CN117645665B - 一种针对α-突触核蛋白的抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种针对α‑突触核蛋白的抗体及其制备方法和应用。该抗体或其抗原结合片段靶向α‑突触核蛋白,其具有以下所示的任意一种氨基酸序列:(I)选自SEQ ID NO.2、4、6任一所示的重链可变区氨基酸序列,和/或选自SEQ ID NO.3、5、7任一所示的轻链可变区氨基酸序列;(II)与(I)所示的氨基酸序列具有至少90%同源性且具有相同功能的氨基酸序列;和(III)(I)所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且具有相同功能的氨基酸序列。本发明的抗体可以检测生物样本中α‑突触核蛋白可溶性寡聚体的含量,进而评估突触核蛋白病的风险。此外,本发明的检测方法具有较好的稳定性和重复性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,特别是涉及一种针对α-突触核蛋白的抗体及其制备方法和应用。
背景技术
α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)是一种由140个氨基酸残基组成的,广泛表达在突触前末梢的可溶性神经元蛋白,在脑内含量丰富,在生理情况下调节神经元细胞膜的稳态、控制突触囊泡运输以及多巴胺的合成调控、维持正常的突触功能。
突触核蛋白疾病是α-突触核蛋白异常聚集的神经退行性疾病,包括帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、路易小体痴呆(Lowy’s body dementia,DLB)和多系统萎缩(multiple system atrophy,MSA)等,大量研究表明,当α-syn的产生和清除之间的平衡受到干扰时,可溶性单体α-syn聚集并错误折叠成低聚物,使得α-syn在体内存在毒性寡聚体形式,毒性寡聚体形式的α-syn是导致突触核蛋白疾病的元凶。
α-syn寡聚体神经毒性机制尚未明确,考虑原因如下。① α-syn正常、错误折叠及其寡聚化之间存在动态平衡,形成路易小体时可避免神经元损害;但这种保护作用短暂,当聚集成寡聚体降低多巴胺神经细胞中线粒体膜电位,导致多巴胺神经元死亡;② α-syn寡聚体病理性聚积可影响突触小泡膜的通透性及其循环,进而影响突触囊泡完整性和胞内多巴胺水平,导致多巴胺神经元死亡;③ 在人中脑神经元胶质细胞培养系统中,细胞外聚集α-syn单体和寡聚体,可激活小胶质细胞,生成大量氧自由基,导致多巴胺神经元死亡;④α-syn过表达可诱导线粒体功能失常,降低蛋白酶体活性,增加线粒体对凋亡刺激的敏感性。目前针对帕金森病患者α-syn寡聚体检测国内外已有较多报道。
脑脊液中异常聚集α-syn可作为突触核蛋白病的诊断方法之一,但腰椎穿刺为有创操作,存在较多禁忌症,限制了其在临床中的应用。后续研究发现,脑脊液中α-syn单体和寡聚体可透过血脑屏障进入外周血;获取外周血样本较脑脊液难度和创伤性均明显降低。
因此,目前亟需一种用于易获得生物样本中检测α-突触核蛋白寡聚体含量的抗体和试剂盒。
发明内容
为解决现有技术中的至少部分问题,本发明提供一种针对α-突触核蛋白的抗体及其制备方法和应用。具体地,本发明包括以下内容。
本发明的第一方面,提供抗体或其抗原结合片段,其靶向α-突触核蛋白,其具有以下所示的任意一种氨基酸序列:
(I) 选自SEQ ID NO.2、4、6任一所示的包含重链CDR1-3的重链可变区氨基酸序列,和/或选自SEQ ID NO.3、5、7任一所示的包含轻链CDR1-3的轻链可变区氨基酸序列;
(II) 与(I)所示的氨基酸序列具有至少90%、95%或99%同源性且具有相同功能的氨基酸序列;和
(III) 与(I)所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的且具有相同功能的氨基酸序列。
在某些实施方案中,根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段,其选自具有以下所示的任意一种序列的抗体或其抗原结合片段:
(1) SEQ ID NO.2所示的重链可变区氨基酸序列和/或SEQ ID NO.3所示的轻链可变区氨基酸序列;
(2) SEQ ID NO.4所示的重链可变区氨基酸序列和/或SEQ ID NO.5所示的轻链可变区氨基酸序列;
