CN117624358B - Aβ1-40特异性抗体及其在阿尔茨海默症辅助诊断试剂盒的应用 - Google Patents

Aβ1-40特异性抗体及其在阿尔茨海默症辅助诊断试剂盒的应用 Download PDF

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CN117624358B CN202410111170.0A CN202410111170A CN117624358B CN 117624358 B CN117624358 B CN 117624358B CN 202410111170 A CN202410111170 A CN 202410111170A CN 117624358 B CN117624358 B CN 117624358B
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Abstract

本申请公开了一种Aβ1‑40特异性抗体及其在阿尔茨海默症辅助诊断试剂盒的应用，属于免疫分析技术领域，本申请提供了靶向β淀粉样蛋白1‑40的抗体、检测β淀粉样蛋白1‑40的化学发光试剂盒。本申请的抗体亲和力高、灵敏度高和生产周期明显缩短，更适合作为核心原料应用于体外诊断试剂领域。本申请公开的试剂盒可以用于与Aβ1‑40相关的疾病，例如阿尔茨海默症的辅助诊断。

Description

Aβ1-40特异性抗体及其在阿尔茨海默症辅助诊断试剂盒的 应用
技术领域
本申请属于免疫分析技术领域，涉及一种靶向Aβ1-40的抗体和其制备方法、检测Aβ1-40的试剂盒及其在阿尔茨海默症辅助诊断的应用。
背景技术
阿尔茨海默症(Alzheimer’s Disease，AD)是一种年龄相关的、进行性和不可逆的神经退行性疾病，常发病于老年阶段或老年前期。临床表现为在没有意识障碍的状态下，记忆、思维、分析判断、空间辨认、情绪、日常生活能力进行性减退并有各种神经精神症状和行为障碍。根据认知程度受损的严重程度，分为轻度、中度和重度。轻度AD患者虽然开始忘记熟悉的单词或物体的位置，但生活仍然可以自理；发展到中度，患者变得更健忘，更难以完成日常任务，并经历性格和行为的变化；重度AD患者则不能再对他们的环境做出反应，不能进行交谈，也不能控制运动或控制大便。
研究发现，AD的主要病理表现有脑内细胞外的老年斑(senile plaques)沉积、细胞内的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)以及胆碱功能缺损等，最终造成神经元损伤和坏死并最终导致海绵脑病。其中，由β淀粉样蛋白组成的老年斑以及由磷酸化Tau蛋白（Phosphorylated tau，p-Tau）组成的胞内神经原纤维缠结是AD主要神经病理学特征。目前已经有多种发病机制试图解释这些改变，包括Aβ淀粉样蛋白级联假说、Tau蛋白假说、炎症假说以及其他机制如神经血管受损学说、氧化应激和线粒体功能障碍等。
Aβ是由APP经β-和γ-分泌酶的蛋白水解作用而产生的含有39~43个氨基酸的多肽，主要是Aβ1-40、Aβ1-42、Aβ1-43。它可以由多种细胞产生，循环于血液、脑脊液和脑间质中，大多与伴侣蛋白分子结合，少数以游离状态存在。Aβ淀粉样级联假说认为在大脑中，Aβ的产生和清除之间的失衡是引发阿尔茨海默症的主要原因，Aβ寡聚体会直接抑制海马长期增强并损害突触，最终导致神经递质紊乱和神经功能障碍。
目前Aβ1-40检测主要采用的是酶联免疫、POCT、电化学发光、化学发光等技术平台，抗体制备技术主要存在两个问题。（1）抗体灵敏度不足：抗体灵敏度不足将直接影响检测试剂的灵敏度，同时降低检测的特异性和抗干扰性，并最终影响检测结果的可靠性；（2）单克隆抗体制备工艺不足：单克隆抗体的制备的批间差异会直接影响试剂盒的批间重复性上，因此需要保证重复性可控。
由于血液中β淀粉样蛋白的分子量小且含量及其稀少，上述问题会导致检测试剂盒的灵敏度和准确度。因此，开发一种抗β淀粉样蛋白的抗体及应用迫在眉睫。
发明内容
为了克服现有技术中存在的不足，本申请提供一种抗β淀粉样蛋白1-40（即Aβ1-40）抗体Anti-Aβ1-40-rRmab-1，本申请采用单B细胞技术制备的兔源单克隆抗体灵敏度更高、生产周期明显缩短，利用Anti-Aβ1-40-rRmab-1制备的试剂盒的灵敏度高，检测限低，为与β淀粉样蛋白1-40相关的疾病的辅助诊断提供工具，更进一步地提供该抗体或试剂盒在辅助诊断阿尔茨海默症中的应用。
