CN116333111B - 靶向Aβ40重组抗体、靶向Aβ42重组抗体与检测Aβ40和/或Aβ42的试剂盒 - Google Patents
靶向Aβ40重组抗体、靶向Aβ42重组抗体与检测Aβ40和/或Aβ42的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了一种靶向β‑淀粉样蛋白40的重组抗体，一种靶向β‑淀粉样蛋白42的重组抗体，一种编码所述重组抗体的核酸分子，一种检测β‑淀粉样蛋白40的试剂盒，一种检测β‑淀粉样蛋白42的试剂盒，一种检测β‑淀粉样蛋白40和β‑淀粉样蛋白42的试剂盒，以及所述重组抗体或所述核酸分子在制备用于诊断阿尔兹海默症的试剂盒中的用途。本申请的重组抗体亲和力高、灵敏度高、生产周期明显缩短，更适合作为核心原料应用于体外诊断试剂领域。
Description
技术领域
本申请属于免疫分析技术领域，涉及一种靶向Aβ40重组抗体，靶向Aβ42重组抗体，检测Aβ40和/或Aβ42的试剂盒。
背景技术
阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种与年龄相关的最常见神经系统退行性疾病。
阿尔茨海默病(AD)以神经元死亡为特征，通常与淀粉样斑块和神经原纤维缠结(NFT)的出现有关。其中，β淀粉样蛋白(Aβ)是指一组由39-43个氨基酸残基组成的疏水性肽，主要是Aβ42和Aβ40，其病理聚集与AD的神经元变性和认知衰退有关。目前研究结果证实使用脑脊液Aβ42/Aβ40比值作为AD生物标志物时能够有效提高正确诊断患者的百分比。相比较PET-CT等影像学手段，该生物标志物组合的检测将有助于AD的早期发现以及治疗效果的动态追踪。
现有技术中，Aβ42和Aβ40检测主要采用的是酶联免疫、POCT、电化学发光、化学发光等技术平台。
目前现有抗体制备技术的缺点主要有以下两点：
(1)抗体灵敏度不足
现有技术中，久保田丽夫等的Aβ42人源化抗体亲和力仅为30～71nM(BIAcore测定)。R.B.德马托斯等发明的抗N3pGlu重组抗体的亲和力为0.35nM和0.71nM(BIAcore测定)。其他相似发明的数据显示其Aβ抗体灵敏度均为0.1～10nM级。抗体灵敏度不足将直接影响检测试剂的灵敏度，同时降低检测的特异性和抗干扰性，并最终影响检测结果的可靠性。
(2)传统单克隆制备工艺先天不足
体外诊断试剂在研发及生产过程中，需保证产品的批间重复性可控。作为核心原料之一的抗体，其批间性能差异将会直接体现在试剂盒的批间重复性上。鼠单抗制备过程中，抗体效价易受到动物个体化差异影响。同时小鼠腹水的体积普遍少于5mL。虽然采用这种方式获得的单克隆抗体可能有着更强的亲和力，但是想通过传统单克隆抗体制备工艺制备大批量批间性能稳定的抗体是有一定困难的。
现有试剂盒制备技术的缺点主要有以下三点：
(1)检测时间过长
ELISA平台程序相对繁琐，费时费力。即便配套全自动酶联免疫工作站也不能减少样本和酶标抗体的孵育时间。目前基于ELISA的Aβ42和Aβ40检测技术耗时普遍在100min到180min。而电化学发光平台也存在类似的情况。周艳丽等的方法要求传感器与Aβ寡聚体的孵育时间为1h，与AuNPs共轭物的孵育时间长达3h。而贾能勤等的方法也至少需要2h以上的时间进行孵育。这样的检测时长无疑为临床检验科室/体检科室的高通量、高效率Aβ42和Aβ40检测带来了困扰。
(2)检出限数值高
检出限数值越低说明试剂盒灵敏度越高，越能够可靠地定量检测到低丰度被检测物。然而骆海明等的专利数据显示其ELISA试剂盒的检出限大于100pg/mL。在POCT平台，戴正乾等和骆海明等的结果显示其试纸条的Aβ42检出限均大于40pg/mL，试剂盒灵敏度低。
(3)线性范围窄
更宽的线性范围可以保证样本无需稀释即可完成检测，这样无疑可以减少检测次数并消除因样本稀释而造成的检测偏差。张玉基等的实验数据显示其Aβ42的线性范围仅为0-1200pg/mL。而李俊尊等建立的Aβ42检测系统，其线性范围也仅为4.86-1017.68pg/mL。该线性范围上限均低于文章报道样本中Aβ42的高值(1456±23.01pg/mL)。
发明内容
基于上述描述，当前Aβ42和Aβ40检测系统还有很多不足。因此AD的早期发现以及治疗效果的动态追踪受到了限制。为了克服现有技术中存在的不足，本申请提供一种抗β-淀粉样蛋白40重组抗体和一种抗β-淀粉样蛋白42重组抗体，本申请的重组抗体灵敏度更高、生产周期明显缩短。
本申请的具体技术方案如下：
1.一种靶向β-淀粉样蛋白40的重组抗体，其特征在于，所述重组抗体包含三个重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)和三个轻链互补决定区(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)，其中：
CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID No:1或SEQ ID No:2所示；
CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID No:3或SEQ ID No:4所示；
CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID No:5或SEQ ID No:6所示；
CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID No:7或SEQ ID No:8所示；
CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID No:9或SEQ ID No:10所示；
CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID No:11或SEQ ID No:12所示。
2.根据项1所述的重组抗体，其特征在于，
所述CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示；
所述CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示；
所述CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示；
所述CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID No:7所示，
所述CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID No:9所示；
所述CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID No:11所示。
3.根据项1所述的重组抗体，其特征在于，
所述CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；
所述CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示；
所述CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示；
所述CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID No:8所示；
所述CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID No:10所示；
所述CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID No:12所示。
4.根据项1～3中任一项所述的重组抗体，其特征在于，所述重组抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:13或SEQ ID No:14所示，或为与SEQID No:13或SEQ ID No:14具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:15或SEQ ID No:16所示，或为与SEQID No:15或SEQ ID No:16具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
5.根据项4所述的重组抗体，其特征在于，
