CN107561287A - 一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒及其制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫检测领域，具体涉及一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒，包括包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液、VEGF参考品、VEGF质控品、VEGF酶结合物、浓缩洗涤液和发光底物液。本发明还涉及该试剂盒的制备和使用方法。本发明的检测试剂盒具有检测结果准确、稳定性好、特异性强、灵敏度高、线性范围宽、检测时间短、使用方便，适于推广应用等优点。

Description

一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒及其制备和使用方法

技术领域

本发明涉及免疫检测领域，具体涉及一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒及其制备和使用方法。

背景技术

近来对肿瘤生长的不断深入研究，发现血管生成对肿瘤的生长起着至关重要的作用。血管生成是在促血管生成因子的作用下，内皮细胞从静止状态变为有迁移能力的顶细胞，以出芽的形式向周围扩增、迁移、逐步形成完整的新生血管的过程。一般认为，成人的血管处于相对静止的状态，其血管生成只出现在妊娠期、子宫内膜周期性重建及肿瘤、类风湿性关节炎、心血管疾病、子宫内膜异位等疾病中，其中肿瘤是研究最多的一种。而这一过程受多种促血管生成因子和血管生成抑制因子的调节，其中血管内皮细胞生长因子(VEGF)是最重要的促血管生成因子之一。

VEGF是一个分子量为45KD的高度糖基化的碱性蛋白，是一种有高度特异性的促进血管内皮细胞分裂，诱导血管新生的因子，它可以特异地作用于血管内皮细胞，促进血管生成，维持血管的正常状态和完整性，提高血管通透性。血管内皮细胞生长因子参与许多病理和生理的表达，在参与骨折愈合的表达全过程中起到重要因素，在糖尿病肾病的发病过程中会表达增强，另外在对白血病和严重肢体缺血的表达中可作为一种基因治疗的药物。研究发现，VEGF在许多病理生理过程中都有表达，例如创伤修复中的血管内皮细胞和巨噬细胞、糖尿病视网膜病变细胞、心脑血管病和肝脏疾病等，并以自分泌、旁分泌和胞内分泌的方式特异地作用于血管内皮细胞膜上的VEGF受体从而引发细胞内信号转导而实现的。在众多血管生成因子当中，VEGF是公认的主要的诱导血管生成的物质，它能强烈地促进血管内皮有丝分裂和新生血管形成。

磁微粒化学发光法是酶标记免疫分析技术的新发展，该技术将磁性微球应用于免疫检测的固相，大大提高了反应的表面积，增加了抗原或抗体的吸附量，加快了反应速度，提高了检测的灵敏度。相比于时间免疫分辨荧光、免疫层析及ELISA方法，具有准确度高、特异性好、精密度高、线性范围广、试剂稳定性良好等特点；目前磁微粒化学发光免疫分析技术已成为在免疫诊断领域全球使用最广泛的分析方法，也是免疫试剂重要的发展方向之一。现有技术血管内皮细胞生长因子的检测方法主要有酶联免疫法、时间分辨荧光免疫分析法、化学发光法等，然而这些方法具有线性范围窄，检测时间长等缺点，无法满足临床需求，因此寻找一种更有效的检测方式就成了临床应用的关键。

发明内容

本发明的第一个目的在于是：针对现有技术存在的不足，提供一种用于检测血管内皮细胞生长因子的检测试剂盒；该试剂盒检测结果准确、稳定性好、特异性强、灵敏度高、线性范围宽、检测时间短、使用方便，适于推广应用。

为了实现上述发明的目的，本发明的技术方案是：

一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒，所述检测试剂盒包括包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液、VEGF参考品、VEGF质控品、VEGF酶结合物、浓缩洗涤液和发光底物液。

作为一种优选的技术方案，所述包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:2500-1:7500的比例配制；

所述VEGF酶结合物为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的VEGF单克隆抗体,且所述VEGF酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:1000-1:5000的比例稀释；

所述VEGF参考品和所述VEGF质控品均由VEGF标准品与参考品稀释液配制而成，所述VEGF参考品的浓度分别为0pg/mL、30pg/mL、125pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL；