一方面，本申请提供一种特异性结合Aβ1-40的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段其包含：至少包含一种、两种、三种、四种、五种或六种选自下述的CDR：(a)包含如与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变域CDR-H1；(b)包含如与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变域CDR-H2；(c)包含如与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变域CDR-H3；(d)包含如与SEQID NO：4的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链可变域CDR-L1；(e)包含如与EAS的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链链可变域CDR-L2；和(f)包含如与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链可变域CDR-L3。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含至少一种，至少两种或所有三种选自下述的VH CDR序列：(a)包含如与SEQ ID NO：1氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变域CDR-H1；(b)包含如与SEQ IDNO：2的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变域CDR-H2；和(c)包含如与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变域CDR-H3。在一些实施方案中，该抗体包含(a)如与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变域CDR-H1；(b)包含如与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变域CDR-H2；和(c)如与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变域CDR-H3。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包括至少一种，至少两种或所有三种选自下述的VL CDR序列：(a)包含如与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链链可变域CDR-L1；(b)包含如与EAS的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链链可变域CDR-L2；和(c)包含如与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链链可变域CDR-L3。在一些实施方案中，该抗体包含(a)包含如与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链链可变域CDR-L1；(b)包含如与EAS的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链链可变域CDR-L2；和(c)包含如与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链链可变域CDR-L3。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含(a)包含至少一种，至少两种或所有三种选自下述的VH CDR序列的VH域：(i)包含如与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变域CDR-H1，(ii)包含如与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变域CDR-H2，(iii)包含如与SEQ ID NO：3的氨基酸序列的具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变域CDR-H3；和，(b)包含至少一种，至少两种或所有三种选自下述的VL CDR序列的VL域：(i)包含如与SEQID NO：4的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链可变域CDR-L1，(ii)包含如与EAS的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链可变域CDR-L2，和(c)包含如与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链可变域CDR-L3。