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:13所示，或为与SEQ ID No:13具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:15所示，或为与SEQ ID No:15具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
6.根据项4所述的重组抗体，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNo:14所示，或为与SEQ ID No:14具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:16所示，或为与SEQ ID No:16具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
7.一种靶向β-淀粉样蛋白42的重组抗体，其特征在于，所述重组抗体包含三个重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)和三个轻链互补决定区(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)，其中：
CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID No:17或SEQ ID No:18所示；
CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID No:19或SEQ ID No:20所示；
CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID No:21或SEQ ID No:22所示；
CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID No:23或SEQ ID No:24所示；
CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID No:25或SEQ ID No:26所示；
CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID No:27或SEQ ID No:28所示。
8.根据项7所述的重组抗体，其特征在于，
所述CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID No:17所示；
所述CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID No:19所示；
所述CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID No:21所示；
所述CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID No:23所示；
所述CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID No:25所示；
所述CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID No:27所示。
9.根据项7所述的重组抗体，其特征在于，
所述CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID No:18所示；
所述CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID No:20所示；
所述CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID No:22所示；
所述CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID No:24所示；
所述CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID No:26所示；
所述CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID No:28所示。
10.根据项7～9中任一项所述的重组抗体，其特征在于，所述重组抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:29或SEQ ID No:30所示，或为与SEQID No:29或SEQ ID No:30具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:31或SEQ ID No:32所示，或为与SEQID No:31或SEQ ID No:32具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
11.根据项10所述的重组抗体，其特征在于，
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:29所示，或为与SEQ ID No:29具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:31所示，或为与SEQ ID No:31具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
12.根据项10所述的重组抗体，其特征在于，
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:30所示，或为与SEQ ID No:30具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:32所示，或为与SEQ ID No:32具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
13.一种编码如项1～12中任一项所述的重组抗体的核酸分子。
14.一种检测β-淀粉样蛋白40的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
靶向β-淀粉样蛋白40的第一抗体包被的磁珠；和
经化学发光剂标记的靶向β-淀粉样蛋白40的第二抗体；
其中，靶向β-淀粉样蛋白40的第一抗体和第二抗体为项1～6中任一项所述的重组抗体。
15.一种检测β-淀粉样蛋白42的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
靶向β-淀粉样蛋白42的第一抗体包被的磁珠；和
经化学发光剂标记的靶向β-淀粉样蛋白42的第二抗体；
其中，靶向β-淀粉样蛋白42的第一抗体和第二抗体为项7～12中任一项所述的重组抗体。
16.一种检测β-淀粉样蛋白40和β-淀粉样蛋白42的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
靶向β-淀粉样蛋白40的第一抗体包被的磁珠；
经化学发光剂标记的靶向β-淀粉样蛋白40的第二抗体；
靶向β-淀粉样蛋白42的第一抗体包被的磁珠；和
经化学发光剂标记的靶向β-淀粉样蛋白42的第二抗体；
其中，靶向β-淀粉样蛋白40的第一抗体和第二抗体为项1～6中任一项所述的重组抗体，靶向β-淀粉样蛋白42的第一抗体和第二抗体为项7～12中任一项所述的重组抗体。
17.根据项14～16中任一项所述的试剂盒，其特征在于，其用于诊断阿尔兹海默症。
18.项1～12中任一项所述的重组抗体、或者项13所述的核酸分子在制备用于诊断阿尔兹海默症的试剂盒中的用途。
发明的效果
本申请提供了一种新的靶向β-淀粉样蛋白40的重组抗体和一种新的靶向β-淀粉样蛋白42的重组抗体及包含上述重组抗体的试剂盒，本申请的重组抗体亲和力高、灵敏度高、生产周期明显缩短，更适合作为核心原料应用于体外诊断试剂领域。
本申请的测定样品中Aβ40、Aβ42的水平的试剂盒，以一对高亲和力且性能稳定的重组抗体作为核心原料，将靶向Aβ40、Aβ42的第一抗体包被磁珠，将靶向Aβ40、Aβ42的第二抗体进行化学发光标记，将第一抗体包被磁珠、标记的第二抗体与被测样品混合磁分离，并在磁微粒化学发光平台进行检测。磁微粒化学发光平台有着操作简单、自动化程度高以及均相反应体系等优势，借助一步法的反应系统可以进一步缩短检测时间；本申请的高亲和力重组抗体对抗原表位识别能力更强，与抗原之间的结合程度更高，因此高亲和力抗体具备更强的低丰度靶抗原捕获的能力，为试剂盒提供一个更低的检出限，检测灵敏度高；在不改变包被工艺的前提下，更换高亲和力抗体可以增强单位质量磁珠或其他介质的抗原抓取能力，进而不产生Hook效应的前提下明显提升试剂的线性范围。
