CN108872595A - 一种癌胚抗原检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种癌胚抗原检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种癌胚抗原检测试剂盒及其制备方法。检测试剂盒包括包被有CEA抗体的磁性微球混悬液、CEA校准品、CEA质控品、CEA示踪物工作液、浓缩洗涤液、底物液和标本稀释液。该试剂盒检测结果准确、稳定性好、特异性强、灵敏度高、线性范围宽、检测时间短、使用方便，适于推广应用。

Description

一种癌胚抗原检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种癌胚抗原检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
癌胚抗原(CEA)是一种广谱性的肿瘤标志物，最早是1965年由Gold和Freedman首先从结肠癌和正常胎儿消化道的提取物中分离出来的，是一种具有人类胚胎抗原特性的酸性糖蛋白。CEA认为是一种与人体肿瘤有关的抗原，分子量为175100-200000道尔顿，其糖类含量在50％-60％之间变化。
CEA升高常见于结肠癌、大肠癌、胰腺癌、胃癌、小细胞肺癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌等。血清CEA浓度的增加不仅见于恶性病还可见于各种良性疾病，如肝硬化，严重吸烟者，支气管炎，胰腺炎，胃炎，感染性肠炎和肾脏疾病，所以CEA不是恶性肿瘤的特异性标志，在诊断上只有辅助价值。此外，血清CEA水平与结直肠癌患者的预后和处理具有重大意义。肿瘤成功切除后，循环系统中的CEA浓度下降，而原发性肿瘤的复发或转移则伴随CEA的浓度升高。
磁微粒化学发光法是免疫分析技术的新发展，该技术将磁性微球应用于免疫检测的固相，大大提高了反应的表面积，增加了抗原或抗体的吸附量，加快了反应速度，提高了检测的灵敏度。相比于时间免疫分辨荧光、免疫层析及ELISA方法，具有准确度高、特异性好、精密度高、线性范围广、试剂稳定性良好等特点；目前磁微粒化学发光免疫分析技术已成为在免疫诊断领域全球使用最广泛的分析方法，也是免疫试剂重要的发展方向之一。现有技术癌胚抗原的检测方法主要有酶联免疫法、时间分辨荧光免疫分析法、化学发光法等，然而这些方法具有线性范围窄，检测时间长等缺点，无法满足临床需求，因此寻找一种更有效的检测方式就成了临床应用的关键。
发明内容
本发明的目的在于是：针对现有技术存在的不足，提供一种用于检测癌胚抗原的检测试剂盒；该试剂盒检测结果准确、稳定性好、特异性强、灵敏度高、线性范围宽、检测时间短、使用方便，适于推广应用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种癌胚抗原检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括包被CEA抗体的磁性微球混悬液、CEA校准品、CEA质控品、CEA示踪物工作液、浓缩洗涤液、底物液和标本稀释液。
所述包被CEA抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:1000-1:5500的比例配制；
所述CEA示踪物工作液为吖啶酯标记的CEA单克隆抗体溶液按照其与示踪物稀释液1:1000-1:4000的比例配制；
作为一种改进的技术方案，所述CEA校准品和质控品均由CEA校准品稀释液配制而成，所述CEA校准品的浓度分别为0ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、400ng/mL、1000ng/mL；
所述CEA质控品的浓度为20ng/mL、400ng/mL。
作为一种优选的技术方案，所述包被CEA抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:3000的比例配制，所述CEA示踪物工作液为吖啶酯标记的CEA单克隆抗体溶液按照其与示踪物稀释液1:2000的比例配制。
作为一种优选的技术方案，所述校准品稀释液为pH7.4-7.6的PB缓冲液，且每1L缓冲液中还含有5-15g酪蛋白、20-35gNa2HPO4·12H2O、2-3.5gNa2H2PO4·2H2O、5-15mL的小牛血清和0.3-0.5mL的Proclin-300。