在一些实施方案中，本申请抗体或抗原结合片段包含：如SEQ ID NO：1所示的CDR-H1，和如SEQ ID NO：2所示的CDR-H2，和如SEQ ID NO：3所示的CDR-H3，和如SEQ ID NO：4所示的CDR-L1，和如氨基酸序列为EAS的CDR-L2，和如SEQ ID NO：5所示的CDR-L3。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段至少包含一种、两种选自下述的重链可变域：(a)如与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有至少90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或100%序列同一性的重链可变域VH；(b)如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有至少90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或100%序列同一性的轻链可变域VL。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO：6所示的重链可变域VH，和，如SEQ ID NO：7所示的轻链可变域VL。
一方面，本申请提供一种多核苷酸，其编码上述抗体或抗原结合片段。
一方面，本申请提供一种载体，其包含本申请的多核苷酸。
在一些实施方案中，所述载体包括病毒载体、表达载体、重组表达载体。在一些实施方案中，表达载体可以是任何合适的重组表达载体，载体可以选自pUC系列(FermentasLife Sciences，GlenBurnie,Md.)、pBluescript系列(Stratagene，LaJolla，Calif.)、pET系列(Novagen，Madison，Wis.)、pGEX系列(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)和pEX系列(Clontech，Palo Alto，Calif.)。也可以使用噬菌体载体，如λGT10、λGT11、ZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。在一些实施方案中，所述表达载体是pcDNA3.1。
一方面，本申请提供一种宿主细胞，其包含本申请的多核苷酸或载体。
在一些实施方案中，所述宿主细胞为真核细胞、原核细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞为293细胞。
一方面，本申请提供一种检测Aβ1-40的试剂盒。
在一些实施方案中，所述试剂盒包含本申请的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述试剂盒以非诊断目的免疫检测Aβ1-40。在一些实施方案中，所述试剂盒为化学发光法、电化学发光法、ELISA。在一些实施方案中，所述试剂盒是双抗夹心原理的化学发光免疫检测试剂盒，其包括：靶向β淀粉样蛋白1-40的第一抗体包被的磁珠、经化学发光剂标记的靶向β淀粉样蛋白1-40的第二抗体。在一些实施方案中，所述化学发光剂选自吖啶酯、碱性磷酸酶(ALP)、辣根过氧化物酶(HRP)中的至少一种。
在一些实施方案中，所述靶向Aβ1-40的第一抗体和第二抗体组成的抗体对中一个抗体选自如上所述的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述靶向Aβ1-40的第一抗体和第二抗体组成的抗体对中的另一个抗体的重链CDRH1-CDRH3氨基酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：3所示，轻链CDRL1的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示，轻链CDRL2的氨基酸序列为EAS，轻链CDRL3的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。在一些实施方案中，所述靶向Aβ1-40的第一抗体和第二抗体组成的抗体对中的另一个抗体包含如SEQ IDNO：15所示的重链可变区VH和如SEQ ID NO：16所示的轻链可变区VL。