(3) SEQ ID NO.6所示的重链可变区氨基酸序列和/或SEQ ID NO.7所示的轻链可变区氨基酸序列。
在某些实施方案中,根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗体包括单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、鼠源抗体和多特异性抗体中的至少一种,所述抗原结合片段包括Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、scFv、scFv Fc片段和单链抗体ScAb中的至少一种。
本发明的第二方面,提供核酸分子,其编码根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段。
本发明的第三方面,提供一种制备本发明所述的抗体或其抗原结合片段的方法,其包括以下步骤:
(1) 使用α-突触核蛋白抗原免疫动物;
(2) 从所述动物分离产生抗体的脾细胞;
(3) 将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合,培养得到杂交瘤细胞;
(4) 克隆所述杂交瘤细胞,筛选得到高亲和力单克隆抗体,和
(5) 纯化所述单克隆抗体。
本发明的第四方面,提供用于对受试者样本中α-突触核蛋白寡聚体进行检测或定量的试剂盒,其包含根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中,根据本发明所述的试剂盒,其中,所述样本为流体样本,还优选血液样本。
在某些实施方案中,根据本发明所述的试剂盒,其中,所述试剂盒包括ELISA检测试剂盒、板式化学发光检测试剂盒、全自动化学发光检测试剂盒、放射免疫分析试剂盒、荧光免疫试剂盒、化学发光免疫分析试剂盒、免疫印迹试剂盒、免疫共沉淀试剂盒、流式细胞检测试剂盒、胶体金法检测试剂盒、生物发光免疫试剂盒、免疫层析检测试剂盒、电泳分析试剂盒、基于乳胶法的试剂盒、和基于直接竞争法或间接竞争法的试剂盒中的至少一种。
在某些实施方案中,根据本发明所述的试剂盒,其进一步包括处理所述样本中红细胞的稀释液,所述稀释液包括磷酸盐缓冲液、DTT、脱氧胆酸钠、NP-40和EDTA。
在某些实施方案中,根据本发明所述的试剂盒,其包括捕获抗体和检测抗体,所述捕获抗体和所述检测抗体分别选自本发明所示(I)-(III)中的任意一种抗体或其抗原结合片段。
本发明的第五方面,提供试剂在用于制备检测或定量来自受试者的生物样本中α-突触核蛋白寡聚体的试剂盒或诊断剂中的用途,其中,所述试剂包括根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供一种检测或定量来自受试者的生物样本中α-突触核蛋白寡聚体的方法。
在某些实施方案中,根据本发明所述的方法,其中,所述检测或定量包括:
a. 获取受试者外周血样本;
b. 在所述样本中分离用于检测的红细胞;
c. 处理所述红细胞,使处理后的红细胞与根据本发明所述的抗体或抗原结合片段接触的步骤;和
d. 检测所述抗体或其抗原结合片段与来自所述生物样本中α-突触核蛋白寡聚体的结合或对α-突触核蛋白寡聚体进行定量的步骤。
在某些实施方案中,根据本发明所述的方法,其中,将所述外周血样本进行离心后,得到红细胞;
在某些实施方案中,根据本发明所述的方法,其中,所述处理包括使用本发明所述的稀释液稀释并裂解所述红细胞,经离心得到上清液。
本发明的抗体可以检测生物样本中α-突触核蛋白可溶性寡聚体的含量,进而评估突触核蛋白病的风险。此外,本发明的检测方法具有较好的稳定性和重复性。
附图说明
图1示出了α-突触核蛋白可溶性寡聚体原核表达载体SNCA-pET28a质粒图谱。
图2示出了α-突触核蛋白可溶性寡聚体原核表达产物Ni-NTA金属螯合层析纯化SDS-PAGE鉴定。
图3示出了α-突触核蛋白寡聚体含量测定试剂盒(磁微粒化学发光法)性能。
图4示出了α-突触核蛋白寡聚体配对1抗体的线性数据。
图5示出了α-突触核蛋白寡聚体配对2抗体的线性数据。
图6示出了α-突触核蛋白寡聚体配对3抗体的线性数据。
图7示出了α-突触核蛋白寡聚体配对4抗体的线性数据。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
抗体或抗原结合片段