附图说明
图1为采用本申请的Aβ40试剂盒与G1200平台产品检测样品中Aβ40含量的一致性分析结果。
图2为采用本申请的Aβ42试剂盒与G1200平台产品检测样品中Aβ42含量的一致性分析结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本申请做进一步的详细描述，给出的实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。
本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义，如有冲突以本说明书中的定义为准。
在本文中，术语“重组抗体”是将免疫特异性重链和轻链抗体基因克隆到高效表达载体，再将这些载体引入表达宿主(例如细菌、酵母或哺乳动物)中进行抗体表达而得到的抗体。本申请的抗体可以是全人源化抗体、人源化抗体、嵌合抗体等。
在一些实施方式中，本申请的抗体为全长抗体，全长抗体典型地是指由两条“重链”和两条“轻链”组成的抗体。“重链”通常是这样的多肽，其在N端到C端方向由重链可变区(VH)、重链恒定区1(CH1)，铰链区(HR)，抗体重链恒定区2(CH2)，和重链恒定区3(CH3)组成，缩写为VH-CH1-HR-CH2-CH3；在一些实施方式中，“全长抗体重链”是在N端到C端方向由VH，CH1，HR，CH2和CH3组成的多肽。“全长抗体轻链”通常是在N端到C端方向由轻链可变区(VL)，和轻链恒定区(CL)组成的多肽，缩写为VL-CL。
本申请中，所述轻链恒定区、重链恒定区可以为任意的轻链恒定区、重链恒定区。所述轻链恒定区(CL)可以是κ(kappa)或λ(lambda)。所述重链恒定区可以是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD中的任意一种的重链恒定区。
本领域技术人员公知，每个重链可变区可由三个互补决定区(CDR)和四个框架区(FR)区构成，每个轻链可变区可由三个互补决定区(CDR)和四个框架区(FR)区构成，互补决定区(CDR，通常有CDR1、CDR2及CDR3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。在一些实施方式中，从N-末端至C-末端，重链可变区与轻链可变区均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3与FR4。重链可变区或轻链可变区的CDR序列有两种常见的定义方式，即Kabat定义和Chothia定义，例如参见Kabat et al.,“Sequences of ProteinsofImmunological Interest”，National Institutes of Health,Bethesda，MD.(1991)；Al-Lazikani et al.，J Mol Biol 273:927-948(1997)；以及Martin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272(1989)。对于给定抗体的可变区序列，可以根据Kabat定义或者Chothia定义来确定重链可变区或轻链可变区序列中CDR序列。在本申请的实施方案中，利用Chothia定义确定CDR序列。
在本文中，术语“同一性”或被定义为经过序列比对和引入空位后，氨基酸或核苷酸序列变体中相同的残基的百分比。用于比对的方法和计算机程序在本领域内是公知的。在本文中，提及的与氨基酸序列具有百分比同一性的氨基酸序列是指在所提及的氨基酸序列的整个长度上具有所述百分比同一性的序列。
在本文中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA 插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
在本文中，术语“核酸”或“多核苷酸”或“核酸分子”通常是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其单链形式或双链形式的聚合物。除非特别限定，否则该术语可以包括含天然核苷酸的类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸(例如示出了序列信息)相似的结合特性并且按照与天然存在核苷酸相似的方式代谢。除非另外说明，核酸的序列可以包括其保守方式修饰的变体，例如简并密码子置换、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列，以及明确指出的序列。
在本文中，术语“EC50值”是指半数最大效应浓度(concentration for 50％ofmaximal effect,EC50)，指能引起50％最大效应的浓度。
在本文中，“亲和力”表示分子(例如，抗体)的单个结合位点和它的结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指出，否则本说明书中使用的“结合亲和力”表示反映结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间的1∶1相互作用的固有结合亲和力。分子X对它的配偶体Y的亲和力通常可以由平衡解离常数(KD)表示。通过本领域已知的常见方法，可以测定亲和力。
在本文中，术语“单克隆抗体”表示得自基本上同源的抗体的群体的抗体，即，构成所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制品的生产过程中产生)以外，这样的变体通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，单克隆抗体制品的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因而，修饰语“单克隆”指示所述抗体得自基本上同源的抗体群体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产所述抗体。
在本文中，术语“靶向β-淀粉样蛋白40的重组抗体”表示能够以足够的亲和力结合β-淀粉样蛋白40、能够用作靶向β-淀粉样蛋白40的诊断剂和/或治疗剂的重组抗体。“靶向β-淀粉样蛋白42的重组抗体”表示能够以足够的亲和力结合β-淀粉样蛋白42、能够用作靶向β-淀粉样蛋白42的诊断剂和/或治疗剂的重组抗体。
本申请的靶向β-淀粉样蛋白40的重组抗体与靶标无关的蛋白不结合。这里，“无关的蛋白”是指除作为靶标的β-淀粉样蛋白40以外的其他蛋白；这里，“不结合”是指：在将本申请的靶向β-淀粉样蛋白40的重组抗体与作为其靶标的β-淀粉样蛋白40的结合能力作为100％的情况下，本申请的靶向β-淀粉样蛋白40的重组抗体与所述无关蛋白的结合能力小于10％，例如为9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或者0。
本申请的靶向β-淀粉样蛋白42的重组抗体与靶标无关的蛋白不结合。这里，“无关的蛋白”是指除作为靶标的β-淀粉样蛋白42以外的其他蛋白；这里，“不结合”是指：在将本申请的靶向β-淀粉样蛋白42的重组抗体与作为其靶标的β-淀粉样蛋白42的结合能力作为100％的情况下，本申请的靶向β-淀粉样蛋白42的重组抗体与所述无关蛋白的结合能力小于10％，例如为9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或者0。
可通过本领域已知的多种标准的蛋白纯化或重组表达技术中的任何一种来产生适于产生抗体的β-淀粉样蛋白。适于产生免疫应答的β-淀粉样蛋白的形式包括β-淀粉样蛋白的亚型Aβ40和Aβ42。另外的β-淀粉样蛋白的形式包括β-淀粉样蛋白表达细胞、含有β-淀粉样蛋白的制品或细胞提取物或级分、部分纯化的β-淀粉样蛋白。
在一些实施方式中，本申请采用磁微粒化学发光免疫分析法测定样品中Aβ40、Aβ42的水平，具体原理是：用化学发光剂直接标记抗原或抗体(化学发光剂标记物)，与被测样品中相应抗体或抗原、磁颗粒性(磁珠)的抗原或抗体反应，通过磁场把结合状态(沉淀部分)和游离状态的化学发光剂标记物分离开来，然后加入发光促进剂(发光底物)进行发光反应，通过对发光强度的检测进行定量或定性检测。