作为一种优选的技术方案，所述浓缩洗涤液为0.04-0.06mol、pH7.4-7.6的Tris-HCl缓冲液，且每1L缓冲液中还含有0.02-0.08％v/v的吐温-20和0.7-0.8％v/v的Proclin-300；
所述标本稀释液为pH7.4-7.6的PB缓冲液，且每1LPB缓冲液还含有200-205ml的小牛血清和1-1.5mL的Proclin-300。
作为一种优选的技术方案，所述底物液包括底物液A和底物液B,所述底物液A为0.01-0.1mol/L pH 6.8-7.8的磷酸盐缓冲溶液，且所述缓冲溶液中含有0.01-0.2mol/L的双氧水和0.2-0.7mol/L的硝酸；
所述底物液B为0.01-0.1mol/L、pH 6.8-7.8的磷酸盐缓冲溶液，且缓冲溶液中含有0.1-0.6g/L的氢氧化钠溶液。
本发明的第二个目的在于：提供一种检测癌胚抗原的检测试剂盒的制备方法。
为了实现上述发明的目的，本发明的技术方案是：
一种检测癌胚抗原的检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备CEA磁性微球混悬液
将活化后的磁微粒加磁场，用吗啉乙磺酸缓冲液清洗，并用吗啉乙磺酸缓冲液按照浓度为20-60mg/mL将磁微粒进行悬浮；加入CEA抗体，再加磁场，用含有吐温-20、PEG2000、牛血清白蛋白和Proclin-300的磷酸盐缓冲液清洗，并用该溶液配制成1-4mg/mL的磁性微球混悬母液，再将所述磁性微球混悬母液按1:1000-1:5500稀释，制得CEA磁性微球混悬液；
(2)配制CEA校准品及质控品
用校准品稀释液将CEA标准品按一定的比例稀释成系列校准品，其校准品浓度范围为0ng/mL-1000ng/mL；按照上述操作制备浓度为20ng/mL、400ng/mL的质控品，对校准品和质控品进行分装；
(3)抗体的标记
a.预处理：取适量CEA抗体用0.05-0.2M、pH值7.5-9.0的碳酸盐缓冲溶液于2-10℃透析10-20小时；
b.抗体标记：取吖啶酯溶液和CEA抗体溶液，加入标记缓冲液，再加入标记缓冲液体积20-50％的1g/mL赖氨酸盐溶液进行反应，反应20-60分钟；
c.纯化与收集：反应液用0.05-0.2M pH值7.5-9.0的碳酸盐缓冲溶液于2-8℃透析20-26小时，得到吖啶酯标记的CEA抗体溶液。
(4)配制CEA示踪物工作液
将吖啶酯标记的CEA单克隆抗体溶液与示踪物稀释液按照1:1000-1:4000的比例配制；
(5)配制浓缩洗涤液
按照每1LpH7.5-7.8的Tris-HCl缓冲液中含有7-10gNaCl、0.2-0.8ml吐温-20和6-8mlProclin-300进行配制；
(6)配制底物液A和底物液B
底物液A：用0.01-0.1mol/L pH 6.8-7.8的磷酸盐缓冲溶液配制含有浓度为0.01-0.2mol/的双氧水和浓度为0.2-0.7mol/L的硝酸溶液；
底物液B：用0.01-0.1mol/L pH 6.8-7.8的磷酸盐缓冲溶液配制含有浓度为0.1-0.6g/L的氢氧化钠溶液；
(7)标本稀释液的配制
按照每1L pH7.4-7.6的PB缓冲液中还含有200-205ml的小牛血清和1-1.5mL的Proclin-300进行配制；
(8)将上述步骤(1)-(7)制备的磁性微球混悬液、示踪物工作液、校准品、质控品、浓缩洗涤液、底物液A、底物液B和标本稀释液的分装。
作为一种改进的技术方案，所述步骤(4)中示踪物稀释液为pH7.5-7.8的PBS缓冲液，且每1LPBS缓冲液中还含有8-11g牛血清白蛋白、5-6g氯化钾、0.1-1g的酪蛋白、0.02-0.04％v/v的Proclin-300和0.3～1.0％v/v的AES。
作为一种改进的技术方案，所述步骤(3)中的标记缓冲液为0.1-0.15M、pH为7-9的CB缓冲液。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有以下优点：
本发明是将双抗体夹心法免疫测定原理与超顺磁性纳米微球标记技术和直接化学发光免疫分析相结合的定量检测产品，由于本发明试剂盒体系中所采用的各溶液配方和各组分的制备方法均是该反应体系下的最优方案，使得本发明试剂盒线性范围宽，在1-1000ng/mL之间成良好的线性关系，最大可报告范围为0ng/mL-30000ng/mL，市面最宽，而且灵敏度高(最低检测限为0.11ng/mL)，准确度高(相关系数r为0.9997)，批内和批间差均符合检测标准，准确程度优于目前市场上其它类型的CEA试剂盒，检测时间与目前市场上其它类型的CEA试剂盒相比至少缩短了30分钟，大大提高了检测效率。
