CN114019174A - 一种试剂盒及其在血管内皮生长因子检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种试剂盒及其在血管内皮生长因子检测中的应用，该试剂盒中含有各自独立保存的以下组分：抗体包被磁珠工作液、VEGF标记抗体、VEGF校准品、VEGF质控品和样品稀释液；其中抗体包被磁珠工作液为包被抗体A的磁珠悬液；VEGF标记抗体为通过吖啶酯修饰物对抗体B进行标记获得；吖啶酯修饰物为吖啶磺酰肼胺内盐或其他吖啶酯衍生物，抗体A和抗体B为不同氨基酸序列的人源化VEGF抗体Fab段。本发明选择吖啶酯修饰物与人源化抗VEGF抗体Fab段偶联，稳定性高，提升了检测系统的灵敏度、检测范围以及保存时间并缩短了反应时间。本试剂盒线性范围达到0.5～50000pg/mL。

Description

一种试剂盒及其在血管内皮生长因子检测中的应用
技术领域
本发明属于血管内皮生长因子检测技术领域，具体为一种试剂盒及其在血管内皮生长因子检测中的应用。
背景技术
血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是胚胎发生、骨骼生长和生殖功能过程中生理性血管生成的关键调节剂。研究发现VEGF在多种病理和生理条件下表达，因此可以作为标志物用于体外诊断。目前市面上VEGF体外检测试剂盒主要采用的是量子点免疫荧光法，酶联法，板式化学发光法和磁微粒化学发光法。目前现有试剂盒存在着下列问题：
1)灵敏度和线性范围还需进一步提升。有报道称健康志愿者的VEGF含量为16.27±8.54pg/ml，而胃癌早期患者的VEGF含量均值为223.61±58.67pg/ml，而处于肝癌早期组的血清中VEGF含量均值也仅为549.7±150.1pg/ml。如试剂盒的灵敏度不高，则不能很好地起到早期筛查的作用。与此同时，现有产品中，灵敏度最高的产品为0.1pg/ml，但是其线性范围上限仅为800pg/ml。而IIIA/IIIB期的肿瘤患者血清VEGF浓度范围为14.9-1824.0pg/mL，这将导致在实际检测时不得不对高VEGF浓度样品进行稀释，而增加的额外步骤将会降低数据的可重复性和真实性。而检测线性范围相对较大的产品其灵敏度不足(普遍大于1pg/ml)，这也可能导致检测数据准确性的下降而影响临床判断。
2)工艺复杂。目前VEGF磁微粒化学发光检测试剂盒主要的工艺路线有两种。一种工艺是抗体和磁珠之间引入一对连接物来起到信号放大的作用；另一种方式是抗体直接包被在活化后的磁珠上。而这两种工艺都较为复杂，不利于试剂盒的大批量稳定生产。
3)检测时间较长。目前市面的VEGF试剂盒主要的检测方式为一步法和两步法。两步法指的是先将待测抗原与包被抗体结合，冲洗后再加入标记抗体孵育，彻底洗涤未结合的标记抗体后进行显色。一步法指的是将待测抗原、包被抗体与标记抗体一并孵育，彻底洗涤后进行显色。相比较两步法，一步法所需孵育总时长更短，普遍在25分钟左右，而目前的一步法所需孵育总时长仍然是较长的，无法在临床更快速地辅助医生给出疾病控制的方案。
发明内容
为了克服现有技术的问题，本发明提出了一种试剂盒及其在血管内皮生长因子检测中的应用。本发明的目的是这样实现的：
一种试剂盒，该试剂盒中含有各自独立保存的以下组分：抗体包被磁珠工作液、VEGF标记抗体、VEGF校准品、VEGF质控品和样品稀释液；所述抗体包被磁珠工作液为包被抗体A的磁珠悬液，其中磁珠与抗体A的质量比为：50:1～150:1；所述VEGF标记抗体为通过吖啶酯修饰物对抗体B进行标记获得，其中抗体B与吖啶酯修饰物的物质的量的比为1:5～1:20；
所述吖啶酯修饰物为吖啶磺酰肼胺内盐(NSP-SA-NHS，Cas：199293-83-9)或其他吖啶酯衍生物；所述抗体A和抗体B为不同氨基酸序列的人源化VEGF抗体Fab段。
进一步的对磁珠的优化，所述抗体包被磁珠工作液中的磁珠为甲苯磺酰活化的磁珠。