在一些实施方案中，所述第二抗体为本申请所述的抗体或抗原结合片段，所述第一抗体的重链CDRH1-CDRH3氨基酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：3，轻链CDRL1的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示，轻链CDRL2的氨基酸序列为EAS，轻链CDRL3的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。在一些实施方案中，所述第二抗体为本申请所述的抗体或抗原结合片段，所述第一抗体包含如SEQ ID NO：15所示的重链可变区VH和如SEQ ID NO：16所示的轻链可变区VL。
一方面，本申请提供了如上述的抗体或抗原结合片段在制备用于检测Aβ1-40的试剂或试剂盒中的应用。
一方面，本申请提供了如上所述的抗体或抗原结合片段和如上所述的试剂盒在辅助诊断阿尔茨海默的应用。
一方面，本申请提供了一种如上述的抗体或抗原结合片段的制备方法，具体采用单B细胞抗体克隆技术制备，包括以下步骤：
(1)使用β淀粉样蛋白1-40为免疫原免疫兔，免疫结束后收集脾脏并分离脾细胞；
( 2)筛选特异性B淋巴细胞，并提取其总RNA，合成cDNA，再利用PCR获得抗体可变区及恒定区序列；
(3)将扩增的抗体基因插入重组表达载体中，转染293细胞；
(4)收集培养上清并纯化，即得抗体。
进一步地，步骤1)所述β淀粉样蛋白1-40的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
进一步地，步骤2)所述PCR所用的引物序列如SEQ ID NO：9-11所示。
抗体重链编码区基因扩增，正向引物序列为：
caagctggctagcgtttaaacttgccaccagtcgtatgaagctaagagatc(SEQ ID NO：9)。
抗体重链编码区基因扩增，反向引物序列为：
tagtggatccgagctcggtacctcatttacccggagagcg(SEQ ID NO：10)。
抗体轻链编码区基因扩增，正向引物序列为：
caagctggctagcgtttaaacttgccaccagtcgtatgaagctaagagatc(SEQ ID NO：9)。
抗体轻链编码区基因扩增，反向引物序列为：
tagtggatccgagctcggtacctcaacagtcacccctattg(SEQ ID NO：11)。
进一步地，步骤4)所述纯化具体为：上清过proteinA亲和层析柱进行纯化。
一方面，本申请提供了一种特异性结合Aβ1-40的抗体或抗原结合片段的配对筛选方法，具体采用固定重链可变区如SEQ ID NO：15所示和轻链可变区如SEQ ID NO：16所示的抗体Rabbit anti-Aβ1-40 mAb，通过夹心ELISA实验配对筛选抗体或抗原结合片段。
本申请的有益效果
本申请提供了一种新的靶向β淀粉样蛋白1-40的抗体及包含上述的试剂盒，本申请利用单B细胞技术成产的抗体亲和力高、灵敏度高、生产周期明显缩短，更适合作为核心原料应用于体外诊断试剂领域。
附图说明
图1为抗原特异性单B细胞流式细胞仪分选图；
图2为本申请抗β淀粉样蛋白1-40抗体用于化学发光检测定值梯度临床样本，检测结果与临床值的相关曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本公开进行详细的说明，但本公开的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本公开的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本公开的保护范围。
除非另外定义，本文所使用的所有术语具有与本公开所属领域技术人员通常理解的相同的含义。整个公开所引用的所有专利、专利申请和出版物其整体通过引用并入本文。如果本文的术语存在多个定义，以本节中的那些定义为准。
下面结合实施例对本公开提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本公开保护范围的限定。
实施例1：抗Aβ1-40单克隆抗体制备
1.抗原制备
本实施例选择β淀粉样蛋白1-40（Aβ1-40）多肽作为免疫原。在合成Aβ1-40多肽时，在N端添加半胱氨酸C，用于标记载体蛋白KLH。
在合成Aβ1-40多肽时，在N端通过半胱氨酸连接载体蛋白BSA，用于动物免疫血清的效价检测和后续兔源单克隆抗体表达上清的检测。
Aβ1-40合成多肽，序列为：CDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV(SEQID NO：8)。
载体蛋白KLH、BSA均是自研类蛋白，可于市场购买。