本发明方法中采用吖啶酯类化合物标记抗体。吖啶酯类化合物通过化学反应使吖啶酯通过共价键与被标记的蛋白、多肽或核酸的氨基结合。通常标记物无本底发光，可用于检测低浓度或微量浓度的样品，且其发光效率高，使结合物具有化学发光活性强、免疫反应特异性高的特点。
附图说明
图1为本发明实施例2中检测试剂盒系列稀释样本检测的线性相关性结果的曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种癌胚抗原检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括包被有CEA抗体的磁性微球混悬液、CEA校准品、CEA质控品、CEA示踪物工作液、浓缩洗涤液、底物液和标本稀释液。
其中包被CEA抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:1000的比例配制；CEA示踪物工作液为吖啶酯标记的CEA单克隆抗体溶液按照其与示踪物稀释液1:1000的比例配制；CEA校准品和质控品均由CEA校准品稀释液配制而成，CEA校准品的浓度分别为0ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、400ng/mL、1000ng/mL；CEA质控品的浓度为20ng/mL、400ng/mL。
校准品稀释液为pH7.4的PB缓冲液，且每1L缓冲液中还含有5g酪蛋白、20gNa2HPO4·12H2O、2g Na2H2PO4·2H2O、5mL的小牛血清和0.3mL的Proclin-300。
浓缩洗涤液为0.04mol、pH7.4的Tris-HCl缓冲液，且每1L缓冲液中还含有0.02％v/v的吐温-20和0.7％v/v的Proclin-300；
标本稀释液为pH7.4的PB缓冲液，且每1LPB缓冲液还含有15mL的小牛血清和0.7％v/v的Proclin-300。
底物液包括底物液A和底物液B,所述底物液A为0.01mol/L pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液，且缓冲溶液中含有0.01mol/L的双氧水和0.2mol/L的硝酸；底物液B为0.01mol/L、pH6.8的磷酸盐缓冲溶液，且缓冲溶液中含有0.1g/L的氢氧化钠溶液。
其制备方法包括以下步骤：
(1)制备CEA磁性微球混悬液
将粒径为1μm的磁微粒用N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺进行活化，室温下搅拌30min，加磁场，静置1-3min,吸出上清液，用pH值为5的0.01mol/L的吗啉乙磺酸缓冲液清洗三次，并用该溶液按照浓度为20mg/mL将磁微粒进行悬浮；
每毫升吗啉乙磺酸溶液中加入CEA抗体50μg,在25℃下搅拌2h，加磁场，静置2-6min，吸出上清液；
用pH值为7.0、含0.1％v/v的吐温-20、1.0％m/v的牛血清白蛋白和0.01％v/vProclin-300的磷酸盐缓冲液清洗3-5次，并用该溶液配制成1-4mg/mL的磁性微球初溶液，并用该溶液将所述磁性微球初溶液按1:1000稀释，制得CEA磁性微球混悬液；
(2)配制CEA校准品及质控品
用校准品稀释液将CEA标准品按一定的比例稀释成系列校准品，其校准品浓度范围为0ng/mL-1000ng/mL；按照上述操作制备浓度为20ng/mL、400ng/mL的质控品，对校准品和质控品进行分装；
(3)抗体的标记
a.预处理：取适量CEA抗体用0.05M、pH值7.5的碳酸盐缓冲溶液于2℃透析10小时；
b.抗体标记：取吖啶酯溶液和CEA抗体溶液，加入标记缓冲液(为0.1M、pH为7的CB缓冲液)，再加入标记缓冲液体积20％的1g/mL赖氨酸盐溶液进行反应，反应20分钟；
c.纯化与收集：反应液用0.05M pH值7.5的碳酸盐缓冲溶液于2℃透析20小时，得到吖啶酯标记的CEA抗体溶液。
(4)配制CEA示踪物工作液