本发明的一个方面,提供抗体或其抗原结合片段,本文有时也称为“抗α-突触核蛋白抗体”,其用于结合至抗原(α-突触核蛋白或α-突触核蛋白寡聚体)。本文中,“α-突触核蛋白寡聚体”是指由于α-突触核蛋白的构象变化而形成的包括寡聚物、初原纤维、原纤维和/或包括选自这些结构中的至少一种的结构或聚集体。
本文中,术语“抗体”是指免疫球蛋白分子,其具有特异性结合特定抗原的能力。抗体通常在每条重链和轻链中包含可变区和恒定区。抗体重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合。因此,大多数抗体具有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),它们共同形成与抗原结合的抗体部分。
“轻链可变区(VL)”或“重链可变区(VH)”由间插三个“互补决定区(CDR)”的“框架”区组成。框架区用于调整CDR,以用于特异性结合抗原表位。CDR包含抗体中主要负责抗原结合的氨基酸残基。从氨基末端到羧基末端,VL和VH结构域都包含以下框架(FR)区和CDR区:FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3和FR4。
本文中,术语“序列同一性”与“同源性”可互换使用。同源序列包括与本发明序列是至少80%、85%、90%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%相同的氨基酸序列。为了确定序列同一性,可进行序列比对,其可通过本领域技术人员了解的各种方式进行,例如,使用BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLE或Megalign(DNASTAR)软件等。本领域技术人员能够确定用于比对的适当参数,包括在所比较的全长序列中实现最优比对所需要的任何算法。
本发明提供的氨基酸序列修饰的抗体中,优选地,修饰发生在可变区以外的区域,例如发生在抗体的框架区或恒定区,且经过修饰的抗体保留本发明抗体或其抗原结合片段的期望的功能特性,或具有改进的与抗原结合的特性。本发明的抗体可包括糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割或非天然发生的氨基酸修饰等。
本文中,术语“取代”是指由不同的氨基酸替换一个或多个氨基酸。“缺失”是指在氨基酸序列中一个或多个氨基酸的减少。“添加”是指在氨基酸序列中的改变导致与天然存在的分子相比,一个或多个氨基酸的增加。
本发明中,所述抗体包括单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、鼠源抗体和多特异性抗体中的至少一种。
本文所用术语“单克隆抗体”,有时也称为“单抗”或mAb,其是指从一纯系细胞得到的免疫球蛋白,具有相同的结构和化学特性,对单一抗原决定簇有特异性。单克隆抗体与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同,各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外,单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤或重组工程细胞培养获得,不会混杂有其它免疫球蛋白。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性,是从均一的抗体群中获得的,但这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本文中,术语“嵌合抗体”通常是指这样的抗体,其中每个重链或轻链氨基酸序列的一部分与来自特定物种的抗体中相应氨基酸序列同源,或者属于特定的类别,而该链的其余区段则与另一物种中的相应序列同源。例如,轻链和重链的可变区均来自一个动物物种(如小鼠、大鼠等)的抗体的可变区,而恒定部分则与来自另一物种(如人)的抗体序列同源。例如,为获得嵌合抗体,可利用非人源的B细胞或杂交瘤细胞产生可变区,而与其组合的恒定区则来自人。所述可变区具有易于制备的优点,并且其特异性不受与其组合的恒定区的来源的影响。同时,由于嵌合抗体的恒定区可来源于人类,因此嵌合在注射时抗体引发免疫应答的可能性会低于使用恒定区为非人来源的抗体。