所述VEGF质控品的浓度为125pg/mL、1000pg/mL。

作为一种进一步优选的技术方案，所述包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:5000的比例配制，所述VEGF酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:3000的比例稀释。

作为一种优选的技术方案，所述参考品稀释液为pH7.5的Tris-HCl缓冲液，且每1L缓冲液中还含有18-22gBSA、14-15gEDTA、3.8-4g2-巯基乙醇和0.3-0.5mL的Proclin-300。

作为一种优选的技术方案，所述浓缩洗涤液为0.04-0.06mol、pH7.4-pH7.6的Tris-HCl缓冲液，且每1L缓冲液中还含有0.04-0.06％v/v的吐温-80和0.7-0.8％v/v的Proclin-300。

作为一种优选的技术方案，所述发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B,所述发光底物液A为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、3-氨基邻苯二甲酰肼0.4-0.6g和对位碘酚0.007-0.008g；

所述发光底物液B为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g和过氧化氢0.1-0.3ml。

本发明的第二个目的在于：提供一种检测血管内皮细胞生长因子的检测试剂盒的制备方法。

为了实现上述发明的目的，本发明的技术方案是：

一种检测血管内皮细胞生长因子的检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备VEGF磁性微球混悬液

将经过N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺活化后的磁微粒加磁场，吸出上清液，用pH5-6、浓度为0.01-0.05mol/L的吗啉乙磺酸缓冲液清洗，并用上述吗啉乙磺酸缓冲液按照浓度为20-60mg/mL将磁微粒进行悬浮，加入VEGF抗体，再加磁场，用含有0.1-1.0％w/v牛血清白蛋白、pH为7.3-7.5、0.01-0.05mol/L的磷酸缓冲液封闭2-6小时后，再用含有吐温-20、牛血清白蛋白和Proclin-300的磷酸盐缓冲液清洗，并用该溶液配制成1-4mg/mL的磁性微球混悬母液，再将所述磁性微球混悬母液按1:2500-1:7500稀释，制得VEGF磁性微球混悬液；

(2)制备VEGF参考品及质控品

用参考品稀释液将VEGF标准品按一定的比例稀释成系列参考品，其参考品浓度范围为0pg/mL-2000pg/mL；按照上述操作制备浓度为125pg/mL、1000pg/mL的质控品，并以0.5mL/支对参考品和质控品进行分装、冻干；

(3)配制VEGF酶结合物

将辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的VEGF单克隆抗体溶液与酶结合物稀释液按照1:1000-1:5000的比例配制；

(4)配制浓缩洗涤液

按照每1LpH7.5的Tris-HCl缓冲液中含有7-10gNaCl、0.3-0.6ml吐温-80和6-8mlProclin-300进行配制；

(5)配制发光底物液A和发光底物液B

发光底物液A：按照每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、3-氨基邻苯二甲酰肼0.03-0.06g、对位碘酚0.006-0.008g和110-130μl盐酸的添加量配制来配制，调节pH为9；

发光底物液B：按照每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、过氧化氢0.1-0.3ml和110-130μl盐酸的添加量配制，调节pH为9；

(6)将上述步骤(1)-(5)制备的磁性微球混悬液、酶结合物、参考品、质控品、浓缩洗涤液、发光底物液A和发光底物液B分别进行分装。

作为一种改进的技术方案，所述磁微粒为粒径1-3μm，且表面包裹有羧基、氨基、磺酰基任意一种活性基团的磁性微球。

作为一种优选的技术方案，所述步骤(3)中酶结合物稀释液为pH7.5的PBS缓冲液，且每1LPBS缓冲液中还含有8-11g牛血清白蛋白、5-6g氯化钙、3-6％v/v的小牛血清、0.02-0.04％v/v的Proclin-300和0.3～1.0％v/v的AES。