进一步的对抗体的优化，所述为抗体A和抗体B分别为rVEGF-Fab 1与rVEGF-Fab 2中的各一种，rVEGF-Fab 1和rVEGF-Fab 2均由轻链和重链组成；rVEGF-Fab 1轻链的氨基酸序列如序列表中序列1所示，rVEGF-Fab 1重链的氨基酸序列如序列表中序列2所示；rVEGF-Fab 2轻链的氨基酸序列如序列表中序列3所示，rVEGF-Fab2重链的氨基酸序列如序列表中序列4所示。
进一步的，所述抗体包被磁珠工作液的制备方法：取磁珠母液重悬后加入硼酸盐缓冲液进行抗体A的包被；然后加入缓冲液TBS-T(20-200mM Tris，0-1M NaCl，0.0％-1％BSA，0.1％-0.5％Tween-20，0.1％-1％Proclin-300，pH 6.5-9.0)稀释至工作需要浓度。
进一步的，所述VEGF标记抗体的制备方法为：取抗体B用CBS缓冲液稀释，加入吖啶酯修饰物溶液，搅拌均匀后经过反应得到半成品标记物，加入DL-赖氨酸后使用SephadexG-25脱盐获得VEGF标记抗体，洗脱缓冲体系为TBS-T(20-200mM Tris，0-1M NaCl，0.0％-1％BSA，0.1％-0.5％Tween-20，0.1％-1％Proclin-300，pH 6.5-9.0)。
进一步的，所述VEGF校准品和所述VEGF质控品均由样品稀释液配制而成，所述VEGF校准品的浓度范围为0.5-50000pg/mL，所述VEGF质控品的浓度为200pg/ml，400pg/ml和4000pg/ml。
进一步的，所述样品稀释液为pH 6.5-9.0的PBS缓冲液，且每升样品稀释液还含有5-20g BSA和1-10ml Proclin-300。
进一步的，该试剂盒中含有独立保存的浓缩洗涤液及两种不同的发光激发液。
所述的试剂盒在检测血管内皮生长因子中的应用。
应用过程中的一种检测方法为：以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，在反应杯中依次加入用样品稀释液稀释后的样品、抗体包被磁珠工作液和VEGF标记抗体，33-40℃孵育10～20min后进行磁分离，使用稀释后的浓缩洗涤液清洗数次，将反应杯送入暗室，加入发光激发液A与发光激发液B进行发光反应，并记录发光值。通过VEGF校准品校准、并且通过VEGF质控品进行质控。
本发明的优点和有益效果是：
1、本发明选择吖啶酯修饰物与人源化抗VEGF抗体Fab段偶联，稳定性高，提升了检测系统的灵敏度、检测范围以及保存时间并缩短了反应时间。本试剂盒线性范围达到0.5～50000pg/mL。
相比较吖啶酯AE-NHS、DMAE-NHS、ME-DMAE-NHS，吖啶盐NSP-SA-NHS引入了丙磺酸修饰，增加了亲水性，有助于加强抗体的水溶性，以便发光检测在均相液体中进行且缩短反应时间。与此同时，C-N的键级大于C-O，吖啶盐NSP-SA-NHS与蛋白的偶联物稳定性更高。
2、本发明优选的甲苯磺酰活化的磁珠，它可以同时与配体的巯基和氨基反应且无需缩合剂。这类磁珠对蛋白的结合效率更高，不需要对抗体进行交联来提升抗体与磁珠的结合能力。由于基础信号值的提升，无需借助异硫氰酸荧光素+对应抗体或者亲和素+生物素连接物对信号进行放大。基于上述两点，成功简化了生产工艺，提升了生产效率。
3、本发明选择的人源化VEGF抗体Fab段。与传统的鼠单抗相比，人源化VEGF抗体Fab段适合大批量生产，亦通过改造来增强其与抗原的亲和力。除此以外，人源化VEGF抗体Fab段的使用可以有效避免Fc片段的非特异性结合。上述优化有助于加强产品的灵敏度，减少反应时间并保证产品的稳定性。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是本发明试剂盒制备流程示意图。
图2是试剂盒回归分析图。
具体实施方式
实施例1：
本实施例为一种试剂盒，其制备流程如图1所示，
该试剂盒中含有各自独立保存的以下组分：抗体包被磁珠工作液、VEGF标记抗体、VEGF校准品、VEGF质控品和样品稀释液以及附带的浓缩洗涤液、发光激发液A与发光激发液B。
VEGF人源化抗体Fab的制备：
本实施例设计两种人源化VEGF抗体Fab，分别是rVEGF-Fab 1和rVEGF-Fab 2(本实施例中，抗体A为rVEGF-Fab 1、抗体B为rVEGF-Fab 2)包括：
