂R1为适当的缓冲液；

所述的试剂R2为：用抗人C反应蛋白抗体致敏两种或几种不同平均粒径的苯乙烯胶乳，将致敏后的不同平均粒径的苯乙烯胶乳分别置于适当的缓冲液中形成试剂，然后将上述的试剂分别按照不同比例混合起来即为试剂R2，试剂R2中结合有抗人C反应蛋白抗体的苯乙烯胶乳的含量为0.8～3.5mg/ml。

2.根据权利要求1所述的全量程C反应蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述的适当的缓冲液为PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液或氯化铵缓冲液中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的全量程C反应蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述的不同平均粒径的苯乙烯胶乳，该胶乳颗粒的平均粒径范围为0.01～1.5μm。

4.根据权利要求3所述的全量程C反应蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述的不同平均粒径的苯乙烯胶乳，该胶乳颗粒的平均粒径范围为0.05～0.5μm。

5.根据权利要求3所述的全量程C反应蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述的不同平均粒径的苯乙烯胶乳，包括粒径范围为0.15～0.5μm的平均粒径较大的苯乙烯胶乳，还包括粒径范围为0.04～0.1μm的平均粒径较小的苯乙烯胶乳。

6.根据权利要求5所述的全量程C反应蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述的平均粒径较小的苯乙烯胶乳其粒径范围为0.05～0.095μm。

7.根据权利要求1所述的全量程C反应蛋白检测试剂盒，其特征在于：上述的全量程C反应蛋白测定试剂盒中，还包含C反应蛋白校准品，所述的C反应蛋白校准品中C反应蛋白含量间于0～400mg/L。