CN102955033A - 一种测定人血液中甘胆酸的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定人血液中甘胆酸的试剂盒,包括试剂A、试剂B及已知浓度的甘胆酸校准品,其中,试剂A与试剂B质量比为1-5:1;所述试剂A的各组分为:微生物抑制剂,EDTA,甘油,牛血清白蛋白,表面活性剂,反应增强剂,氯化钠,pH6-8的Good’s缓冲液;试剂B的各组分为:微生物抑制剂,EDTA,甘油,牛血清白蛋白,表面活性剂,反应增强剂,氯化钠,pH6-8的Good’s缓冲液,与甘胆酸单克隆抗体交联的纳米微球。本发明检测操作简便、快速,可以同时进行大批量样本快速测定,检测的准确度、灵敏度好。
Description
技术领域
本发明涉及一种免疫检测试剂盒,特别涉及一种测定人血液中甘胆酸的试剂盒。
背景技术
甘胆酸(cholyglycine,CG)是胆酸和甘氨酸结合而成的结合胆酸。是主要胆酸之一,胆酸(CA)和鹅去氧胆酸(CDCA)总称胆汁酸。肝损伤的生化指标中CG比谷丙转氨酶,胆红素等试验更敏感。急性肝炎,慢性活动性肝炎,原发性肝癌,肝硬化及慢性迁延性肝炎,血清CG的水平均高于正常对照组,升高阳性率按上述顺序递减。尤其在临床鉴别慢性活动性肝炎和慢性迁延性肝炎方面,CG可做为一项有价值的指标,慢活肝CG升高的幅度和频率均高于慢迁肝。对判断慢性活动性肝炎的进展和缓解,预测疗效和复发均有很好价值。
目前现有的测定方法有:
1、Elisa测定方法:该方法一般用于半定量的测定,测定准确度、灵敏度、精密度较差,而且操作比较繁琐,不利于在临床中广泛应用。
2、化学发光测定方法:该方法灵敏度较高,但是测定准确度和试剂稳定性较差,而且需要专用的化学发光测定设备,测定速度较慢,临床应用局限性明显。
3、放射免疫测定方法:该方法因为试剂有放射性污染和试剂有效期短暂(半衰期)等缺陷已经被淘汰。
目前我国市场上适合临床的甘胆酸测定试剂盒短缺,尤其缺乏能准确、简便、快速测定、 又能进行大批量标本同时测定的试剂。
发明内容
本发明的目的在于一种测定人血液中甘胆酸的试剂盒,检测操作简便、快速,可以同时进行大批量样本快速测定,检测的准确度、灵敏度好。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种测定人血液中甘胆酸的试剂盒,所述试剂盒包括试剂A、试剂B及已知浓度的甘胆酸校准品,其中,试剂A与试剂B质量比为1-5 : 1;
所述试剂A的各组分及其含量为:微生物抑制剂0.001-1.1g/L,EDTA 0.05- 5.0 g/L,甘油0.1-10.0 g/L,牛血清白蛋白0.1-5.0g/L,表面活性剂0.01-3.0g/L,反应增强剂0.5-5.0g/L,氯化钠0.1-8.0g/L,pH 6-8 的Good’s缓冲液25-100mmol/L;Good’s缓冲液又称两性离子缓冲液。
所述试剂B的各组分及其含量为:微生物抑制剂0.001-1.1g/L,EDTA 0.05- 5.0 g/L,甘油0.1-10.0 g/L,牛血清白蛋白0.1-5.0g/L,表面活性剂0.01-3.0g/L,反应增强剂0.5-5.0g/L,氯化钠0.1-8.0g/L,pH 6-8的Good’s缓冲液25-100mmol/L,与甘胆酸单克隆抗体交联的纳米微球粒径50-100nm 的为0.1-0.5 g/L,与甘胆酸单克隆抗体交联的纳米微球粒径150-250nm 的为0.1-0.5 g/L。
本发明的检测原理为胶乳增强免疫比浊法,具体为:试剂A中加入人血清样本,试剂A作为缓冲系统使用,然后加入试剂B,试剂B中与甘胆酸单克隆抗体交联的纳米微球上的甘胆酸单克隆抗体人血清样本中甘胆酸特异性结合形成可溶性抗原抗体复合物,形成的浊度和样本中甘胆酸的含量成正相关关系。