在本文中，ELISA(enzyme linked immune sorbent assay)，即酶联免疫吸附测定，是指利用抗体分子能与抗原分子特异性结合的特点，将游离的杂蛋白和结合于固相载体的目的蛋白结合，并利用特殊的标记物对其定性或定量分析的一种检测方法。其原理是抗原或抗体能物理性地吸附于固相载体表面，并且保持其免疫活性；抗原或抗体能与酶通过共价键形成酶结合物，同时保持各自的免疫活性或酶活性；酶结合物与相应的抗原或抗体结合后，能通过加入底物的颜色反应来确定免疫反应的发生，颜色反应的深浅与标本中相应抗原或抗体的量成正比。
第一方面，本申请提供一种靶向β-淀粉样蛋白40的重组抗体，其包含三个重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)和三个轻链互补决定区(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)，其中：CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID No:1或SEQ ID No:2所示；CDR-H2的氨基酸序列如SEQID No:3或SEQ ID No:4所示；CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID No:5或SEQ ID No:6所示；CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID No:7或SEQ ID No:8所示；CDR-L2的氨基酸序列如SEQ IDNo:9或SEQ ID No:10所示；CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID No:11或SEQ ID No:12所示。
在一些实施方式中，所述CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID No:1(GFNFKDF)所示；所述CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID No:3(DPENGD)所示；所述CDR-H3的氨基酸序列如SEQ IDNo:5(NPQSERKPSTYSL)所示；所述CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID No:7(KSSQSLLYGDGKTYLN)所示，所述CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID No:9(LVSKLDS)所示；所述CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID No:11(VQGSYFPLT)所示。
在一些实施方式中，所述CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID No:2(GPNFKDF)所示；所述CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID No:4(DPENGD)所示；所述CDR-H3的氨基酸序列如SEQ IDNo:6(CDAIQRHFIDYDF)所示；所述CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID No:8(KSSQSLLYSDGKTYLN)所示；所述CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID No:10(LVSKLDS)所示；所述CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID No:12(VQESHFPLT)所示。
在一些实施方式中，所述重组抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:13或SEQ ID No:14所示，或为与SEQ ID No:13或SEQ IDNo:14具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:15或SEQ ID No:16所示，或为与SEQ ID No:15或SEQ ID No:16具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:13(EVQLQQSAAELVRTGASVKLSCTTSGFNFKDFYMHWIKQRPEQGLEWIGWLDPENGDTEYAPKFQGKATMAADTSSDTTYLQLSSLMSEDTAVYYCNVNPQSERKPSTYSLWGQGTTLTVAS)所示，或为与SEQ ID No:13具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:15(DVMMTGSPHTLTVTIGQPASISCKSSQSLLYGDGKTYLNWLFQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGTGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCVQGSYFPLTFGAGTKIALKRA)所示，或为与SEQ ID No:15具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:14(EVQLQMSAAELVRTGASVKLSCTTSGPNFKDFYMHWIKQRPEQGLDWIGWLDPENGDTEYAPKFQGKATMAGDTSSDTTYLQLSSLMSEDTAVRYCNVCDAIQRHFIDYDFWGQGTTLTVAS)所示，或为与SEQ ID No:14具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:16(DVMMTQSPRTISVTIGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDPTLKISRVEAEDLGIYYCVQESHFPLTFGAGTWLALKRA)所示，或为与SEQ ID No:16具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
第二方面，本申请还提供一种靶向β-淀粉样蛋白42的重组抗体，其包含三个重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)和三个轻链互补决定区(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)，其中：CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID No:17或SEQ ID No:18所示；CDR-H2的氨基酸序列如SEQID No:19或SEQ ID No:20所示；CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID No:21或SEQ ID No:22所示；CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID No:23或SEQ ID No:24所示；CDR-L2的氨基酸序列如SEQID No:25或SEQ ID No:26所示；CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID No:27或SEQ ID No:28所示。
在一些实施方式中，所述CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID No:17(GFNFKDF)所示；所述CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID No:19(DPENGD)所示；所述CDR-H3的氨基酸序列如SEQ IDNo:21(HAIWYDEEELYRH)所示；所述CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID No:23(KSSQSLLYSDGKGYLN)所示；所述CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID No:25(LVSKLDS)所示；所述CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID No:27(VQGSHFPLT)所示。