将吖啶酯标记的CEA单克隆抗体溶液与示踪物稀释液(为pH7.5的PBS缓冲液，且每1LPBS缓冲液中还含有8g牛血清白蛋白、5g氯化钾、0.1g的酪蛋白、0.02％v/v的Proclin-300和0.3％v/v的AES)按照1:1000的比例配制；
(5)配制浓缩洗涤液
按照每1LpH7.5的Tris-HCl缓冲液中含有7gNaCl、0.2ml吐温-20和6mlProclin-300进行配制；
(6)配制底物液A和底物液B
底物液A：用0.01mol/L pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液配制含有浓度为0.01mol/的双氧水和浓度为0.2mol/L的硝酸溶液；
底物液B：用0.01mol/L pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液配制含有浓度为0.1g/L的氢氧化钠溶液；
(7)标本稀释液
按照每1L pH7.4的PB缓冲液中还含有200mL的小牛血清和1ml的Proclin-300进行配制；
(8)将上述步骤(1)-(7)制备的磁性微球混悬液、示踪物工作液、校准品、质控品、浓缩洗涤液、底物液A、底物液B和标本稀释液的分装。
实施例2
一种癌胚抗原检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括包被有CEA抗体的磁性微球混悬液、CEA校准品、CEA质控品、CEA示踪物工作液、浓缩洗涤液、底物液和标本稀释液。
其中包被CEA抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:3000的比例配制；CEA示踪物工作液为吖啶酯标记的CEA单克隆抗体溶液按照其与示踪物稀释液1:2000的比例配制；CEA校准品和质控品均由CEA校准品稀释液配制而成，CEA校准品的浓度分别为0ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、400ng/mL、1000ng/mL；CEA质控品的浓度为20ng/mL、400ng/mL。
校准品稀释液为pH7.5的PB缓冲液，且每1L缓冲液中还含有12g酪蛋白、28gNa2HPO4·12H2O、2.5g Na2H2PO4·2H2O、10mL的小牛血清和0.4mL的Proclin-300。
浓缩洗涤液为0.05mol、pH7.5的Tris-HCl缓冲液，且每1L缓冲液中还含有0.05％v/v的吐温-20和0.75％v/v的Proclin-300；
标本稀释液为pH7.5的PB缓冲液，且每1LPB缓冲液还含有20mL的小牛血清和0.7％v/v的Proclin-300。
底物液包括底物液A和底物液B,所述底物液A为0.05mol/L pH7.2的磷酸盐缓冲溶液，且缓冲溶液中含有0.015mol/L的双氧水和0.4mol/L的硝酸；底物液B为0.05mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲溶液，且缓冲溶液中含有0.4g/L的氢氧化钠溶液。
其制备方法包括以下步骤：
(1)制备CEA磁性微球混悬液
将粒径为2.8μm的磁微粒用N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺进行活化，室温下搅拌30min，加磁场，静置1-3min,吸出上清液，用pH值为5.5的0.015mol/L的吗啉乙磺酸缓冲液清洗三次，并用该溶液按照浓度为20-60mg/mL将磁微粒进行悬浮；
每毫升吗啉乙磺酸溶液中加入CEA抗体80μg,在25℃下搅拌2-5h，加磁场，静置2-6min，吸出上清液；
用pH值为7.4、含0.1％v/v的吐温-20、1.0％m/v的牛血清白蛋白和0.01％v/vProclin-300的磷酸盐缓冲液清洗3-5次，并用该溶液配制成1-4mg/mL的磁性微球初溶液，并用该溶液将所述磁性微球初溶液按1:3000稀释，制得CEA磁性微球混悬液；
(2)配制CEA校准品及质控品
用校准品稀释液将CEA标准品按一定的比例稀释成系列校准品，其校准品浓度范围为0ng/mL-1000ng/mL；按照上述操作制备浓度为20ng/mL、400ng/mL的质控品，对校准品和质控品进行分装；
(3)抗体的标记
a.预处理：取适量CEA抗体用0.1M、pH值8.0的碳酸盐缓冲溶液于4℃透析12小时；
b.抗体标记：取吖啶酯溶液和CEA抗体溶液，加入标记缓冲液(为0.12M、pH为8的CB缓冲液)，再加入标记缓冲液体积30％的1g/mL赖氨酸盐溶液进行反应，反应20-60分钟；