与甘胆酸单克隆抗体交联的纳米微球分为小粒径微球(50-100nm)和大粒径微球(150-250nm)两部分,小粒径微球比表面积大,交联的甘胆酸单克隆抗体较多,增加了检测的线性范围。大粒径微球颗粒较大,结合甘胆酸后容易显现浊度,提高了检测的灵敏度。控制与甘胆酸单克隆抗体交联的纳米微球的含量异常重要,对于检测起到了核心作用。作为优选,大粒径微球(150-250nm)的浓度为小粒径微球(50-100nm)浓度的2-5倍,这样检测效果最佳。
作为优选,所述已知浓度的甘胆酸校准品的各组分及其含量为:pH 6-8的Good’s缓冲液25-100mmol/L,根据需要的校准品浓度添加的相应量的甘胆酸纯品。
作为优选,所述的微生物抑制剂选自叠氮钠、ProClin 200、ProClin 300 中的一种。
作为优选,所述的表面活性剂选自Tween20、Tween30、Tween80、Triton X-100中的一种。
作为优选,所述的反应增强剂选自聚乙二醇 2000、 聚乙二醇 4000、聚乙二醇 8000、聚乙二醇 20000中的一种。
作为优选,所述Good’s缓冲液选自磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液中的一种。
作为优选,所述与甘胆酸单克隆抗体交联的纳米微球由以下工艺制备而成:
(1)、在离心管内分别加入200-220μl纳米胶乳颗粒,1500-1800μl pH 7.4 0.01mol/L磷酸盐缓冲液, 甘胆酸单克隆抗体两株,每株1.0-2mg,500-600μl EDAC水溶液,磁力搅拌4-6小时, 4℃高速离心1-2小时,弃上清液;
(2)、沉淀置于冰浴中,超声振荡3-4min;
(3)、步骤(2)处理后的沉淀用等体积HEPES缓冲液(pH7.4 0.1mol/L)重悬后加入淬灭剂0.1mol/L甘氨酸溶液500-600μl,搅拌30-40min;
(4)、4℃高速离心1-2小时,去掉上清液,沉淀用等体积HEPES缓冲液重悬后得与甘胆酸单克隆抗体交联的纳米微球。
注:以上所述各组分的用量,可以根据需要等比例增减。
纳米胶乳颗粒为市售产品,产品为乳液状,产品中纳米胶乳颗粒含量为10%(w/v);EDAC水溶液浓度为0.1g/ml。甘胆酸单克隆抗体两株,两株甘胆酸单克隆抗体与甘胆酸有不同结合位点,这样检测的灵敏度、特异性更好。
用甘胆酸单克隆抗体和带氨基的纳米胶乳颗粒进行化学交联,优化缓冲液的浓度、pH、离心参数、超声条件控制等,得到了检测性能佳的与甘胆酸单克隆抗体交联的纳米微球。
作为优选,步骤(1)和步骤(4)所述高速离心的转速为12000r/min-15000 r/min。
作为优选,步骤(2)所述的超声振荡期间,超声1秒,间隔3-4秒。超声振荡在冰浴下且,超声1秒,间隔3-4秒,以防止温度过高,破坏抗体。
作为优选,所述纳米胶乳颗粒的粒径为50-100nm或150-250nm。
本发明的有益效果是:适用于各大、中、小医院中使用,检验操作简便、快速,可以同时进行大批量样本快速测定,检测的准确度、灵敏度好;而化学发光方法仅能在具有化学发光设备的医院中使用,而且操作费时,测定速度较慢。
具体实施方式
下面通过具体实施例,对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中,若非特指,所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法,如无特别说明,均为本领域的常规方法。
实施例1:
一种测定人血液中甘胆酸的试剂盒,包括试剂A、试剂B及已知浓度的甘胆酸校准品,其中,试剂A与试剂B质量比为5 : 1;
所述试剂A的各组分及其含量如下:
微生物抑制剂(叠氮钠)0.001g/L,EDTA 5.0 g/L,甘油0.1 g/L,牛血清白蛋白5.0g/L,表面活性剂(Tween20) 3.0g/L,反应增强剂(聚乙二醇2000)0.5g/L,氯化钠8.0g/L,pH 6的磷酸缓冲液25mmol/L。
所述试剂B的各组分及其含量如下:
微生物抑制剂(叠氮钠)0.001g/L,EDTA 5.0 g/L,甘油0.1 g/L,牛血清白蛋白5.0g/L,表面活性剂(Tween20) 3.0g/L,反应增强剂(聚乙二醇2000)0.5g/L,氯化钠8.0g/L,pH 6的磷酸缓冲液25mmol/L,与甘胆酸单克隆抗体交联的纳米微球粒径50nm 的为0.1g/L,与甘胆酸单克隆抗体交联的纳米微球粒径150nm 的为0.5 g/L。
已知浓度的甘胆酸校准品的各组分及其含量为:pH 6的磷酸缓冲液25mmol/L,根据需要的校准品浓度添加的相应量的甘胆酸纯品。
与甘胆酸单克隆抗体交联的纳米微球由以下工艺制备而成:
(1)、在离心管内分别加入200μl 纳米胶乳颗粒(粒径50nm,生产厂家,美国Bangs Laboratories, Inc.,产品为乳液状,产品中纳米胶乳颗粒含量为10%(w/v)),1500μl pH 7.4 0.01mol/L磷酸盐缓冲液, 甘胆酸单克隆抗体两株(生产厂家:上海友科生物科技有限公司),每株1.0mg,500μl EDAC水溶液(EDAC中文名碳化二亚胺,0.1g/ml),磁力搅拌4小时, 4℃高速离心(15000 r/min)1小时,弃上清液;
(2)、沉淀置于冰浴中,超声振荡3min,超声1秒,间隔3秒;
(3)、步骤(2)处理后的沉淀用等体积HEPES缓冲液(PH7.4 0.1mol/L)重悬后加入淬灭剂0.1mol/L甘氨酸溶液500μl,搅拌30min;
本步骤第一次重悬:因为高速离心后的胶乳密度太大,需要重悬后才可以与淬灭剂充分反应;纳米胶乳颗粒和甘胆酸单克隆抗体中的氨基的交联作用完成后,加入淬灭剂结束二者的结合,淬灭剂中的氨基和纳米胶乳颗粒上剩余的羧基结合,防止剩余的羧基与其它蛋白质非特异性的结合;
(4)、4℃高速离心(15000 r/min)1小时,去掉上清液,沉淀用等体积HEPES缓冲液重悬后得与甘胆酸单克隆抗体交联的纳米微球粒径50nm。本步骤第二次重悬:离心后的纳米微球必须重悬后才能用于制备成试剂B。
将步骤(1)中的纳米胶乳颗粒粒径更改为150nm,重复(1)-(4)步骤,得到与甘胆酸单克隆抗体交联的纳米微球粒径150nm。
实施例2:
一种测定人血液中甘胆酸的试剂盒,包括试剂A、试剂B及已知浓度的甘胆酸校准品,其中,试剂A与试剂B质量比为4 : 1;
所述试剂A的各组分及其含量如下:
微生物抑制剂(ProClin 200)0.5g/L,EDTA 2.0 g/L,甘油5 g/L,牛血清白蛋白2.0g/L,表面活性剂(Tween30)1.0g/L,反应增强剂(聚乙二醇4000)2g/L,氯化钠3.0g/L,pH 7的甘氨酸缓冲液50mmol/L。
所述试剂B的各组分及其含量如下:
微生物抑制剂(ProClin 200)0.5g/L,EDTA 2.0 g/L,甘油5 g/L,牛血清白蛋白2.0g/L,表面活性剂(Tween30)1.0g/L,反应增强剂(聚乙二醇4000)2g/L,氯化钠3.0g/L,pH 7的甘氨酸缓冲液50mmol/L,与甘胆酸单克隆抗体交联的纳米微球粒径80nm 的为0.2g/L,与甘胆酸单克隆抗体交联的纳米微球粒径200nm 的为0.4 g/L。
已知浓度的甘胆酸校准品的各组分及其含量为:pH 7的甘氨酸缓冲液50mmol/L,根据需要的校准品浓度添加的相应量的甘胆酸纯品。
与甘胆酸单克隆抗体交联的纳米微球由以下工艺制备而成:
(1)、在离心管内分别加入200μl 纳米胶乳颗粒(粒径80nm,生产厂家:美国Bangs Laboratories, Inc.,产品为乳液状,产品中纳米胶乳颗粒含量为10%(w/v)),1600μl pH 7.4 0.01mol/L磷酸盐缓冲液, 甘胆酸单克隆抗体两株(生产厂家:上海友科生物科技有限公司),每株1.0mg,500μl EDAC水溶液(0.1g/ml),磁力搅拌4小时, 4℃高速离心(15000 r/min)1小时,弃上清液;
(2)、沉淀置于冰浴中,超声振荡3min,超声1秒,间隔3秒;