本发明的第三个目的在于：提供一种检测血管内皮细胞生长因子的试剂盒的检测方法。

为了实现上述发明的目的，本发明的技术方案是：

一种检测血管内皮细胞生长因子的试剂盒检测血管内皮细胞生长因子的方法，包括以下步骤：

(1)将在冷藏环境中贮存的试剂室温平衡15分钟以上；

(2)用纯化水将浓缩洗涤液进行40倍稀释，摇匀备用，作为应用洗涤液；

(3)用蒸馏水溶解参考品、质控品，静置15分钟后混匀使用；

(4)将VEGF参考品、质控品及待测样本置于相应板架上，设定相关测定参数为：磁性微球的加量为50μL，样本、参考品、质控品的加液量为50μL，酶结合物的加液量为50μL，设定温育时间为25分钟，循环清洗次数为三次，每次应用洗涤液用量为400μL，发光底物液A与发光底物液B按照1:1比例混匀，设定的加液量为50μL，振荡混匀的时间为20秒，测量时间为0.9秒；

(5)根据各标准溶液发光值，借助全自动化学发光免疫分析仪的分析软件进行四参数Logistic拟合，坐标选择X-Y，得标准曲线；也可采用双对数Log(X)-Log(Y)线性分析方法，得标准曲线；最后根据标准曲线计算出样本中VEGF的浓度。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有以下优点：

本发明是将双抗体夹心法免疫测定原理与超顺磁性纳米微球标记技术和酶催化化学发光免疫分析相结合的定量检测产品，由于本发明试剂盒体系中所采用的各溶液配方和各组分的制备方法均是该反应体系下的最优方案，使得本发明试剂盒线性范围宽，在5-2000pg/mL之间成良好的线性关系，而且灵敏度高，准确度高(相关系数r为0.9997)，批内和批间差均符合检测标准，准确程度优于目前市场上其它类型的VEGF试剂盒，检测时间与目前市场上其它类型的VEGF试剂盒相比至少缩短了30分钟，大大提高了检测效率。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒，包括包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液、VEGF参考品、VEGF质控品、VEGF酶结合物、浓缩洗涤液和发光底物液。其中包被VEGF抗体的磁性微球混悬液的浓度为1:2500-1:7500(优选工作浓度为1:5000)，VEGF酶结合物为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的VEGF单克隆抗体，VEGF酶结合物的浓度为1:1000-1:5000(优选工作浓度为1:3000)；VEGF参考品和质控品均为VEGF标准品与参考品溶液配制而成，VEGF参考品的浓度分别为0pg/mL、30pg/mL、125pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL；所述VEGF质控品的浓度为125pg/mL、1000pg/mL。

参考品溶液为pH7.5Tris-HCl缓冲液，且每1L缓冲液中还含有20gBSA、14.612gEDTA、3.907g2-巯基乙醇和0.3mL的Proclin-300。

浓缩洗涤液为0.05mol、pH7.5的Tris-HCl缓冲液，且每1L缓冲液中还含有0.05％v/v的吐温-80和0.75％v/v的Proclin-300。

发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B,发光底物液A为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.5g、三羟甲基氨基甲烷1.5g、3-氨基邻苯二甲酰肼0.5g和对位碘酚0.0075g；

发光底物液B为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.5g、三羟甲基氨基甲烷1.5g和过氧化氢0.25ml。

实施例2

一种检测血管内皮细胞生长因子的检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)配制VEGF磁性微球混悬液

将粒径为2.8μm的磁微粒用N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺进行活化，室温下搅拌30min，加磁场，静置1-3min,吸出上清液，用pH值为5-6的0.01mol/L的吗啉乙磺酸缓冲液清洗三次，并用上述吗啉乙磺酸缓冲液按照浓度为20-60mg/mL将磁微粒进行悬浮；

按照50-150μg/ml的浓度向吗啉乙磺酸溶液中加入VEGF抗体,在25℃下搅拌2-5h，加磁场，静置2-6min，吸出上清液，用含有0.1-1.0％w/v牛血清白蛋白、0.02mol/L的磷酸缓冲液(pH为7.4)于25℃下搅拌封闭2-6小时；用pH值为7.4、含0.1％v/v的吐温-20、1.0％v/v的牛血清白蛋白和0.01％v/vProclin-300的磷酸盐缓冲液清洗3-5次，然后用上述含有吐温-20、牛血清白蛋白和Proclin-300的磷酸盐缓冲液配制浓度为1-4mg/mL的磁性微球初溶液，将磁性微球初溶液按照其与上述磷酸盐缓冲液(含有吐温-20、牛血清白蛋白和Proclin-300的磷酸盐缓冲液)按照1:2500-1:7500的比例稀释，制得VEGF磁性微球混悬液；