(1)以VEGF重组抗原对小鼠进行免疫，获得与抗原亲和力强的鼠源单克隆抗体细胞系后进行抗体可变区序列测序。
(2)根据得到的可变区序列进行免疫基因数据库IMGT(www.imgt.org)分析，参照人源化抗体模板进行嵌合抗体设计。将优化后的序列借助Hind III和Xho I酶切位点构建至pcDNA3.1(+)载体并转染至HEK293T细胞系，随后进行嵌合抗体表达。
rVEGF-Fab 1轻链氨基酸序列为序列表中序列1所示；
rVEGF-Fab 1重链氨基酸序列为序列表中序列2所示；
rVEGF-Fab 2轻链氨基酸序列为序列表中序列3所示：
rVEGF-Fab 2重链氨基酸序列为序列表中序列4所示。
(3)借助Protein G填料进行抗体纯化。根据BCA法对蛋白浓度进行检测。浓度统计结果如表1：
表1
浓度(mg/mL) 20201101批 20201102批 20201201批 20210101批
rVEGF-Fab 1 10.8 13.2 17.0 10.1
rVEGF-Fab 2 9.8 9.9 13.8 15.3
(4)对rVEGF-Fab进行效价检测。酶标板每孔包被100ng VEGF重组抗原，加入倍比稀释的VEGF-rAb 37℃温育1小时。温育结束后加入带有HRP标记的羊抗人二抗，最后加入TMB显色，加入2M硫酸终止反应，置酶标仪波长于450nM并进行检测。检测结果如下：
表2
效价 20201101批 20201102批 20201201批 20210101批
rVEGF-Fab 1 512k 256k 512k 256k
rVEGF-Fab 2 512k 512k 256k 128k
本实施例中抗体包被磁珠工作液的制备方法：为取磁珠母液(Thermo DynabeadsTM M-280Tosylactivated，货号30110D，原始浓度100mg/mL)200μl，重悬(用移液枪轻柔吹打，使其充分悬浮)后加入0.1M硼酸盐缓冲液(BBS，pH 9.5)165μL和抗体A200μg振荡混匀；然后加入缓冲液TBS-T(0.06M Tris-HCl缓冲液，0.6M NaCl，0.05％BSA，0.5％吐温-20，0.1％Proclin300，pH 7.5)。磁珠：抗体A质量比为100:1。磁珠为甲苯磺酰活化的磁珠。
本实施例中VEGF标记抗体的制备方法为：取1mg抗体B用CBS缓冲液稀释至2mg/ml，加入16.5μL 4mM NSP-SA-NHS溶液，搅拌均匀后经过反应得到标记物，加入200μl 5％DL-赖氨酸后使用Sephadex G-25脱盐，洗脱缓冲体系为TBS-T(0.06M Tris-HCl缓冲液，0.6MNaCl，0.05％BSA，0.5％吐温-20，0.1％Proclin300，pH 7.5)。本实施例中抗体B与NSP-SA-NHS的物质的量1:10。
VEGF校准品和VEGF质控品均由样品稀释液配制而成，VEGF校准品的浓度范围为0.5-50000pg/mL；VEGF质控品的浓度为200pg/ml，400pg/ml和4000pg/ml，具体的，是用样品稀释液缓冲液将血管内皮生长因子抗原配置成相应的浓度；
样品稀释液为pH 6.5-9.0的PBS缓冲液，且每升样品稀释液还含有5-20g BSA和1-10ml Proclin-300；
然后，将上述步骤的抗体包被磁珠工作液、VEGF标记抗体、VEGF校准品、VEGF质控品、样品稀释液分别进行分装。
实施例2：
本实施例为实施例1中的血管内皮生长因子检测中的应用。
具体检测方法：
1)以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具。检测前，所有样本、校准品和质控品需平衡至室温(18℃-26℃)。
2)扫描试剂包二维码自动获取测试所需参数，扫码后将试剂包放于项目对应试剂位。
3)使用VEGF校准品进行仪器定标并使用VEGF质控品进行质量控制，确定质控品测定浓度在质控范围后进行目标样本检测。