c.纯化与收集：反应液用0.1M pH值8.0的碳酸盐缓冲溶液于2-8℃透析23小时，得到吖啶酯标记的CEA抗体溶液。
(4)配制CEA示踪物工作液
将吖啶酯标记的CEA单克隆抗体溶液与示踪物稀释液(为pH7.6的PBS缓冲液，且每1LPBS缓冲液中还含有10g牛血清白蛋白、6g氯化钾、0.6g的酪蛋白、0.03％v/v的Proclin-300和0.8％v/v的AES)按照1:2000的比例配制；
(5)配制浓缩洗涤液
按照每1LpH7.6的Tris-HCl缓冲液中含有8gNaCl、0.5ml吐温-20和7mlProclin-300进行配制；
(6)配制底物液A和底物液B
底物液A：用0.06mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液配制含有浓度为0.05mol/的双氧水和浓度为0.5mol/L的硝酸溶液；
底物液B：用0.05mol/L pH 67.3的磷酸盐缓冲溶液配制含有浓度为0.4g/L的氢氧化钠溶液；
(7)标本稀释液
标本稀释液为pH7.5的PB缓冲液，且每1LPB缓冲液还含有203ml的小牛血清和1.2mL的Proclin-300进行配制；
(8)将上述步骤(1)-(7)制备的磁性微球混悬液、示踪物工作液、校准品、质控品、浓缩洗涤液、底物液A、底物液B和标本稀释液的分装。
实施例3
一种癌胚抗原检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括包被有CEA抗体的磁性微球混悬液、CEA校准品、CEA质控品、CEA示踪物工作液、浓缩洗涤液、底物液和标本稀释液。
其中包被CEA抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:5500的比例配制；CEA示踪物工作液为吖啶酯标记的CEA单克隆抗体溶液按照其与示踪物稀释液1:4000的比例配制；CEA校准品和质控品均由CEA校准品稀释液配制而成，CEA校准品的浓度分别为0ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、400ng/mL、1000ng/mL；CEA质控品的浓度为20ng/mL、400ng/mL。
校准品稀释液为pH7.6的PB缓冲液，且每1L缓冲液中还含有15g酪蛋白、35gNa2HPO4·12H2O、3.5g Na2H2PO4·2H2O、15mL的小牛血清和0.5mL的Proclin-300。
浓缩洗涤液为0.06mol、pH7.6的Tris-HCl缓冲液，且每1L缓冲液中还含有0.08％v/v的吐温-20和0.8％v/v的Proclin-300；
标本稀释液为pH7.6的PB缓冲液，且每1LPB缓冲液还含有30mL的小牛血清和0.8％v/v的Proclin-300。
底物液包括底物液A和底物液B,所述底物液A为0.1mol/L pH7.8的磷酸盐缓冲溶液，且缓冲溶液中含有0.2mol/L的双氧水和0.7mol/L的硝酸；底物液B为0.1mol/L、pH 7.8的磷酸盐缓冲溶液，且缓冲溶液中含有0.1-0.6g/L的氢氧化钠溶液。
其制备方法包括以下步骤：
(1)制备CEA磁性微球混悬液
将粒径为2.8μm的磁微粒用N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺进行活化，室温下搅拌30min，加磁场，静置1-3min,吸出上清液，用pH值为6的0.01mol/L的吗啉乙磺酸缓冲液清洗三次，并用该溶液按照浓度为60mg/mL将磁微粒进行悬浮；
每毫升吗啉乙磺酸溶液中加入CEA抗体150μg,在25℃下搅拌5h，加磁场，静置2-6min，吸出上清液；
用pH值为7.6、含0.1％v/v的吐温-20、1.0％m/v的牛血清白蛋白和0.01％v/vProclin-300的磷酸盐缓冲液清洗3-5次，并用该溶液配制成1-4mg/mL的磁性微球初溶液，并用该溶液将所述磁性微球初溶液按1:5500稀释，制得CEA磁性微球混悬液；
(2)配制CEA校准品及质控品
用校准品稀释液将CEA标准品按一定的比例稀释成系列校准品，其校准品浓度范围为0ng/mL-1000ng/mL；按照上述操作制备浓度为20ng/mL、400ng/mL的质控品，对校准品和质控品进行分装；
(3)抗体的标记