载体蛋白KLH标记的Aβ1-40多肽，免疫新西兰大白兔，每只免疫500ug。首次免疫，免疫原与等量的弗式佐剂混合制成乳化剂，皮下多点注射，间隔3周取250ug免疫原与等量的弗式佐剂混合制成乳化剂，皮下多点注射，加强免疫两次。三次免疫后采集PBMC样本，载体蛋白BSA标记的Aβ1-40多肽包板，ELISA方法测定血清效价，取血清效价高的兔子，250ug免疫原于皮下多点注射加强免疫一次后取兔子脾脏。
2.单B细胞悬液制备
兔脾脏样本淋巴细胞的分离与制备，是通过物理研磨兔脾脏，经多孔滤网过滤制备单细胞悬液。单细胞悬液用于细胞染色和流式分选工作。
3.抗原特异性单B细胞分选
抗原特异性单B细胞分选，是基于流式抗体特异性识别淋巴B细胞表面特征性标志物，应用流式细胞分选术完成淋巴细胞悬液中特异性单个B细胞的获取。
本实施例中，分选原偶联FITC染料。
抗兔IgG二抗，是自研类抗体。偶联PE染料。
细胞标记时，加入DAPI染料，以区分死/活细胞（Dead/Live细胞）。
细胞标记方案，淋巴B细胞分选方案：Dead/Live-/IgG+/Antigen+。
细胞标记操作：兔淋巴细胞悬液，300g离心5min，加入5mL buffer液，上下颠倒混匀，300g离心5min。弃上清，重复1次，取30uL细胞悬液进行细胞计数，取40uL细胞悬液，用于空白对照管和待标记的单染管。剩余细胞液作为样本管，300g离心5min，加少量PBS液重悬。空白管不做处理。单染管，补充PBS液至100uL，分别加入2uL PE、2uL FITC、2uL DAPI染料。样本管按照PE染料1.5uL/106细胞，FITC染料2ug/106细胞，计算实际加入量，避光加入相应的抗体，4℃放置30min。抗体孵育结束后，加入2mL buffer液，轻混匀，300g离心5min，重复洗3次。1mL buffer液重悬，细胞过滤后，等待上机分选。
完成荧光补偿调节后，基于活细胞群，圈定PE和FITC双阳性信号细胞群，抗原特异性B细胞分选入96孔板中，每孔仅有1个细胞，分选后孔板需立即低温保存，本实施例实验中备有干冰盒，可短暂放置。孔中装有细胞裂解液，分选的96孔PCR板直接进行单细胞抗体基因的扩增。
4.兔单B细胞cDNA制备
单B细胞cDNA文库制备，是基于SMART 5’RACE技术，所用试剂皆为南京诺唯赞生物科技股份有限公司（Vazyme）N711试剂盒，可于市场购得。实施例中实验所涉及的扩增体系，均可参考N711试剂盒说明书。
单B细胞RNA逆转录：完成分选的96孔板，解冻后置于PCR仪中运行程序，程序结束后冰上静置2min。
单B细胞cDNA单链合成：逆转录反应程序结束后，可加入单链合成体系。待体系加入后，孔板轻混匀，置于PCR仪中运行程序，程序结束后孔板样品冰上静置2min。
单B细胞DNA双链合成：cDNA单链产物的合成反应结束后，可加入双链合成体系。待体系加入后，孔板轻混匀，离心后置于PCR仪中运行程序，程序结束后孔板样品冰上静置。
5.兔单B细胞PCR技术扩增抗体编码基因
单个B细胞cDNA文库，可调取天然配对的抗体重链和轻链编码基因。
编码基因扩增所用试剂，皆为南京诺唯赞生物科技股份有限公司（Vazyme）P515试剂盒，可于市场购得。实施例中实验所涉及的扩增体系，均可参考P515试剂盒说明书。
上游引物包含与启动子CMV基因序列3’端互搭的同源臂，因此抗体编码基因调取后，可直接用于线性表达框的构建。
抗体重链编码基因调取的下游引物位于恒定区位置，包含与BGH-polyA基因序列互搭的同源臂。
轻链编码基因调取的下游引物位于恒定区位置，包含与BGH-polyA基因序列互补的同源臂，因此抗体编码基因调取后，可直接用于线性表达框的构建。
抗体重链编码区基因扩增，正向引物序列为：
caagctggctagcgtttaaacttgccaccagtcgtatgaagctaagagatc（SEQ ID NO：9）。
抗体重链编码区基因扩增，反向引物序列为：
tagtggatccgagctcggtacctcatttacccggagagcg（SEQ ID NO：10）。
抗体轻链编码区基因扩增，正向引物序列为：
caagctggctagcgtttaaacttgccaccagtcgtatgaagctaagagatc（SEQ ID NO：9）。
抗体轻链编码区基因扩增，反向引物序列为：
tagtggatccgagctcggtacctcaacagtcacccctattg（SEQ ID NO：11）。
抗体轻链、重链编码基因调取：按照说明书加入PCR扩增体系，孔板轻混匀，置于PCR仪中运行程序，程序结束后孔板样品冰上静置。
本实施例中，抗体轻链、重链编码基因在同一96孔板的扩增产物配对阳性率在80％以上，借助琼脂糖凝胶电泳检测条带清晰，说明单B细胞流式分选和编码基因扩增实验均是有效的。扩增产物，用于重组表达质粒的构建。