(2)制备VEGF参考品及质控品

用参考品稀释液将VEGF标准品按一定的比例稀释成系列参考品，其参考品浓度范围为0pg/mL-2000pg/mL；按照上述操作制备浓度为125pg/mL、1000pg/mL的质控品，并以0.5mL/支对参考品和质控品进行分装、冻干；

(3)配制VEGF酶结合物

将辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的VEGF单克隆抗体溶液与酶结合物稀释液按照1:1000-1:5000比例配制；

(4)配制浓缩洗涤液

配制1LpH为7.5的Tris-HCl缓冲液，然后再称量9gNaCl、量取0.5mL吐温-80、7.5mLProclin-300加入Tris-HCl缓冲液中，即得浓缩洗涤液；

(5)配制发光底物液A和发光底物液B

发光底物液A：按照每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.5g、三羟甲基氨基甲烷1.5g、3-氨基邻苯二甲酰肼0.05g、对位碘酚0.0075g来配制，并按照每1000ml发光底物液A加500μl盐酸的添加量加入盐酸，调节pH值至pH＝9；

发光底物液B：按照每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.5g、三羟甲基氨基甲烷1.5g、过氧化氢0.25ml的添加量配制，并按照每1000ml发光底物液B加500μl盐酸的添加量加入盐酸，调节pH值至pH＝9；

(6)将上述步骤(1)-(5)制备的磁性微球混悬液、酶结合物、参考品、质控品、浓缩洗涤液、发光底物液A和发光底物液B的分装。

实施例3

一种检测血管内皮细胞生长因子的试剂盒检测血管内皮细胞生长因子的方法，包括以下步骤：

(1)将在冷藏环境中贮存的试剂室温平衡15分钟以上；

(2)用纯化水将浓缩洗涤液进行40倍稀释，摇匀备用，作为应用洗涤液；

(3)用蒸馏水溶解参考品、质控品，静置15分钟后混匀使用；

(4)将VEGF参考品、质控品及待测样本置于相应板架上，设定相关测定参数为：磁性微球的加量为50μL，样本、参考品、质控品的加液量为50μL，酶结合物的加液量为50μL，设定温育时间为25分钟，循环清洗次数为三次，每次应用洗涤液用量为400μL，发光底物液A与发光底物液B按照1:1比例混匀，设定的加液量为50μL，振荡混匀的时间为20秒，测量时间为0.9秒；

(5)根据各标准溶液发光值，借助全自动化学发光免疫分析仪的分析软件进行四参数Logistic拟合，坐标选择X-Y，得标准曲线；或采用双对数Log(X)-Log(Y)线性分析方法，得标准曲线；最后根据标准曲线计算出样本中VEGF的浓度。

实施例4

一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒的主要产品性能指标为：

(1)试剂盒的最低检测限(灵敏度)

10孔平行测定样本稀释液，计算测定结果的平均数(M)与标准差(SD)，得出M+2SD对应的发光值，代入剂量-反应曲线，计算出相应的浓度值，该浓度值即为本试剂盒的最低检测限。经验证，本试剂盒的最低检测限指标检测结果见表1。

表1试剂盒最低检测限的测定

结论：测定的VEGF样本稀释液的平均发光值M＝5925.10，SD＝1127.7，将(M+2SD)的值带入此次反应曲线，得其灵敏度为：4.4pg/mL(<5pg/mL)，符合要求。

(2)试剂盒的剂量-反应曲线的线性

复孔测定试剂盒的参考品(浓度依次为0pg/mL、30pg/mL、125pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL和2000pg/mL的参考品进行两孔测定)，用四参数进行拟合，本试剂盒的剂量-反应曲线的线性检测结果见表2。