(3)、步骤(2)处理后的沉淀用等体积HEPES缓冲液(PH7.4 0.1mol/L)重悬后加入淬灭剂0.1mol/L甘氨酸溶液600μl,搅拌30min;
(4)、4℃高速离心(15000 r/min)1小时,去掉上清液,沉淀用等体积HEPES缓冲液重悬后得与甘胆酸单克隆抗体交联的纳米微球粒径80nm。
将步骤(1)中的纳米胶乳颗粒粒径更改为200nm,重复(1)-(4)步骤,得到与甘胆酸单克隆抗体交联的纳米微球粒径200nm。
实施例3:
一种测定人血液中甘胆酸的试剂盒,包括试剂A、试剂B及已知浓度的甘胆酸校准品,其中,试剂A与试剂B质量比为1 : 1;
所述试剂A的各组分及其含量如下:
微生物抑制剂(ProClin 300)1.1g/L,EDTA 0.05 g/L,甘油10 g/L,牛血清白蛋白1.0g/L,表面活性剂(Tween80) 0.01g/L,反应增强剂(聚乙二醇8000)5.0g/L,氯化钠0.1g/L,pH 8的N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液100mmol/L。
所述试剂B的各组分及其含量如下:
微生物抑制剂(ProClin 300)1.1g/L,EDTA 0.05 g/L,甘油10 g/L,牛血清白蛋白1.0g/L,表面活性剂(Tween80) 0.01g/L,反应增强剂(聚乙二醇8000)5.0g/L,氯化钠0.1g/L,pH 8的N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液100mmol/L,与甘胆酸单克隆抗体交联的纳米微球粒径100nm 的为0.1g/L,与甘胆酸单克隆抗体交联的纳米微球粒径250nm 的为0.3 g/L。
已知浓度的甘胆酸校准品的各组分及其含量为:pH 8的N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液100mmol/L,根据需要的校准品浓度添加的相应量的甘胆酸纯品。
与甘胆酸单克隆抗体交联的纳米微球由以下工艺制备而成:
(1)、在离心管内分别加入220μl 纳米胶乳颗粒(粒径100nm,生产厂家:美国Bangs Laboratories, Inc.,产品为乳液状,产品中纳米胶乳颗粒含量为10%(w/v)),1800μl pH 7.4 0.01mol/L磷酸盐缓冲液, 甘胆酸单克隆抗体两株(生产厂家,上海友科生物科技有限公司),每株1.0mg,600μl EDAC水溶液(0.1g/ml),磁力搅拌6小时, 4℃高速离心(12000 r/min)2小时,弃上清液;
(2)、沉淀置于冰浴中,超声振荡4min,超声1秒,间隔4秒;
(3)、步骤(2)处理后的沉淀用等体积HEPES缓冲液(PH7.4 0.1mol/L)重悬后加入淬灭剂0.1mol/L甘氨酸溶液600μl,搅拌40min;
(4)、4℃高速离心(12000 r/min)2小时,去掉上清液,沉淀用等体积HEPES缓冲液重悬后得与甘胆酸单克隆抗体交联的纳米微球粒径100nm。
将步骤(1)中的纳米胶乳颗粒粒径更改为250nm,重复(1)-(4)步骤,得到与甘胆酸单克隆抗体交联的纳米微球粒径250nm。
本发明的性能评价:
a.性能特征:线性范围:0.1-100mg/L;分析灵敏度:0.1~0.5A /50mgCG;
测量精密度:CV≤5.5%;批间差≤10.0%;稳定性:12个月。
b.适用于各大、中、小医院中使用,检验操作简便、快速,可以同时进行大批量样本快速测定;而化学发光方法仅能在具有化学发光设备的医院中使用,而且操作费时,测定速度较慢。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案,并非对本发明作任何形式上的限制,在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