6.抗体重链和轻链重组表达质粒的构建与表达
重组表达载体，选择pcDNA3.1（Invitrogen），在ThermoFisher SCIENTIFIC官网购买。重组构建前，选择HindⅢ限制酶单酶切实现表达载体线性化，限制酶在New EnglandBiolabs官网购买。
载体与编码基因的高效重组，选择无缝克隆试剂盒，在Vazyme官网购买C115#试剂盒。
重组表达质粒的构建：抗体重链和轻链的编码扩增产物与pcDNA3.1线性化载体应用无缝克隆技术实现环化连接，后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布LB固定培养基平板，平板倒置37℃过夜培养。
重组阳性克隆挑选：初筛抗体的重链和轻链，分别挑取8个单菌落，PCR菌检后确定菌落阳性率。
重组质粒的菌检PCR，位于载体的上游引物序列为：caagctggctagcgtttaaactt（SEQ ID NO：12）。
抗体重链菌检PCR下游引物序列为：ctcatttacccggagagcg（SEQ ID NO：13）。
抗体轻链菌检PCR下游引物序列为：acctcaacagtcacccctattg（SEQ ID NO：14）。
重组阳性克隆送测：抗体重链、轻链，分别挑取5个菌检PCR阳性克隆送上海生工生物公司测序。
兔抗体基因序列分析：应用IMGT数据库完成抗体序列V区基因确定，并对抗体重链及轻链CDR1/CDR2/CDR3区等完成抗体序列的分析，导出并确定菌检PCR阳性克隆的正确序列编号。
重组表达质粒的小量表达：正确序列的克隆，菌液中量小提获得抗体轻链、重链质粒。质粒混合后共转染于HEK293哺乳动物细胞。细胞转染10天后，离心收集细胞上清。上清进行抗原特异性评测，等ELISA初筛结果后安排细胞上清纯化。
本实施例中每轮转染100个质粒，即每轮转染可获得100株单克隆抗体。共进行8轮转染实验。
7.重组表达上清抗原特异性评测
抗原包被板制备，筛选原选择β淀粉样蛋白1-40（Aβ1-40）、β-淀粉样蛋白1-42（Aβ1-42）、Aβ1-40截短部分aa25-40（Aβ25-40）、KLH蛋白。其中Aβ1-40、Aβ1-42、Aβ25-40因多肽序列较短，多肽N端添加半胱氨酸，通过SA-Biotin偶联方法完成抗原板包被。
Aβ1-40多肽单克隆抗体的筛选方案，选择与Aβ1-40-biotin+SA、Aβ25-40-biotin+SA反应，且不与KLH、Aβ1-42-biotin+SA反应的抗体，即初步定为Aβ1-40特异性单克隆抗体。
合成多肽Aβ1-42，序列为：CDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA（SEQID NO：19）
合成多肽Aβ25-40，序列为：CGSNKGAIIGLMVGGVV（SEQ ID NO：24）
间接ELISA检测细胞上清，应用自产兔二抗Anti-Rabbit IgG mAb包被，羊抗兔多抗标记HRP检测，反应性OD>1，说明重组质粒在293细胞上正常表达。
间接ELISA检测细胞上清，分别对4种抗原包被板进行反应性评测，得到孔板上清的初筛检测结果（表1为例示性的展示了50株细胞上清的检测数据）。
表1：部分抗体的抗原-抗体的亲和力数据表
间接ELISA检测结果：抗体初筛共转染800株单克隆抗体，与SA+Biotin-Aβ1-40-Ag、SA+Biotin-Aβ25-40-Ag反应，且不与KLH、SA+Biotin-Aβ1-42-Ag反应的抗体，初步筛选出100株单克隆抗体。
初步筛选确定的细胞上清，经proteinA纯化后获得小量单克隆抗体，每株平均1-3mg。
8.重组抗体ELISA配对筛选
β淀粉样蛋白1-40（Aβ1-40）的配对抗体筛选，早期已完成Aβ1-40 N端高敏特异性抗体的筛选工作，因此本实施例选择固定Aβ1-40 N端抗体，针对间接ELISA法初步筛选的100株单克隆抗体开展夹心ELISA实验，筛选出可以特异性识别Aβ1-40 C端的较优单克隆抗体。
Aβ1-40 N端抗体Rabbit Anti-Aβ1-40-mAb-A，重链可变区序列为：
QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGLTISSSYMNWVRQAPGKGLEWIGIIYADDSTSYASWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCAGGGIWGPGTLVTVSS（SEQ ID NO：15）；
CDRH1：GLTISSSY（SEQ ID NO：1）；CDRH2：IYADDST（SEQ ID NO：22）；CDRH3：AGGGI（SEQ ID NO：3）；