在一些实施方式中，所述CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID No:18(GFNFKDF)所示；所述CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID No:20(EPENGD)所示；所述CDR-H3的氨基酸序列如SEQ IDNo:22(SENISYLRRTRGA)所示；所述CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID No:24(KSSQTLLYSDGKTYLN)所示；所述CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID No:26(LVSKLDS)所示；所述CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID No:28(VQGSHFPLT)所示。
在一些实施方式中，所述重组抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:29或SEQ ID No:30所示，或为与SEQ ID No:29或SEQ IDNo:30具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:31或SEQ ID No:32所示，或为与SEQ ID No:31或SEQ ID No:32具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:29(EVQLQQSAGELVRTGASVKLSCATSGFNFKDFYWHWIKQRPEQGLDWIGWLDPENGDTEYAPKFQGKATMAADTSSDTTYLQLSSLMSEETAVYYCNVHAIWYDEEELYRHWGQGTTLTIAS)所示，或为与SEQ ID No:29具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:31(DVMWTQSPRTLTVTIGQPASISCKSSQSLLYSDGKGYLNWLFQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSYSGSDFTLKISRVEAEDLGIYYCVQGSHFPLTFGAGTKLAVKRA)所示，或为与SEQ ID No:31具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:30(EVQLQTSAGELVRTGASIKLSCATSGFNFKDFYWHWLKQRPEQGLDWIGWLEPENGDTEHAPKFQGKATMAAETSSDTTYLQLSFLMSEETAVYHCNVSENISYLRRTRGAWGQGTTLTIAS)所示，或为与SEQ ID No:30具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:32(DVMWTQSPRTLSVTIGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSNTDFTLKISRVDAEELGIYYCVQGSHFPLTFGAGTKLALKHAD)所示，或为与SEQ ID No:32具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
第三方面，本申请还提供一种编码前述任一项重组抗体的核酸分子。
第四方面，本申请还提供一种检测β-淀粉样蛋白40的试剂盒，其包括：靶向β-淀粉样蛋白40的第一抗体包被的磁珠；和经化学发光剂标记的靶向β-淀粉样蛋白40的第二抗体；其中，靶向β-淀粉样蛋白40的第一抗体、第二抗体分别为前述第一方面中任一项所述的重组抗体。
第五方面，本申请还提供一种检测β-淀粉样蛋白42的试剂盒，其包括：靶向β-淀粉样蛋白42的第一抗体包被的磁珠；和经化学发光剂标记的靶向β-淀粉样蛋白42的第二抗体；其中，靶向β-淀粉样蛋白42的第一抗体、第二抗体分别为前述第二方面中任一项所述的重组抗体。
第六方面，本申请还提供一种检测β-淀粉样蛋白40和β-淀粉样蛋白42的试剂盒，其包括：靶向β-淀粉样蛋白40的第一抗体包被的磁珠；经化学发光剂标记的靶向β-淀粉样蛋白40的第二抗体；靶向β-淀粉样蛋白42的第一抗体包被的磁珠；和经化学发光剂标记的靶向β-淀粉样蛋白42的第二抗体；其中，靶向β-淀粉样蛋白40的第一抗体、第二抗体分别为前述第一方面中任一项所述的重组抗体，靶向β-淀粉样蛋白42的第一抗体、第二抗体分别为前述第二方面中任一项所述的重组抗体。
在一些实施方式中，第四方面、第五方面、第六方面的试剂盒，还包括待测样品标准品、底物、包被缓冲液、洗涤液、封闭液和样品稀释液等，其中，包被缓冲液为磁珠包被提供高pH环境，提升包被效率；封闭液用于封闭掉未偶联的空位，防止后期非特异结合。在一些实施方式中，底物包括发光激发液A和发光激发液B，其中发光激发液A为硝酸和过氧化氢水溶液，发光激发液B为氢氧化钠水溶液，包被缓冲液为硼酸盐缓冲液，洗涤液为PBS和吐温-20；封闭液为BSA封闭液，样品稀释液为PBS缓冲液。
在上述实施方式中，所述试剂盒还包括保存缓冲液和淬灭缓冲液，其中，保存缓冲液用于提供稳定的pH环境、减弱抗体降解、防腐等；猝灭缓冲液用于淬灭掉未与抗体结合的标记物。在一些实施方式中，保存缓冲液为缓冲液TBS-T，猝灭缓冲液为5％ DL-赖氨酸。
在一些实施方式中，第四方面、第五方面、第六方面的试剂盒可用于诊断阿尔兹海默症。
第七方面，本申请还提供一种前述任一项重组抗体、或者前述任一项核酸分子在制备用于诊断阿尔兹海默症的试剂盒中的用途。
在一些实施方式中，所述试剂盒可为磁颗粒电化学发光试剂盒、电化学发光试剂盒、ELISA试剂盒、POCT检测试剂盒、SERS检测试剂盒，质谱试剂盒，微流控试剂盒和光化学试剂盒等。
实施例
以下将结合具体实施例说明本申请内容，但本申请范围不限于此。如果没有特殊说明，以下实施例中使用的试剂和仪器都是本领域常规试剂和仪器，可以通过商购方式获得。所使用的方法均为常规实验方法，本领域技术人员根据实施例内容可以毫无疑问地实施所述方案并获得相应结果。
实施例1重组抗体rAβ40-A、rAβ40-B、rAβ42-A和rAβ42-B的制备
本实施例中重组抗体的制备方法为：将商业化Aβ40抗原(R&D，货号1191)和商业化Aβ42抗原(R&D，货号1428)参照Kayed R,Head E,Thompson JL等人的Common structure ofsoluble amyloid oligomers implies common mechanism of pathogenesis[J].Science,2003,300(5618):486-489中的方法进行低聚化处理。以低聚化的Aβ40或Aβ42抗原分别对小鼠进行免疫。获得与抗原亲和力强的鼠源单克隆抗体细胞系后进行抗体可变区序列测序。根据可变区序列完成嵌合载体构建并转染至Hek293T细胞系中进行重组抗体表达。其中，所用的轻链载体为pFUSE2ss-CLIg-mk(使用EcoRI和BstAPI酶切位点进行构建)，重链载体为pFUSEss-CHIg-mg1(使用EcoRI和AfeI酶切位点进行构建)，上述两个载体均为商业化载体，无需额外处理。重组抗体在Hek293T细胞系中表达后，经由ProteinG填料得到纯化后的重组抗体rAβ40-A、rAβ40-B、rAβ42-A和rAβ42-B。其中，rAβ40-A重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:13所示，rAβ40-A轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:15所示，rAβ40-B重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:14所示，rAβ40-B轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:16所示，rAβ42-A重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:29所示，rAβ42-A轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:31所示，rAβ42-B重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNo:30所示，rAβ42-B轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:32所示。