a.预处理：取适量CEA抗体用0.2M、pH值9.0的碳酸盐缓冲溶液于10℃透析20小时；
b.抗体标记：取吖啶酯溶液和CEA抗体溶液，加入标记缓冲液(为0.15M、pH为9的CB缓冲液)，再加入标记缓冲液体积50％的1g/mL赖氨酸盐溶液进行反应，反应60分钟；
c.纯化与收集：反应液用0.2M pH值9.0的碳酸盐缓冲溶液于8℃透析26小时，得到吖啶酯标记的CEA抗体溶液。
(4)配制CEA示踪物工作液
将吖啶酯标记的CEA单克隆抗体溶液与示踪物稀释液(为pH7.8的PBS缓冲液，且每1LPBS缓冲液中还含有11g牛血清白蛋白、6g氯化钾、1g的酪蛋白、0.04％v/v的Proclin-300和1.0％v/v的AES)按照1:4000的比例配制；
(5)配制浓缩洗涤液
按照每1LpH7.8的Tris-HCl缓冲液中含有10gNaCl、0.8ml吐温-20和8mlProclin-300进行配制；
(6)配制底物液A和底物液B
底物液A：用0.1mol/L pH 7.8的磷酸盐缓冲溶液配制含有浓度为0.2mol/的双氧水和浓度为0.7mol/L的硝酸溶液；
底物液B：用0.1mol/L、pH7.8的磷酸盐缓冲溶液配制含有浓度为0.6g/L的氢氧化钠溶液；
(7)配制标本稀释液
按照每1L pH7.6的PB缓冲液中还含有205mL的小牛血清和1.5ml的Proclin-300进行配制；
(8)将上述步骤(1)-(7)制备的磁性微球混悬液、示踪物工作液、校准品、质控品、浓缩洗涤液、底物液A、底物液B和标本稀释液的分装。
实施例4
一种检测癌胚抗原的试剂盒检测癌胚抗原的方法，包括以下步骤：
(1)将在冷藏环境中贮存的试剂室温平衡15分钟以上；
(2)用纯化水将浓缩洗涤液进行40倍稀释，摇匀备用，作为应用洗涤液；
(3)用将CEA校准品、质控品及待测样本置于相应板架上，设定相关测定参数为：磁性微球的加量为50μL，样本、校准品、质控品的加液量为20μL，示踪物工作液的加液量为50μL，设定步骤1温育时间为20分钟，循环清洗次数为两次，步骤2温育时间为10分钟，循环清洗次数为三次，每次应用洗涤液用量为400μL，底物液A设定的加液量为50μL，振荡混匀时间为20秒，底物液B设定的加液量为50μL，立即检测，信号收集时间为0.1-4秒；
(4)根据各标准溶液发光值，借助全自动化学发光免疫分析仪的分析软件进行四参数Logistic拟合，坐标选择X-Y，得标准曲线；或采用双对数Log(X)-Log(Y)线性分析方法，得标准曲线；最后根据标准曲线计算出样本中CEA的浓度。
实施例5
一种癌胚抗原检测试剂盒结果的最大可报告范围如下：
采用本发明试剂盒对在最高检测范围附近的定值高值定值样本(900ng/ml)按1:50、1:100、1:200、1:300、1:500等比例用标本稀释液稀释直至理想稀释倍数，重复测定3次，取平均值并计算其还原浓度。计算高值血清的理论值与还原值的误差，判定结果是否在可接受范围内。1:50、1:100、1:200、1:300、1:500等比例稀释后检测结果的相对偏差分别为1.37％、4.37％、5.93％、8.44％和16.67％，其相关性如图1所示。
结论：测定定值高值样本的理想的稀释倍数为1/300，超出测定范围0ng/mL-1000ng/mL的样品可用标本稀释液稀释1/300后测定，其最大的可报告范围为0ng/mL-30000ng/mL。
实施例6
一种癌胚抗原检测试剂盒(实施例2)的主要产品性能指标为：
(1)试剂盒的最低检测限(灵敏度)
10孔平行测定样本稀释液，计算测定结果的平均数(M)与标准差(SD)，得出M+2SD对应的发光值，代入剂量-反应曲线，计算出相应的浓度值，该浓度值即为本试剂盒的最低检测限。经验证，本试剂盒的最低检测限指标检测结果见表1。
表1试剂盒最低检测限的测定
结论：测定的CEA样本稀释液的平均发光值M＝4049.9，SD＝446.95，将(M+2SD)的值带入此次反应曲线，得其灵敏度为：0.11ng/mL(<1.0ng/mL)，符合要求。
(2)试剂盒的校准品的线性
测定试剂盒的校准品(浓度依次为0ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、400ng/mL、1000ng/mL的校准品进行两孔测定)，用四参数进行拟合，本试剂盒的校准品的线性检测结果见表2。
表2试剂盒校准品的线性