轻链可变区序列为：
AQVLTQTASPVSAAVGSTVTINCQASQSVYNNNRLAWYQQKPGQPPKLLIYEASKLASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCQGGYDCSSADCNAFGGGTEVVVK（SEQ ID NO：16）；
CDRL1：QSVYNNNR（SEQ ID NO：23）；CDRL2：EAS；CDRL3：QGGYDCSSADCNA（SEQ ID NO：5）；
临床阳性样本ELISA平台同步检测数据显示，ELISA配对实验可以选择Aβ1-40合成多肽作为筛选原。
初步筛选出100株单克隆抗体，经夹心ELISA实验检测Aβ1-40多肽，最终筛选出配对检测信号值依次排序的前10株，上化学发光平台验证抗体的临床样本检出情况（表2为例示性的展示20对配对抗体的检测结果）。
表2：Aβ1-40多肽配对抗体的检测数据（部分）
9.重组抗体化学发光平台筛选
将步骤8中筛选出的抗体包被在磁珠上，具体操作如下：取2mg磁珠，活化buffer清洗2次，后加入一定量的EDC振荡混匀，磁吸弃上清。沉淀加入1000uL偶联buffer，加入抗体40ug，振荡混匀2h，后加入100uL封闭液，振荡混匀封闭3h。最后加入1000uL TBST清洗磁珠，再加入1000uL保存液。
人工合成一系列不同长度的生物素标记Aβ蛋白肽段作为筛选原，筛选原的具体信息如表3：
表3：化学发光平台筛选重组抗体实验筛选原信息表
将链霉亲和素（SA）标记上吖啶酯，具体操作如下：取100-(100/CSA)uL偶联Buffer至0 .5mL的棕色EP管中，加入(100/CSA)uL SA至0 .5mL的棕色EP管中，使SA标记终浓度在1mg/mL，加入5mM的吖啶酯到0 .5mL的棕色EP管中，漩涡振荡器混合均匀，之后室温(20-25℃)条件下垂直混匀仪反应2h，纯化去除游离的吖啶酯。
按上述方法分别完成包被抗体、标记SA及筛选原的制备，使用全自动化学发光仪，按设定程序对各筛选原进行检测。检测结果与合成多肽2#、3#、6#有反应，且不与合成多肽1#、4#、5#有反应的抗体，即为优选的特异性识别Aβ1-40 C端的单克隆抗体。
经夹心ELISA实验筛选出的10株单克隆抗体，经化学发光平台检测，优选出1株特异性识别Aβ1-40 C端的抗体。表4例示性的展示了4对配对抗体的检测结果。
表4：Aβ1-40特异性抗体化学发光平台检测数据（部分）
筛到的特异性抗体Anti-Aβ1-40-rRmab-1，重链可变区序列为：
QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGLTISSSYMNWVRQAPGKGLEWIGIIYPDHSTSYASWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCAGGGIWGPGTLVTVSS（SEQ ID NO：6）；
轻链可变区序列为：
AQVLTQTASPVSAAVGSTVTINCQASQSVYKNNYLAWYQQKPGQPPKLLIYEASKLASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCQGGYDCSSADCNAFGGGTEVVVK（SEQ ID NO：7）；
表5：抗Aβ1-40抗体的氨基酸序列
实施例2：单克隆抗体在化学发光平台的应用
将优选出的Aβ1-40特异性抗体Anti-Aβ1-40-rRmab-1应用于化学发光检测实验，搭配能够与之配对的抗体，对定值梯度临床样本进行检测，比较检测结果与临床定值间的相关性。
梯度临床样本采用simoa单分子免疫法对样本中的Aβ1-40浓度进行定值，具体浓度如表6：
表6：临床样本Aβ1-40浓度表
将优选出的Aβ1-40特异性抗体Anti-Aβ1-40-rRmab-1和能够与之配对的抗体Rabbit Anti-Aβ1-40-mAb-A组成抗体对，使用全自动化学发光仪对样本P1-P9，以及样本稀释液中Aβ1-40的浓度进行检测，操作如下：
磁珠包被：取2mg磁珠，活化buffer清洗2次，后加入一定量的EDC振荡混匀，磁吸弃上清。沉淀加入1000uL偶联buffer，加入抗体（Rabbit Anti-Aβ1-40-mAb-A）40ug，振荡混匀2h，后加入100uL封闭液，振荡混匀封闭3h。最后加入1000uL TBST清洗磁珠，再加入1000uL保存液。