实施例2重组抗体rAβ40-A、rAβ40-B、rAβ42-A和rAβ42-B性能验证
借助BCA(Bicinchoninic AcidAssay)技术对多批次不同重组抗体进行浓度检测，浓度统计结果如下表1所示，表1中显示的是纯化后的重组抗体浓度。使用的是BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)(碧云天，货号P0010)。具体按照试剂盒说明书操作。
表1
借助Elisa技术对多批次的重组抗体进行亲和力检测。酶标板每孔包被100ng Aβ40或Aβ42抗原，加入倍比稀释的重组抗体37℃温育1小时。温育结束后加入带有HRP标记的羊抗人二抗，最后加入TMB显色，加入2M硫酸终止反应，置酶标仪波长于450nM并进行检测，检测结果分别如下表2～9所示。
20220601批次rAβ40-A：
表2
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20220701批次rAβ40-A：
表3
20220601批次rAβ40-B：
表4
20220701批次rAβ40-B：
表5
20220601批次rAβ42-A：
表6
20220701批次rAβ42-A：
表7
20220601批次rAβ42-B：
表8
20220701批次rAβ42-B：
表9
根据SigmaPlot 13.0软件计算重组抗体各批次EC50，数据总结于下表10中，表10中结果显示上述重组抗体亲和力较高。相对于现有技术中的nM级的KD值，本申请的重组抗体的KD值能够达到pM级，约为现有技术的千分之一，本申请重组抗体亲和力远远高于现有技术的抗体亲和力。
表10
实施例3检测β-淀粉样蛋白的试剂盒的制备以及检测过程
(1)制备β-淀粉样蛋白抗体包被磁珠工作液：磁珠选择甲苯磺酰活化的磁珠(Thermo DynabeadsTM M-280Tosylactivated，Cat#30110D)，原始浓度为100mg/mL。涡旋混匀后超声处理5min并充分重悬。用移液枪吸取充分重悬的磁珠母液100μL(约10mg磁珠)，磁分离5min去除液体。加入0.1M硼酸盐缓冲液(pH 9.5)165μL和rAβ40-A或rAβ42-A重组抗体200μg充分混匀并于37℃孵育过夜。孵育结束后，磁分离5min去除液体。加入10％ BSA 37℃封闭3h。封闭结束后，磁分离5min去除液体。最后加入缓冲液TBS-T(0.1M磷酸盐缓冲体系，pH7.4，补充有0.1％BSA，0.5％吐温-20和0.1％Proclin300)4℃保存待用。本实施例中重组抗体与磁珠的质量比1:50。需将包被后的母液继续用缓冲液TBS-T稀释20倍配置为工作液使用。
(2)制备β-淀粉样蛋白标记抗体工作液：吸取rAβ40-B或rAβ42-B重组抗体0.5mg，与8.25μL 4mM NSP-SA-NHS(Heliosense，Cat#HS-11015005，溶于DMF中)溶液充分混合2h。向溶液中补充200μl 5％DL-赖氨酸，继续混和30min。使用Sephadex G-25脱盐，缓冲液TBS-T(0.1M磷酸盐缓冲体系，pH7.4，补充有0.1％BSA，0.5％吐温-20和0.1％Proclin300)。补加等体积甘油充分混匀后，-20℃保存待用。本实施例中重组抗体与NSP-SA-NHS的物质的量比1:10。需将标记后的母液继续用缓冲液TBS-T稀释4000倍配置为工作液使用。
(3)样品溯源：在G1200平台按照说明书使用/>Gβ-Amyloid 1-40(Fujirebio，货号231524)或/>Gβ-Amyloid 1-42(Fujirebio，货号230336)对Aβ抗原进行溯源。
(4)校准品和质控品的分装：Aβ40和Aβ42的校准品及质控品均由抗原和样品稀释液配置而成。其中Aβ40校准品的浓度范围为10-40000pg/mL，Aβ42校准品的浓度范围为10-3000pg/mL；Aβ40质控品的浓度为50pg/ml，500pg/ml和20000pg/ml；Aβ42质控品的浓度为25pg/ml，100pg/ml和2000pg/ml。样品稀释液为pH7.4的PBS缓冲液，且每升样品稀释液还含有1％ BSA和0.1％Proclin300。
(5)试剂盒组装：将3个批次小试生产的包被抗体、标记抗体分装于试剂仓内，与校准品、质控品一并组装成试剂盒。具体信息如下表11所示：
表11
(6)上机检测
检测流程：以全自动化学发光免疫分析仪(Smart 500s全自动化学发光分析仪，重庆科斯迈生物科技有限公司)为检测工具，检查并补充耗材，开机后完成自检。手动或扫码输入Aβ40和Aβ42测试所需参数及试剂批号，并将试剂放于相应试剂位。分别使用Aβ40和Aβ42校准品对主曲线进行校准。分别使用Aβ40和Aβ42质控品对检测系统进行质控。质控合格后，在样本位依次加入待测样本进行检测。检测完毕后进行数据输出及分析整理。
反应体系：机器自动吸取样本100μL并与100μL磁珠工作液和100μL标记抗体工作液充分混匀，并于37℃孵育15min后进行磁分离。弃掉上清后加入免疫分析仪配套洗液(PBS和吐温-20)，重复清洗3次。随后将反应被送入暗室，并加入免疫分析仪配套发光激发液A(硝酸和过氧化氢水溶液)、发光激发液B(氢氧化钠水溶液)各100μL进行发光反应，并记录发光值。结合已录入并校准后的计算曲线计算得到样本对应浓度值。
实施例4磁珠及包被抗体浓度的优化
选择甲苯磺酰活化的磁珠(Thermo DynabeadsTM M-280 Tosylactivated，Cat#14204)和羧基磁珠(Thermo DynabeadsTM M-270 Carboxylic Acid，Cat#14305D)涡旋混匀后超声处理5min并充分重悬。分别用移液枪吸取充分重悬的约10mg磁珠，磁分离5min去除液体。
甲苯磺酰活化的磁珠系统：加入165μL 0.1M硼酸盐缓冲液(pH 9.5)，以及rAβ40-A或rAβ42-A重组抗体100μg、200μg或400μg并充分混匀并于37℃孵育过夜。孵育结束后，磁分离5min去除液体。加入10％ BSA 37℃封闭3h。封闭结束后，磁分离5min去除液体。最后加入缓冲液TBS-T(0.1M磷酸盐缓冲体系，pH7.4，补充有0.1％BSA，0.5％吐温-20和0.1％Proclin300)4℃保存待用。本实施例中重组抗体与磁珠的质量比分别为1:50、1:100、1:200。需将包被后的母液继续稀释20倍配置为β-淀粉样蛋白抗体包被磁珠工作液使用。
羧基磁珠系统：加入1mL 0.1M MES缓冲液(pH 5.0)重悬磁珠，加入rAβ40-A或rAβ42-A重组抗体100μg、200μg或400μg并涡旋混匀。室温下旋转混匀30分钟后，加入100μL偶联试剂(10mg/mL EDC，溶于冰预冷pH 5.0的0.1M MES缓冲液，现配现用)。随后继续室温下旋转混匀3小时。孵育结束后，磁分离5min去除液体。最后加入缓冲液TBS-T(0.1M磷酸盐缓冲体系，pH7.4，补充有0.1％BSA，0.5％吐温-20和0.1％Proclin300)4℃保存待用。本实施例中重组抗体与磁珠的质量比分别为1:50、1:100、1:200。需将包被后的母液继续稀释20倍配置为β-淀粉样蛋白抗体包被磁珠工作液使用。
本实施例中对应β-淀粉样蛋白标记抗体工作液的制备方法为：吸取rAβ40-B或rAβ42-B重组抗体0.25mg，与8.25μL 4mM NSP-SA-NHS(Heliosense，Cat#HS-11015005，溶于DMF中)溶液充分混合2h。向溶液中补充200μl 5％DL-赖氨酸，继续混和30min。使用SephadexG-25脱盐，缓冲液TBS-T(0.1M磷酸盐缓冲体系，pH7.4，补充有0.1％BSA，0.5％吐温-20和0.1％Proclin300)。补加等体积甘油充分混匀后，-20℃保存待用。本实施例中重组抗体与NSP-SA-NHS的物质的量比1:20。需将标记后的母液继续稀释4000倍配置为β-淀粉样蛋白标记抗体工作液使用。
抗原溯源参照实施例3的第(3)部分进行。
本实施例中对应上机步骤为：机器自动吸取样本100μL并与100μL磁珠工作液和100μL标记抗体工作液充分混匀，并于37℃孵育25min后进行磁分离。弃掉上清后加入免疫分析仪配套洗液，重复清洗3次。随后将反应被送入暗室，并加入免疫分析仪配套发光激发液A发光激发液B各100μL进行发光反应，并记录发光值。结合已录入并校准后的计算曲线计算得到样本对应浓度值。
对上述两种不同磁珠系统及多个不同包被抗体浓度组合进行交叉组合并检测其线性。每个组合每个抗原浓度进行3次重复并统计平均值。其检测结果如下表12和表13所示：