结论：测定的CEA校准品线性相关系数(r)为：0.9997(>0.9900)，符合要求。
(3)试剂盒的准确度
检测浓度为100ng/mL的校准品，每个浓度校准品检测3次，计算测定结果的均值M，本试剂盒的准确度检测结果见表3。
表3试剂盒的准确度
编号 100ng/mL
1 96.84
2 101.51
3 92.52
平均值 96.96
Bias％ 3.04％
结论：测定的100ng/mL准确度校准品的相对偏差(Bias％)为：3.04％，测定值与靶值的相对偏差(Bias％)均<10.0％，符合要求。
(4)试剂盒的重复性
检测浓度分别为10ng/mL和100ng/mL的校准品重复检测，本试剂盒的重复性检测结果见表4。
表4试剂盒重复性的测定
编号 10ng/mL 100ng/mL
1 10.64 104.52
2 8.56 99.64
3 9.66 95.78
4 10.36 100.55
5 9.51 96.22
6 8.53 106.54
7 10.56 107.45
8 9.64 97.19
9 9.74 105.88
10 10.41 106.44
CV 7.82％ 4.55％
结论：测定的20ng/mL和400ng/mL校准品重复性变异系数(CV)分别为：7.82％和4.55％(均<10.0％)，符合要求。
(5)试剂盒的批间差
用3个批号的试剂盒分别检测浓度为100ng/mL的校准品，各重复10次，本试剂盒的批间差检测结果见表5。
表5试剂盒批间精密度的测定
结论：测定的100ng/mL校准品的批间变异系数(CV)分别为：5.06％(均<15.0％)，符合要求。
从上述测定的数据可以看出，本发明设计的一种癌胚抗原检测试剂盒在灵敏度、准确度、重复性等各项质量参数均处于领先地位。
实施例7
一种癌胚抗原检测试剂盒的临床检测实例如下：
采用本发明试剂盒对300例检测样本进行检测，其中阳性样本约90例，阴性样本约210例(体检后经证实无糖尿病、银屑病、迟发性过敏反应及无缺血性心肌病等疾病、3个月内无皮肤伤口及骨折的人群)，其中包含干扰因素及交叉反应样本40例(高脂血样本、溶血样本、高胆红素样本、类风湿因子阳性样本各10例)，检测结果见表6。
表6CEA考核试剂与对比试剂检测结果比较
结论：t值＜t0.05,500＝1.965＜t0.05,239，P＞0.05，两种试剂差别无显著性，说明两试剂测定结果高度相关，具有等效性。
CEA考核试剂与对比试剂阳性符合率为98.89％，阴性符合率为98.58％，总符合率为98.67％。通过相关性分析、卡方检验及配对t检验，说明考核试剂和临床诊断不存在显著性差异，具有很好的相关性。
本专利不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所作出的种种变换，均落在本专利的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种癌胚抗原检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括包被CEA抗体的磁性微球混悬液、CEA校准品、CEA质控品、CEA示踪物工作液、浓缩洗涤液、底物液和标本稀释液；
所述包被CEA抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:1000-1:5500的比例配制；
所述CEA示踪物工作液为吖啶酯标记的CEA单克隆抗体溶液按照其与示踪物稀释液1:1000-1:4000的比例配制。
2.根据权利要求1所述的一种癌胚抗原检测试剂盒，其特征在于：所述CEA校准品和质控品均由CEA校准品稀释液配制而成，所述CEA校准品的浓度分别为0ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、400ng/mL、1000ng/mL；
所述CEA质控品的浓度为20ng/mL、400ng/mL。
3.根据权利要求1所述的一种癌胚抗原检测试剂盒，其特征在于：所述包被CEA抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:3000的比例配制，所述CEA示踪物工作液为吖啶酯标记的CEA单克隆抗体溶液按照其与示踪物稀释液1:2000的比例配制。