表2试剂盒剂量-反应曲线的线性

结论：测定的VEGF剂量-反应曲线线性相关系数(r)为：0.9997(>0.9900)，符合要求。

(3)试剂盒的准确度

检测浓度为125pg/mL和1000pg/mL的参考品，每个浓度参考品检测3次，计算测定结果的均值M，本试剂盒的准确度检测结果见表3。

表3试剂盒的准确度

结论：测定的125pg/mL和1000pg/mL准确度参考品的相对偏差(Bias％)分别为：1.35％和1.29％，测定值与靶值的相对偏差(Bias％)均<15.0％，符合要求。

(4)试剂盒的精密度

a、分析内精密度：浓度分别为125pg/mL和1000pg/mL的参考品重复检测，本试剂盒的分析内精密度检测结果见表4。

表4试剂盒分析内精密度的测定

编号	125pg/mL	1000pg/mL
			1	131.82	1040.18
2	125.07	1088.28
			3	127.72	989.78
4	124.59	1038.63
			5	131.66	1080.58
6	115.89	1093.75
			7	134.43	1075
8	130.95	1016.95
			9	125.13	1043.33
10	128.87	1012.2
			CV	4.15％	3.38％

结论：测定的125pg/mL和1000pg/mL精密度参考品的分析内变异系数(CV)分别为：4.15％和3.38％(均<8.0％)，符合要求。

b、批间精密度：用3个批号的试剂盒分别检测浓度为125pg/mL和1000pg/mL的参考品，各重复10次，本试剂盒的分析间精密度检测结果见表5。

表5试剂盒批间精密度的测定

结论：测定的125pg/mL和1000pg/mL精密度参考品的批间变异系数(CV)分别为：5.34％和5.07％(均<20.0％)，符合要求。

从上述测定的数据可以看出，本发明设计的一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒在灵敏度、准确度、精密度等各项质量参数均处于领先地位。

实施例5

一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒的临床检测实例如下：

采用本发明试剂盒对240例检测样本进行检测，其中阳性样本约80例，阴性样本约160例(体检后经证实无糖尿病、银屑病、迟发性过敏反应及无缺血性心肌病等疾病、3个月内无皮肤伤口及骨折的人群)，其中包含干扰因素及交叉反应样本40例(高脂血样本、溶血样本、高胆红素样本、类风湿因子阳性样本各10例)，检测结果见表6。

表6VEGF考核试剂与对比试剂检测结果比较

结论：t值＜t0.05,500＝1.965＜t0.05,239，P＞0.05，两种试剂差别无显著性，说明两试剂测定结果高度相关，具有等效性。

VEGF考核试剂与对比试剂阳性符合率为96.25％，阴性符合率为99.375％，总符合率为98.33％。通过相关性分析、卡方检验及配对t检验，说明考核试剂和临床诊断不存在显著性差异，具有很好的相关性。

本专利不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所作出的种种变换，均落在本专利的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液、VEGF参考品、VEGF质控品、VEGF酶结合物、浓缩洗涤液和发光底物液。

2.根据权利要求1所述的一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:2500-1:7500的比例配制；

所述VEGF酶结合物为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的VEGF单克隆抗体,且所述VEGF酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:1000-1:5000的比例稀释；

所述VEGF参考品和所述VEGF质控品分别由VEGF标准品与参考品稀释液配制而成，所述VEGF参考品的浓度分别为0pg/mL、30pg/mL、125pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL；

所述VEGF质控品的浓度为125pg/mL、1000pg/mL。

3.根据权利要求2所述的一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:5000的比例配制，所述VEGF酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:3000的比例稀释。

4.根据权利要求2所述的一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述参考品稀释液为pH7.5的Tris-HCl缓冲液，且每1L缓冲液中还含有18-22gBSA、14-15g EDTA、3.8-4g 2-巯基乙醇和0.3-0.5mL的Proclin-300。

5.根据权利要求1所述的一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述浓缩洗涤液为0.04-0.06mol、pH7.4-pH7.6的Tris-HCl缓冲液，且每1L缓冲液中还含有0.04-0.06％v/v的吐温-80和0.7-0.8％v/v的Proclin-300。