Claims (10)
1.一种测定人血液中甘胆酸的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒包括试剂A、试剂B及已知浓度的甘胆酸校准品,其中,试剂A与试剂B质量比为1-5 : 1;
所述试剂A的各组分及其含量为:微生物抑制剂0.001-1.1g/L,EDTA 0.05- 5.0 g/L,甘油0.1-10.0 g/L,牛血清白蛋白0.1-5.0g/L,表面活性剂0.01-3.0g/L,反应增强剂0.5-5.0g/L,氯化钠0.1-8.0g/L,pH 6-8 的Good’s缓冲液25-100mmol/L;
所述试剂B的各组分及其含量为:微生物抑制剂0.001-1.1g/L,EDTA 0.05- 5.0 g/L,甘油0.1-10.0 g/L,牛血清白蛋白0.1-5.0g/L,表面活性剂0.01-3.0g/L,反应增强剂0.5-5.0g/L,氯化钠0.1-8.0g/L,pH 6-8的Good’s缓冲液25-100mmol/L,与甘胆酸单克隆抗体交联的纳米微球粒径50-100nm 的为0.1-0.5 g/L,与甘胆酸单克隆抗体交联的纳米微球粒径150-250nm 的为0.1-0.5 g/L。
2.根据权利要求1所述的一种测定人血液中甘胆酸的试剂盒,其特征在于:所述已知浓度的甘胆酸校准品的各组分及其含量为:pH 6-8的Good’s缓冲液25-100mmol/L,根据需要的校准品浓度添加的相应量的甘胆酸纯品。
3.根据权利要求1或2所述的一种测定人血液中甘胆酸的试剂盒,其特征在于:所述的微生物抑制剂选自叠氮钠、ProClin 200、ProClin 300 中的一种。
4.根据权利要求1或2所述的一种测定人血液中甘胆酸的试剂盒,其特征在于:所述的表面活性剂选自Tween20、Tween30、Tween80、Triton X-100中的一种。
5.根据权利要求1或2所述的一种测定人血液中甘胆酸的试剂盒,其特征在于:所述的反应增强剂选自聚乙二醇 2000、 聚乙二醇 4000、聚乙二醇 8000、聚乙二醇 20000中的一种。
6.根据权利要求1或2所述的一种测定人血液中甘胆酸的试剂盒,其特征在于:所述Good’s缓冲液选自磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、 三羟甲基氨基甲烷缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液中的一种。
7.根据权利要求1或2所述的一种测定人血液中甘胆酸的试剂盒,其特征在于:所述与甘胆酸单克隆抗体交联的纳米微球由以下工艺制备而成:
(1)、在离心管内分别加入200-220μl 纳米胶乳颗粒,1500-1800μl pH 7.4 0.01mol/L磷酸盐缓冲液, 甘胆酸单克隆抗体两株,每株1.0-2mg,500-600μl EDAC水溶液,磁力搅拌4-6小时, 4℃高速离心1-2小时,弃上清液;
(2)、沉淀置于冰浴中,超声振荡3-4min;
(3)、步骤(2)处理后的沉淀用等体积HEPES缓冲液重悬后加入淬灭剂0.1mol/L甘氨酸溶液500-600μl,搅拌30-40min;
(4)、4℃高速离心1-2小时,去掉上清液,沉淀用等体积HEPES缓冲液重悬后得与甘胆酸单克隆抗体交联的纳米微球。
8.根据权利要求7所述的一种测定人血液中甘胆酸的试剂盒,其特征在于:步骤(1)和步骤(4)所述高速离心的转速为12000r/min-15000 r/min。
9.根据权利要求7所述的一种测定人血液中甘胆酸的试剂盒,其特征在于:步骤(2)所述的超声振荡期间,超声1秒,间隔3-4秒。
10.根据权利要求7所述的一种测定人血液中甘胆酸的试剂盒,其特征在于:所述纳米胶乳颗粒的粒径为50-100nm或150-250nm。
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