本文中,术语“人源化抗体”通常是指一种嵌合抗体,其含有较少的来自非人免疫球蛋白的序列,从而降低异种抗体引入到人类中时的免疫原性,同时保持抗体的完全抗原结合亲和力和特异性。因此,本文提供的抗体可以是人源化抗体或人抗体,并且可以是各种同种型(例如,IgA、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE或IgD),特别是IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型,例如IgG1型或IgG2型。
本文中,术语“鼠源抗体”通常是指可变区框架和CDR区得自小鼠种系免疫球蛋白序列的抗体。此外,如果抗体包含恒定区,其也得自小鼠种系免疫球蛋白序列。本发明中,鼠源抗体可以包含不由小鼠种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基,例如可以包括通过体外随机突变或点突变或通过体内体细胞突变而导入的突变。
本发明中,所述多特异性抗体为双特异性抗体、三特异性抗体或四特异性抗体。
本文中,术语“抗原结合片段”通常是指抗体中发挥特异性结合抗原功能的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能可通过抗体的全长片段来实现。抗体的抗原结合功能也可通过以下来实现:包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab’或F(ab’)2的片段的重链,或者,包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab’或F(ab’)2的片段的轻链。
本发明中,术语“结合”、“特异性结合”、“靶向”、“针对”和“免疫结合”可互换使用,是指发生在免疫球蛋白分子与对所述免疫球蛋白特异的抗原之间的非共价相互作用。除非另有说明,在用于本文时,“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用结合解离平衡常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量,包括现有技术已知以及本文中所描述的那些。
除非另有说明,否则本文所述抗体或其抗原结合片段为分离的抗体或其抗原结合片段。其中所用术语“分离的”是指已经从它的天然环境提取出的核酸或抗体。已经“分离的”核酸、肽和蛋白因而包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白。该术语也包括通过在宿主细胞中的重组表达而制备的核酸、肽和蛋白以及化学合成的核酸和/或多肽。
核酸分子
本发明的一个方面,还提供一种核酸分子,其编码根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段。
本发明所用术语“核酸”旨在包括任何长度的核苷酸的聚合形式,其含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物,其包括DNA、RNA和DNA/RNA杂合物,其还包括DNA或RNA类似物,诸如含有修饰的骨架(例如肽核酸(PNA)或硫代磷酸酯)或修饰的碱基的那些。因此,本发明的核酸包括DNA、cDNA、mRNA、重组核酸等。
一旦分离获得了本发明所述抗体的编码序列,就可以采用重组技术来大批量地获得该抗体。示例性的方法是将其编码基因克隆至载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到。
制备方法
本发明的一个方面,提供一种制备本发明所述的抗体或其抗原结合片段的方法,本领域技术人员可以通过已知的技术,例如通过基于杂交瘤的方法进行制备。目前已经记载了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系(例如,参见Kozbor,D.,J.Immunol.133(1984)3001-3005;Brodeur,B.R.等,Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications(单克隆抗体制备技术和应用),Marcel Dekker,Inc.,NewYork(1987),第51-63页;和Boerner,P.等,J.Immunol.147(1991)86-95)。通过人B细胞杂交瘤产生的人抗体也记载在Li,J.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103(2006)3557-3562中。另外的方法包括人杂交瘤技术(三源杂交瘤技术),例如记载于Vollmers,H.P.和Brandlein,S.,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology(实验和临床药理学中的方法和发现)27(2005)185-191中。