4)机器自动向反应杯中依次加入待测样品20μL和4倍体积的样品稀释液并进行充分混匀，随后依次加入100μL磁珠工作液和100μL VEGF标记抗体，充分混匀并于37℃孵育15min后进行磁分离。
5)磁分离后弃掉上清，并加入300μL稀释后的浓缩洗液，重复清洗3次。
6)将反应杯送入暗室，各加入100μL发光激发液A与100μL发光激发液B进行发光反应，并记录发光值。
7)根据试剂包二维码测得的发光值自动计算为待测样本浓度值。
经测定该试剂盒的主要产品性能指标为：
(1)试剂盒的准确度试验
将VEGF国际标准品分别配制成200pg/mL溶液，重复检测3次，计算相对偏差。经验证，本试剂盒准确度指标检测结果如表3所示：
表3
Figure BDA0003412738910000061
结论：测量结果的相对偏差在±10％范围内，且3次结果都符合要求，以上3批试剂盒的准确度合格。
(2)试剂盒的精密度试验
依据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS/CLSI)文件EP5-A2方案进行，批内精密度和实验室间精密度采用多因素整合的嵌套设计进行实验，不同操作者，不同设备，不同地点，每天上、下午各检测一次，每个样本重复检测2次，连续检测20天，每台设备各收集80个数据结果，计算其批内精密度和实验室间精密度。经验证，本试剂盒精密度指标检测结果如表4所示：
表4
Figure BDA0003412738910000071
结论：不同操作者，不同设备，不同地点，试剂盒对低、高浓度样本重复进行检测，其批间精密度和实验室间精密度CV均＜15％，说明本试剂盒符合精密度性能评估要求。
(3)试剂盒的线性区间
选择1例血管内皮生长因子高浓度样本(补充VEGF重组抗原的基础血清)，采用稀释液稀释13个浓度水平，每个稀释后的样本重复测试3次，计算其均值。依据结果逐渐减少浓度点计算相应的线性关系，确定试剂盒的最宽线性范围。经验证，本试剂盒精密度指标检测结果如表5和图2所示：
表5
Figure BDA0003412738910000081
结论：通过试剂盒对线性区间的评价，在[0.5～50000]pg/mL的范围内相关系数r不低于0.9900且无离群值；对此线性区间采用多项式回归分析，二次方程与三次方程中的b2和b3中Sig.均＞0.05，与零无显著性差异，故数据组具线性。因此本试剂盒线性范围为[0.5～50000]pg/mL。
(4)试剂盒的灵敏度试验
用试剂盒检测空白样本重复检测20次，进行灵敏度确定。经验证，本试剂灵敏度指标检测结果如表6所示：
表6
Figure BDA0003412738910000082
结论：测定的空白样本平均发光值为364.70，将
Figure BDA0003412738910000093
值带入反应曲线，得灵敏度为0.5pg/mL，符合要求。
(5)方法学比对
检测经本试剂盒(酶联免疫吸附法)赋值的样本40例。回归分析数据显示其y＝0.9945x+0.0050且r＞0.975，p＜0.05，证明本产品与上市同产品具有良好一致性。
(6)临床诊断分析
采用本发明试剂盒对临床检测样本进行检测，以判断本试剂盒是否可以用于临床辅助检测。
a)宫颈癌，妇科良性肿瘤，宫颈炎及正常女性血清VEGF水平分析
选择宫颈癌，妇科良性肿瘤，宫颈炎及正常女性血清进行VEGF水平分析。经验证，检测结果如表7所示：
表7
Figure BDA0003412738910000091
结论：宫颈癌患者血清VEGF阳性率明显高于妇科良性肿瘤、宫颈炎及正常女性血清，证明本产品能够用于癌症临床辅助诊断。
b)乳腺癌，良性病变，正常女性血清VEGF水平分析
选择乳腺癌，良性病变，正常女性血清进行VEGF水平分析。经验证，检测结果如表8所示：
表8
Figure BDA0003412738910000092
结论：乳腺癌患者血清VEGF阳性率明显高于良性病变，正常女性血清，再次证明本产品能够用于癌症临床辅助诊断。
同时，除上述实施方案外，还可采用以下方案实现本发明的效果：
1)将发光标记物改为吖啶酯及其他吖啶酯衍生物；
2)将磁珠(本发明实施例中为2.8μm)改为其他大小或携带其他官能团的磁珠或微珠；