4.根据权利要求1所述的一种癌胚抗原检测试剂盒，其特征在于：所述校准品稀释液为pH7.4-7.6的PB缓冲液，且每1L缓冲液中还含有5-15g酪蛋白、20-35gNa2HPO4·12H2O、2-3.5g Na2H2PO4·2H2O、5-15mL的小牛血清和0.3-0.5mL的Proclin-300。
5.根据权利要求1所述的一种癌胚抗原检测试剂盒，其特征在于：所述浓缩洗涤液为0.04-0.06mol、pH7.4-7.6的Tris-HCl缓冲液，且每1L缓冲液中还含有0.02-0.08％v/v的吐温-20和0.7-0.8％v/v的Proclin-300；
所述标本稀释液为pH7.4-7.6的PB缓冲液，且每1LPB缓冲液还含有15-30mL的小牛血清和0.7-0.8％v/v的Proclin-300。
6.根据权利要求1所述的一种癌胚抗原检测试剂盒，其特征在于：所述底物液包括底物液A和底物液B,所述底物液A为0.01-0.1mol/L pH 6.8-7.8的磷酸盐缓冲溶液，且所述缓冲溶液中含有0.01-0.2mol/L的双氧水和0.2-0.7mol/L的硝酸；
所述底物液B为0.01-0.1mol/L、pH 6.8-7.8的磷酸盐缓冲溶液，且缓冲溶液中含有0.1-0.6g/L的氢氧化钠溶液。
7.根据权利要求1-6任一项所述的癌胚抗原检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述制备方法包括以下步骤：
(1)制备CEA磁性微球混悬液
将活化后的磁微粒加磁场，用吗啉乙磺酸缓冲液清洗，并用吗啉乙磺酸缓冲液按照浓度为20-60mg/mL将磁微粒进行悬浮；加入CEA抗体，再加磁场，用含有吐温-20、PEG2000、牛血清白蛋白和Proclin-300的磷酸盐缓冲液清洗，并用该溶液配制成1-4mg/mL的磁性微球混悬母液，再将所述磁性微球混悬母液按1:1000-1:5500稀释，制得CEA磁性微球混悬液；
(2)配制CEA校准品及质控品
用校准品稀释液将CEA标准品按一定的比例稀释成系列校准品，其校准品浓度范围为0ng/mL-1000ng/mL；按照上述操作制备浓度为20ng/mL、400ng/mL的质控品，对校准品和质控品进行分装；
(3)抗体的标记
a.预处理：取适量CEA抗体用0.05-0.2M、pH值7.5-9.0的碳酸盐缓冲溶液于2-10℃透析10-20小时；
b.抗体标记：取吖啶酯溶液和CEA抗体溶液，加入标记缓冲液，再加入标记缓冲液体积20-50％的1g/mL赖氨酸盐溶液进行反应，反应20-60分钟；
c.纯化与收集：反应液用0.05-0.2M pH值7.5-9.0的碳酸盐缓冲溶液于2-8℃透析20-26小时，得到吖啶酯标记的CEA抗体溶液。
(4)配制CEA示踪物工作液
将吖啶酯标记的CEA单克隆抗体溶液与示踪物稀释液按照1:1000-1:4000的比例配制；
(5)配制浓缩洗涤液
按照每1LpH7.5-7.8的Tris-HCl缓冲液中含有7-10gNaCl、0.2-0.8ml吐温-20和6-8mlProclin-300进行配制；
(6)配制底物液A和底物液B
底物液A：用0.01-0.1mol/L pH 6.8-7.8的磷酸盐缓冲溶液配制含有浓度为0.01-0.2mol/的双氧水和浓度为0.2-0.7mol/L的硝酸溶液；
底物液B：用0.01-0.1mol/L pH 6.8-7.8的磷酸盐缓冲溶液配制含有浓度为0.1-0.6g/L的氢氧化钠溶液；
(7)标本稀释液
按照每1L pH7.4-7.6的PB缓冲液中还含有15-30mL的小牛血清和0.7-0.8％v/v的Proclin-300进行配制；
(8)将上述步骤(1)-(7)制备的磁性微球混悬液、示踪物工作液、校准品、质控品、浓缩洗涤液、底物液A、底物液B和标本稀释液的分装。
8.根据权利要求7所述的一种癌胚抗原检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中示踪物稀释液为pH7.5-7.8的PBS缓冲液，且每1LPBS缓冲液中还含有8-11g牛血清白蛋白、5-6g氯化钾、0.1-1g的酪蛋白、0.02-0.04％v/v的Proclin-300和0.3～1.0％v/v的AES。
9.根据权利要求7所述的一种癌胚抗原检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的标记缓冲液为0.1-0.15M、pH为7-9的CB缓冲液。
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