此外,抗体也可以通过分离选自人源噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列而产生,然后,可以将所述可变结构域序列与合适的人恒定结构域组合。
在一些实施方案中,本发明的制备方法包括以下步骤:
(1) 使用α-突触核蛋白抗原免疫动物;
(2) 从所述动物分离产生抗体的脾细胞;
(3) 将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合,培养得到杂交瘤细胞;
(4) 克隆所述杂交瘤细胞,筛选得到高亲和力单克隆抗体,和
(5) 纯化所述单克隆抗体。
本发明中,步骤(3)使用的骨髓瘤细胞和/或杂交瘤细胞可以通过已知方法制备或者通过市售产品购买获得。在一个优选的实施方案中,骨髓瘤细胞为骨髓瘤细胞SP2/0。
试剂盒
本发明的一个方面,提供用于对受试者样本中α-突触核蛋白寡聚体进行检测或定量的试剂盒,其包含本发明所述的抗体或其抗原结合片段。
本发明中,所述试剂盒包括ELISA检测试剂盒、板式化学发光检测试剂盒、全自动化学发光检测试剂盒、放射免疫分析试剂盒、荧光免疫试剂盒、化学发光免疫分析试剂盒、免疫印迹试剂盒、免疫共沉淀试剂盒、流式细胞检测试剂盒、胶体金法检测试剂盒、生物发光免疫试剂盒、免疫层析检测试剂盒、电泳分析试剂盒、基于乳胶法的试剂盒、和基于直接竞争法或间接竞争法的试剂盒中的至少一种。
在一个优选的实施方案中,所述试剂盒包括处理所述样本中红细胞的稀释液,所述稀释液包括磷酸盐缓冲液、DTT、脱氧胆酸钠、NP-40和EDTA。
在一个更优选的实施方案中,所述稀释液包括pH为6.5-8.5的磷酸盐缓冲液、0-0.1%DTT、0-1%脱氧胆酸钠、0-1%NP-40和0-0.1%EDTA。其中,稀释液中各成分的浓度为体积浓度;磷酸盐缓冲液的pH优选为6.6-8.4,还优选6.7-8.3,进一步优选6.8-8.2,更优选6.9-8.1,更优选7.0-8.0,例如7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0;DTT优选为0-0.09%,还优选0.01-0.08%,例如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08%的DTT;脱氧胆酸钠优选为0-0.9%,还优选0.1-0.8%,例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8%的脱氧胆酸钠;NP-40优选为0-0.9%,还优选0.11-0.8%,例如0.11、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8%的NP-40;EDTA优选为0-0.09%,还优选0.01-0.08%,进一步优选0.02-0.07%,例如0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07%的EDTA。
在一个优选的实施方案中,所述试剂盒包括捕获抗体和检测抗体。所述捕获抗体和所述检测抗体的序列分别选自本发明所示(I)-(III)中任意一种抗体或其抗原结合片段。
在一个优选的实施方案中,本发明的试剂盒包括以下捕获抗体和检测抗体组合:
(1)捕获抗体:具有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的抗体,检测抗体:具有SEQID NO.6和SEQ ID NO.7所示的抗体;或者
(2)捕获抗体:具有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的抗体,检测抗体:具有SEQID NO.6和SEQ ID NO.7所示的抗体;或者
(3)捕获抗体:具有SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的抗体,检测抗体:具有SEQID NO.2和SEQ ID NO.3所示的抗体;或者