3)使用其他达到类似效果的重组抗VEGF Fab段(原核细胞来源亦或真核细胞来源)；
4)对上述试剂浓度和pH及其他组分的修改；
5)对质控品浓度梯度的修改；
6)将发光系统改为其他发光系统(如碱性磷酸酶或辣根过氧化酶等)；
7)将管式化学发光平台改为电化学发光平台，板式化学发光平台，酶联免疫平台或放射性核素标记免疫平台；
8)将全自动化学发光平台改为半自动或者手动化学发光平台；
9)将一步法改为两步法检测。
最后应说明的是，以上仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳布置方案对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Figure IDA0003412738980000011
Figure IDA0003412738980000021
Figure IDA0003412738980000031

Claims (9)

1.一种试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有各自独立保存的以下组分：抗体包被磁珠工作液、VEGF标记抗体、VEGF校准品、VEGF质控品和样品稀释液；
所述抗体包被磁珠工作液为包被抗体A的磁珠悬液，其中磁珠与抗体A的质量比为：50:1～150:1；
所述VEGF标记抗体为通过吖啶酯修饰物对抗体B进行标记获得，其中抗体B与吖啶酯修饰物的物质的量的比为1:5～1:20；所述吖啶酯修饰物为吖啶磺酰肼胺内盐或其他吖啶酯衍生物；
所述抗体A和抗体B为不同氨基酸序列的人源化VEGF抗体Fab段。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述抗体包被磁珠工作液中的磁珠为甲苯磺酰活化的磁珠。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述为抗体A和抗体B分别为rVEGF-Fab1与rVEGF-Fab 2中的各一种，rVEGF-Fab 1与rVEGF-Fab 2均由轻链和重链组成；rVEGF-Fab1轻链的氨基酸序列如序列表中序列1所示，rVEGF-Fab 1重链的氨基酸序列如序列表中序列2所示；rVEGF-Fab 2轻链的氨基酸序列如序列表中序列3所示，rVEGF-Fab2重链的氨基酸序列如序列表中序列4所示。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述抗体包被磁珠工作液的制备方法：取磁珠母液重悬后加入硼酸盐缓冲液并进行抗体A的包被；然后加入TBS-T缓冲液稀释至工作需要浓度。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述VEGF标记抗体的制备方法为：取抗体B用CBS缓冲液稀释，加入吖啶酯修饰物溶液，搅拌均匀后经过反应得到半成品，加入DL-赖氨酸后使用Sephadex G-25脱盐获得VEGF标记抗体，洗脱缓冲体系为TBS-T。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述VEGF校准品和所述VEGF质控品均由样品稀释液配制而成，所述VEGF校准品的浓度范围为0.5-50000pg/ml，所述VEGF质控品的浓度为200pg/ml，400pg/ml和4000pg/ml。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述样品稀释液为pH 6.5-9.0的PBS缓冲液，且每升样品稀释液还含有5-20g BSA和1-10ml Proclin-300。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒中还含有独立保存的浓缩洗涤液及两种不同的发光激发液。
9.权利要求1～8中任意一项所述的试剂盒在检测血管内皮生长因子中的应用。
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