表12
表13
上述表12和13的结果显示，rAβ40-A和rAβ42-A包被工艺中，优选使用甲苯磺酰活化的磁珠系统。每10mg磁珠对应抗体量为200μg或400μg性能相对更佳。结合原料成本考量，进一步优选每10mg磁珠对应使用200μg重组抗体(重组抗体与磁珠的质量比1:50)。
实施例5标记抗体偶联比优化
抗体的包被参照实施例3的第(1)部分进行。
分别吸取rAβ40-B或rAβ42-B重组抗体0.1mg，0.25mg，0.5mg和0.75mg，与8.25μL4mM NSP-SA-NHS(Heliosense，Cat#HS-11015005，溶于DMF中)溶液充分混合2h。向溶液中补充200μl 5％DL-赖氨酸，继续混和30min。使用Sephadex G-25脱盐，缓冲液TBS-T(0.1M磷酸盐缓冲体系，pH7.4，补充有0.1％BSA，0.5％吐温-20和0.1％Proclin300)。补加等体积甘油充分混匀后，-20℃保存待用。本实施例中重组抗体与NSP-SA-NHS的物质的量比分别为1:50、1:20、1:10、1:6.7。需将标记后的母液继续用缓冲液TBS-T稀释4000倍配置为工作液使用。
抗原溯源参照实施例3的第(3)部分进行。
本实施例中对应上机步骤为：机器自动吸取样本100μL并与100μL磁珠工作液和100μL标记抗体工作液充分混匀，并于37℃孵育25min后进行磁分离。弃掉上清后加入免疫分析仪配套洗液，重复清洗3次。随后将反应被送入暗室，并加入免疫分析仪配套发光激发液A发光激发液B各100μL进行发光反应，并记录发光值。结合已录入并校准后的计算曲线计算得到样本对应浓度值。
对上述标记抗体偶联比和稀释比组合进行交叉组合并检测其线性。每个组合每个抗原浓度进行3次重复并统计平均值。其检测结果如下表14和15所示：
表14
表15
上述表14和15的结果显示，rAβ40-B和rAβ42-B标记工艺中，当提升标记抗体使用量至0.5mg或0.75mg时可以进一步提升试剂盒检测灵敏度。结合原料成本考量，进一步优选标记抗体使用量为0.5mg，即，标记抗体(3.3nmol)与NSP-SA-NHS(33nmol)的物质的量之比为1:10。
实施例6上机检测程序优化
抗体的包被参照实施例3的第(1)部分进行，抗体的标记参照实施例3的第(2)部分进行，抗原溯源参照实施例3的第(3)部分进行。
本实施例中对应上机步骤为：机器自动吸取脑脊液样本50μL、100μL或150μL并与100μL磁珠工作液和100μL标记抗体工作液充分混匀，并于37℃孵育10min、15min、25min和40min后进行磁分离。弃掉上清后加入免疫分析仪配套洗液，重复清洗3次。随后将反应被送入暗室，并加入免疫分析仪配套发光激发液A发光激发液B各100μL进行发光反应，并记录发光值。结合已录入并校准后的计算曲线计算得到样本对应浓度值(pg/mL)。
对上述不同的上机程序分别进行10例G1200平台溯源脑脊液样本检测，分析检测结果与所赋值的偏差。检测结果如下表16～21所示：
表16
表17
表18
上述表16～18的结果显示，满足R2＞0.90的Aβ40上机程序组合为样本量100μL或150μL，反应时间为15min、25min或40min。将Aβ40样本量至少为100μL、反应时间至少为15min作为最终上机程序。
表19
表20
表21
上述表19～21的结果显示，满足R2＞0.90的Aβ42上机程序组合为样本量100μL或150μL，反应时间为15min、25min或40min。将Aβ42样本量至少为100μL、反应时间至少为15min作为优选的上机程序。
实施例7试剂盒性能评估
(1)准确度
分别将溯源后的Aβ40和Aβ42抗原配置成10000pg/mL和800pg/mL溶液，重复检测3次并进行数据分析。Aβ40试剂盒和Aβ42试剂盒检测准确度结果分别如下表22和23所示(浓度单位为pg/mL)。
表22
| 试剂盒批次 | 检测结果1 | 检测结果2 | 检测结果3 | 均值 | 标示值 | 偏差 |
| 20220901 | 10430.91 | 9881.134 | 10376.05 | 10229.36 | 10000 | 2.29％ |
| 20220902 | 10274.38 | 10229.46 | 10140.4 | 10214.74 | 10000 | 2.15％ |
| 20220903 | 9720.783 | 9608.919 | 9573.719 | 9634.474 | 10000 | -3.66％ |
表23
| 试剂盒批次 | 检测结果1 | 检测结果2 | 检测结果3 | 均值 | 标示值 | 偏差 |
| 20220901 | 853.468 | 820.23 | 834.471 | 836.0563 | 800 | 4.51％ |
| 20220902 | 794.085 | 865.992 | 843.758 | 834.6117 | 800 | 4.33％ |
| 20220903 | 821.309 | 824.74 | 837.028 | 827.6923 | 800 | 3.46％ |
综上，测量结果的相对偏差在±10％范围内，且3次结果都符合要求，以上3批试剂盒的准确度合格。
(2)精密度
依据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS/CLSI)文件EP5-A2方案进行，批内精密度和实验室间精密度采用多因素整合的嵌套设计进行实验，不同操作者，不同设备，不同地点，每天上、下午各检测一次，每个样本重复检测2次，连续检测20天，累计每批试剂盒各收集160个数据结果，计算其精密度。同时将溯源后的Aβ40抗原配置成500pg/mL和30000pg/mL溶液，将溯源后的Aβ42抗原配置成100pg/mL和2000pg/mL溶液。重复检测3次并进行数据分析。检测结果如下表24和25所示：
表24
表25
综上，上述两款试剂盒对低、高浓度样本重复进行检测结果显示，其批内精密度CV小于5％，批间精密度CV小于10％，说明上述两款试剂盒符合精密度性能评估要求。
(3)线性范围
分别选择1例补充Aβ40或Aβ42抗原的脑脊液，采用稀释液稀释12个浓度水平，每个稀释后的样本重复测试3次，计算其均值。依据结果逐渐减少浓度点计算相应的线性关系，确定试剂盒的最宽线性范围，Aβ40试剂盒和Aβ42试剂盒检测结果分别如下表26和27所示(浓度单位为pg/mL)。
表26
表27
上述表26和27显示，Aβ40试剂盒在[10～40000]pg/mL的范围内相关系数r不低于0.9900且无离群值。Aβ42试剂盒在[10～3000]pg/mL的范围内相关系数r不低于0.9900且无离群值。因此Aβ40试剂盒线性范围为[10～40000]pg/mL，Aβ42试剂盒线性范围为[10～3000]pg/mL。
(4)灵敏度
用上述试剂盒检测空白样本重复检测20次，进行灵敏度确定。Aβ40试剂盒和Aβ42试剂盒检测结果分别如下表28和29所示(浓度单位为pg/mL)：
表28
| 项目 | 参数 |
| Mean | 741.5 |
| SD | 23.668 |
| Mean+2SD | 788.835 |
| 对应浓度值 | 4.71pg/mL |
Aβ40试剂盒测定的空白样本平均发光值平均值为741.5，将值带入反应曲线，得Aβ40试剂盒灵敏度为4.71pg/mL。
表29
| 项目 | 参数 |
| Mean | 346 |
| SD | 11.399 |
| Mean+2SD | 368.798 |
| 对应浓度值 | 4.38pg/mL |
Aβ42试剂盒测定的空白样本平均发光值平均值为346，将值带入反应曲线，得Aβ42试剂盒灵敏度为4.38pg/mL。
(5)样本检测结果
检测经G1200平台赋值的样本40例以确定试剂盒与该平台产品的一致性。对于超出对标试剂线性范围部分采用稀释上机的方式进行检测。Aβ40一致性分析结果如图1所示(浓度单位为pg/mL)，回归分析数据显示其y＝0.9847x+493.46且R2＝0.9289，证明本产品与商业化产品具有良好一致性。Aβ42一致性分析结果如图2所示(浓度单位为pg/mL)，回归分析数据显示其y＝0.9162x+61.845且R2＝0.9227，证明本产品与商业化产品具有良好一致性。
由上述各实施例可以看出，本申请的试剂盒准确度高、精密度高，灵敏度高，Aβ40试剂盒线性范围为[10～40000]pg/mL，Aβ42试剂盒线性范围为[10～3000]pg/mL，试剂盒的线性范围远宽于现有技术的线性范围，试剂盒的检测上限为现有技术检出上限的两倍以上，同时本申请的试剂盒与商业化产品还具有良好一致性。