(4)捕获抗体:具有SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的抗体,检测抗体:具有SEQID NO.4和SEQ ID NO.5所示的抗体;
其中,具有SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的抗体用于结合α-突触核蛋白寡聚体,具有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的抗体,以及具有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的抗体用于结合α-突触核蛋白单体。
本文中,术语“试剂盒”是指试剂和其他材料的组合。试剂盒预期可包含试剂,诸如缓冲剂、蛋白稳定试剂、信号产生体系(例如,荧光信号生成体系)、抗体、对照蛋白、以及测试容器(例如,微量滴定板等)。术语“试剂盒”不限于试剂和/或其他材料的特定组合,例如,试剂盒还可以包含使用试剂的说明。试剂盒可以任何合适的方式包装,通常,其具有处于单个容器或(必要时)处于多个容器的成分以及用于进行检测说明的说明书。试剂盒可以通过本领域中已知的多种方法来制备。
在某些实施方案中,所述试剂盒还包括清洗液、底物液、稀释液和定标液中的至少一种。其中,清洗液的成分不特别限定,其实例包括但不限于缓冲液、表面活性剂、防腐剂。底物液可以使用已知底物,其实例包括但不限于显色底物、荧光底物、发光底物等。稀释液的成分不特别限定,其实例包括但不限于缓冲液、表面活性剂等。定标液的成分不特别限定,其实例包括但不限于BSA溶液、海藻糖溶液、动物血清等。
本文中,“捕获抗体”和“包被抗体”可互换使用,“检测抗体”和“标记抗体”可互换使用。本发明的检测抗体可以结合有可检测标记物,术语“可检测标记物”在本文中意指产生可检测信号的化合物。可检测标记物可以是MRI造影剂、闪烁扫描造影剂、X射线成像造影剂、超声造影剂、光学成像造影剂。可检测标记物的实例包括但不限于放射性元素,荧光团如荧光素、Alexa或花青;化学发光化合物,如鲁米诺;生物发光化合物,如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶等;和造影剂,如纳米颗粒或钆。合适的可检测标记物的选择取决于所用的检测系统,在本领域技术人员的能力范围内。例如,当检测系统是MRI时,可检测标记物优选是氧化铁纳米颗粒或钆;当检测系统是荧光成像时,可检测标记物优选为荧光素,Alexa或花青;当检测系统为化学发光成像时,可检测标记优选为鲁米诺;当检测系统是生物发光成像时,可检测标记物优选为荧光素酶或碱性磷酸酶;当检测系统是核成像时,可检测标记物优选是放射性元素。
本发明中,试剂盒可以以瓶装、卡式、条式等方式提供,优选以卡式或条式提供。
检测方法及用途
本发明的一个方面,提供一种检测或定量来自受试者的生物样本中α-突触核蛋白寡聚体的方法,所述方法可用于非疾病的诊断和治疗的目的。本发明还提供试剂在用于制备检测或定量来自受试者的生物样本中α-突触核蛋白寡聚体的试剂盒或诊断剂中的用途,从而用于α-突触核蛋白相关疾病的检测,其中,所述试剂包括根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段。
本发明中,所述检测或定量包括以下步骤:
a. 获取受试者外周血样本;
b. 在所述样本中分离用于检测的红细胞;
c. 处理所述红细胞,使处理后的红细胞与根据本发明所述的抗体或抗原结合片段接触的步骤;和
d. 检测所述抗体或其抗原结合片段与来自所述生物样本中α-突触核蛋白寡聚体的结合或对α-突触核蛋白寡聚体进行定量的步骤。
在一个优选的实施方案中,将所述外周血样本在转速1000-5000rpm下进行离心5-30min后,得到红细胞,其中,转速优选1500-4500rpm,还优选2000-4000rpm,例如2000、2200、2400、2600、2800、3000、3200、3400、3600、3800、4000rpm,离心时间优选5-25min,还优选5-20min,更优选5-15min,例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15min。