6.根据权利要求1所述的一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B,所述发光底物液A为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、3-氨基邻苯二甲酰肼0.4-0.6g和对位碘酚0.007-0.008g；

所述发光底物液B为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g和过氧化氢0.1-0.3ml。

7.一种如权利要求1所述血管内皮细胞生长因子检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述制备方法包括下列步骤：

(1)制备VEGF磁性微球混悬液

将经过N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺活化后的磁微粒加磁场，吸出上清液，用pH5-6、浓度为0.01-0.05mol/L的吗啉乙磺酸缓冲液清洗，并用上述吗啉乙磺酸缓冲液按照浓度为20-60mg/mL将磁微粒进行悬浮，加入VEGF抗体，再加磁场，用含有0.1-1.0％w/v牛血清白蛋白、pH为7.3-7.5、0.01-0.05mol/L的磷酸缓冲液封闭2-6小时后，再用含有吐温-20、牛血清白蛋白和Proclin-300的磷酸盐缓冲液清洗，并用该溶液配制成1-4mg/mL的磁性微球混悬母液，再将所述磁性微球混悬母液按1:2500-1:7500稀释，制得VEGF磁性微球混悬液；

(2)制备VEGF参考品及质控品

用参考品稀释液将VEGF标准品按一定的比例稀释成系列参考品，其参考品浓度范围为0pg/mL-2000pg/mL；按照上述操作制备浓度为125pg/mL、1000pg/mL的质控品，对参考品和质控品进行分装、冻干；

(3)配制VEGF酶结合物

将辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的VEGF单克隆抗体溶液与酶结合物稀释液按照1:1000-1:5000的比例稀释配制；

(4)配制浓缩洗涤液

按照每1LpH7.5的Tris-HCl缓冲液中含有7-10gNaCl、0.3-0.6ml吐温-80和6-8mlProclin-300进行配制；

(5)配制发光底物液A和发光底物液B

发光底物液A：按照每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、3-氨基邻苯二甲酰肼0.03-0.06g、对位碘酚0.006-0.008g的添加量配制，调节pH为9；

发光底物液B：按照每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、过氧化氢0.1-0.3ml的添加量配制，调节pH为9；

(6)将上述步骤(1)-(5)制备的磁性微球混悬液、酶结合物、参考品、质控品、浓缩洗涤液、发光底物液A和发光底物液B分别进行分装。

8.根据权利要求7所述的一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒的制备方法，其特征在于:所述磁微粒为粒径1-3μm，且表面包裹有羧基、氨基、磺酰基任意一种活性基团的磁性微球。

9.根据权利要求7所述的一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中酶结合物稀释液为pH7.5的PBS缓冲液，且每1LPBS缓冲液中还含有8-11g牛血清白蛋白、5-6g氯化钙、3-6％v/v的小牛血清、0.02-0.04％v/v的Proclin-300和0.3～1.0％v/v的AES。

10.一种如权利要求1所述的血管内皮细胞生长因子检测试剂盒的使用方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将在冷藏环境中贮存的试剂室温平衡15分钟以上；

(2)用纯化水将浓缩洗涤液进行40倍稀释，摇匀备用，作为应用洗涤液；

(3)用蒸馏水溶解参考品、质控品，静置15分钟后混匀使用；

(4)将VEGF参考品、质控品及待测样本置于相应板架上，设定相关测定参数为：磁性微球的加量为50μL，样本、参考品、质控品的加液量为50μL，酶结合物的加液量为50μL，设定温育时间为25分钟，循环清洗次数为三次，每次应用洗涤液用量为400μL，发光底物液A与发光底物液B按照1:1比例混匀，设定的加液量为50μL，振荡混匀的时间为20秒，测量时间为0.9秒；

(5)根据各标准溶液发光值，借助全自动化学发光免疫分析仪的分析软件进行四参数Logistic拟合，坐标选择X-Y，得标准曲线；或采用双对数Log(X)-Log(Y)线性分析方法，得标准曲线；最后根据标准曲线计算出样本中VEGF的浓度。