以上所述，仅是本申请的较佳实施例而已，并非是对本申请作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本申请技术方案内容，依据本申请的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本申请技术方案的保护范围。
Claims (10)
1.一种靶向β-淀粉样蛋白40的重组抗体，其特征在于，所述重组抗体包含三个重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)和三个轻链互补决定区(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)，其中：
所述CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示；
所述CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示；
所述CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示；
所述CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID No:7所示，
所述CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID No:9所示；
所述CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID No:11所示。
2.根据权利要求1所述的重组抗体，其特征在于，所述重组抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:13所示，或为与SEQ ID No:13具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列；
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:15所示，或为与SEQ ID No:15具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列。
3.一种靶向β-淀粉样蛋白40的重组抗体，其特征在于，所述重组抗体包含三个重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)和三个轻链互补决定区(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)，其中：
所述CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；
所述CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示；
所述CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示；
所述CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID No:8所示；
所述CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID No:10所示；
所述CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID No:12所示。
4. 根据权利要求3所述的重组抗体，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQID No:14所示，或为与SEQ ID No:14具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列；
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:16所示，或为与SEQ ID No:16具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列。
5.一种靶向β-淀粉样蛋白42的重组抗体，其特征在于，所述重组抗体包含三个重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)和三个轻链互补决定区(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)，其中：
所述CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID No:17所示；
所述CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID No:19所示；
所述CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID No:21所示；
所述CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID No:23所示；
所述CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID No:25所示；
所述CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID No:27所示。
6.根据权利要求5所述的重组抗体，其特征在于，
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:29所示，或为与SEQ ID No: 29具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列；
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:31所示，或为与SEQ ID No: 31具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列。
7.一种靶向β-淀粉样蛋白42的重组抗体，其特征在于，所述重组抗体包含三个重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)和三个轻链互补决定区(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)，其中：
所述CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID No:18所示；
所述CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID No:20所示；
所述CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID No:22所示；
所述CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID No:24所示；
所述CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID No:26所示；
所述CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID No:28所示。
8.根据权利要求7所述的重组抗体，其特征在于，
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:30所示，或为与SEQ ID No: 30具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列；
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:32所示，或为与SEQ ID No: 32具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列。
9.一种编码如权利要求1~8中任一项所述的重组抗体的核酸分子。
10.权利要求1~8中任一项所述的重组抗体或者权利要求9所述的核酸分子在制备用于诊断阿尔兹海默症的试剂盒中的用途。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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