在一个优选的实施方案中,所述处理包括使用本发明所述的稀释液稀释并裂解所述红细胞,在转速5000-30000rpm下进行离心1-20min得到上清液,其中转速优选5000-25000rpm,还优选5000-20000rpm,更优选8000-15000rpm,例如8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000rpm,离心时间优选1-15min,还优选1-10min,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10min。
本发明中,术语“α-突触核蛋白相关疾病”包括所有以病理性突触核蛋白聚集体为特征的神经退行性疾病。神经退行性疾病可包括但不限于帕金森氏病(Parkinson’sdisease,PD)、路易小体痴呆(Lowy’s body dementia,DLB)、阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease)、唐氏综合症(Down’s syndrome)、多系统萎缩(multiple system atrophy,MSA)、精神病、精神分裂症或克雅二氏症(Creutzfeldt-Jakob disease)。
本发明中的检测或定量方法包括以下中的至少一种:ELISA、放射免疫测定、荧光免疫测定、化学发光免疫测定、生物发光免疫测定、免疫印迹、免疫沉淀试验、流式细胞分析、免疫层析法、电泳法、胶体金法、乳胶法、直接竞争法和间接竞争法,以确定受试者中的α-突触核蛋白水平或量。
本发明中,“受试者”包括脊椎动物,诸如哺乳动物,例如人或兽医哺乳动物。在一些实施方案中,所述受试者是人。
本发明中,“样本”是指从受试者分离的生物样本,并且可以包括但不限于全血、血清、血浆、血细胞、内皮细胞、组织活检组织(例如脑组织)、淋巴液、腹水、间质液、骨髓、脑脊液、唾液、粘液、痰液、汗液、尿液或任何其他分泌物、排泄物或其他体液。“血液样本”是指全血或其任何部分,包括血细胞、血清和血浆。在一个优选的实施方案中,所述样本包含红细胞。
当确定α-突触核蛋白寡聚体的相对水平时,可以确定至少两个样本之间(例如,来自同一受试者的不同时间点的样本之间、来自同一受试者的不同组织的样本之间和/或来自不同受试者的样本之间)的α-突触核蛋白寡聚体水平。替代性地,当诸如通过ELISA测定来确定α-突触核蛋白寡聚体的绝对水平时,可以通过在测试样本之前为ELISA测定建立标准来确定样本中α-突触核蛋白寡聚体的绝对水平。本领域技术人员将理解利用哪种分析技术来使用本发明的抗体或其抗原结合片段确定来自受试者的样本中的α-突触核蛋白寡聚体水平。
利用确定来自受试者的样本中的α-突触核蛋白寡聚体水平的方法可以诊断疾病中的异常(升高、降低或不足)α-突触核蛋白寡聚体水平并做出适当的治疗决策。另外,通过监测受试者中的α-突触核蛋白寡聚体水平,可以基于对特定疾病中和/或特定疾病进展中的α-突触核蛋白寡聚体水平来确定发生上述疾病的风险。
实施例
1. 抗原的制备
为了制备针对α-突触核蛋白可溶性寡聚体高亲和力的抗体,本发明使用基因重组技术,将人α-突触核蛋白基因重复一次,并在两段相同的基因中间插入柔性肽作为连接子,再将整合过的重复α-突触核蛋白基因片段使用无缝克隆方法克隆至NcoI/XhoI双酶切的pET28a载体中(如图1所示),构建成功后,筛选阳性克隆进行测序,表达质粒序列如SEQ IDNO.1所示。
将测序正确的质粒转化至Rosetta(DE3)大肠杆菌表达菌株中,挑取单菌斑放于10ml LB培养基中过夜培养。1:100接种于1L LB+Kan培养基中,培养至OD600≈0.6时,加入0.5mM IPTG,220rpm、20℃培养过夜后收集菌体,将发酵产物加入250ml 50mM Tris-HCl(pH8.0)+500mM NaCl重悬完全,放置冰上预冷10min后超声裂解,超声力度300w,超声1s,间隔1s,总超声时间30min。经鉴定,α-突触核蛋白在原核表达中为可溶形式表达。
将菌体破碎后的上清分离,使用0.45μm孔径的滤膜过滤除去细胞碎片,然后上柱Ni-NTA金属螯合层析柱,上样结束后使用50mM Tris-HCl (pH8.0)+500mMNaCl+20mM咪唑冲洗,然后使用50mM Tris-HCl (pH8.0)+500mMNaCl+250mM咪唑洗脱目的蛋白,各个组分取样后进行SDS-PAGE分析,经鉴定,纯化后的重组α-突触核蛋白纯度约为90%(如图2所示)。
将纯化后的重组α-突触核蛋白使用50mM Tris-HCl (pH8.0)+100mM NaCl缓冲液透析,去除咪唑后-20℃保存。