吖啶酯标记：取100-(100/CAb)uL偶联Buffer至0.5mL的棕色EP管中，加入(100/CAb)uL Ab至0 .5mL的棕色EP管中，使抗体（Anti-Aβ1-40-rRmab-1）标记终浓度在1mg/mL，加入5mM的吖啶酯到0 .5mL的棕色EP管中，漩涡振荡器混合均匀，之后室温(20-25℃)条件下垂直混匀仪反应2h，纯化去除游离的吖啶酯。
设置程序并上机检测，结果如表7：
表7：临床样本化学发光检测结果表
以simoa单分子免疫法检测的Aβ1-40浓度为横轴，化学发光法检测的Aβ1-40浓度为纵轴，绘制各样本Aβ1-40浓度的散点图，并计算两种检测方法间Aβ1-40浓度值的相关系数。
如图2所示，两种检测方法的相关系数R=0.9941，R2值为0.9883，即使用优选出的Aβ1-40特异性抗体Anti-Aβ1-40-rRmab-1，搭配能够与之配对的抗体，应用于化学发光检测实验时，检测结果与simoa单分子免疫法具有较强的相关性，该优选抗体可用于下游试剂盒制备。

Claims (10)

1.一种特异性结合Aβ1-40的抗体或其抗原结合片段，其重链CDRH1-CDRH3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3所示，轻链CDRL1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，轻链CDRL2的氨基酸序列为EAS，轻链CDRL3的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：如SEQ ID NO：6所示的重链可变区VH和如SEQ ID NO：7所示的轻链可变区VL。
3.一种检测β淀粉样蛋白1-40的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括靶向β淀粉样蛋白1-40的第一抗体包被的磁珠和经化学发光剂标记的靶向β淀粉样蛋白1-40的第二抗体；其中，靶向β淀粉样蛋白1-40的第一抗体和第二抗体组成的抗体对中的一个抗体为权利要求1-2任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，所述第一抗体和第二抗体组成的抗体对中的另一个抗体的重链CDRH1-CDRH3氨基酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：3所示，轻链CDRL1的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示，轻链CDRL2的氨基酸序列为EAS，轻链CDRL3的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，所述第一抗体和第二抗体组成的抗体对中的另一个抗体包含：如SEQ ID NO：15所示的重链可变区VH和如SEQ ID NO：16所示的轻链可变区VL。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，所述第二抗体为权利要求1-2任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述第一抗体的重链CDRH1-CDRH3氨基酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：3所示，轻链CDRL1的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示，轻链CDRL2的氨基酸序列为EAS，轻链CDRL3的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，所述第二抗体为权利要求1-2任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述第一抗体包含如SEQ ID NO：15所示的重链可变区VH和如SEQ ID NO：16所示的轻链可变区VL。
8.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，化学发光剂选自吖啶酯、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶中的至少一种。
9.根据权利要求1-2任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备辅助诊断阿尔茨海默症的试剂盒中的应用。
10.一种多核苷酸，其编码权利要求1-2任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
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