2. 抗体的制备
2.1 小鼠免疫
选用纯种BALB/C小鼠,初次免疫50μg α-突触核蛋白抗原,加入福氏完全佐剂并且注射器互推法乳化后,皮下多点注射,具体流程如下。
3周后,第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下注射。
3周后,第三次免疫剂量同上,不加佐剂,腹腔注射,5-7天后采血测其效价(如下表1所示)。
表1:α-突触核重组蛋白小鼠免疫血清效价检测
2-3周后,加强免疫,剂量100μg α-突触核蛋白抗原,腹腔注射。
3天后,取脾融合。
2.2 杂交瘤细胞融合
将骨髓瘤细胞SP2/0与脾细胞按1:10的比例混合在一起,在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次,离心,1200rpm,8min;弃上清,用吸管吸净残留液体。轻轻弹击离心管底,使细胞沉淀略松动。90s内加入37℃预温的1ml 45%PEG(分子量3250)溶液,边加边轻微摇动。37℃水浴作用90s。
加37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用,每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。离心,800rpm,6min。补充上清,用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬。
将上述细胞,加到已有饲养细胞层的96孔板内,每孔加100μl。将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。
2.3 杂交瘤细胞的克隆和筛选
使用有限稀释法单克隆化杂交瘤细胞,检测每个克隆的细胞上清与α-突触核蛋白重组抗原的反应活性,将阳性孔的细胞转移至24孔板中扩大培养,取细胞上清进行克隆板抗体效价检测,筛选高亲和力抗体。
2.4 腹水单克隆抗体的制备
腹腔注射0.5ml液体石蜡于BALB/C鼠,1-2周后腹腔注射1×106个阳性杂交瘤细胞,接种细胞7-10天后收集腹水并使用ProteinA亲和层析柱纯化得到抗体。
将重组α-突触核蛋白包被在96孔酶标板上,使用BSA进行封闭,然后加入纯化后的单克隆抗体,再加入羊抗鼠-HRP标记二抗,使用TMB显色液显色10min,加入终止液终止,酶标仪读取数据(如表2所示)。
表2:α-突触核蛋白单克隆抗体活性检测
经筛选和验证,克隆号为78#、128#、167#三株抗体活性较高,提取这三株抗体的杂交瘤细胞mRNA,反转录为cDNA,连接入TOPO载体进行抗体序列测序。
78#抗体重链和轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示;
128#抗体抗体重链和轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示;
#167抗体抗体重链和轻链可变区氨基酸如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
78#、128#、167#三株抗体分别作为捕获抗体和检测抗体时的精密度数据如下表3所示,其中,配对1中捕获抗体和检测抗体分别为78#和167#抗体,配对2中捕获抗体和检测抗体分别为128#和167#抗体,配对3中捕获抗体和检测抗体分别为167#和78#抗体,配对4中捕获抗体和检测抗体分别为167#和128#抗体。
表3 α-突触核重组蛋白配对1-4精密度数据
3. 试剂盒检测原理
本发明涉及一种检测血液中α-突触核蛋白可溶性寡聚体含量的方法,利用抗人可溶性α-突触核蛋白寡聚体单克隆抗体作为捕获抗体,利用抗人α-突触核蛋白寡聚体单克隆抗体作为检测抗体,检测α-突触核蛋白寡聚体浓度。
4. 试剂盒组分:
本发明用于检测α-突触核蛋白寡聚体含量的试剂盒包括:包被抗体78#、标记抗体128#、清洗液、底物液、样本稀释液、定标液1、定标液2和定标稀释液。
5. 组分工艺
① 定标液1和定标液2的成分包括但不限于1-5%BSA溶液、1-5%的海藻糖溶液、10-50%动物血清。
② 包被磁珠包括超顺磁颗粒和/或表面覆盖有选自硅化物、多聚糖、蛋白质和纤维素中的至少之一的高分子成分的磁性颗粒。包被工艺包括但不限于EDC、NHS偶联工艺。
③ 样本稀释液包括但不限于pH值6.5-8.5的缓冲液,表面活性剂。
④ 标记工艺包括但不限于高碘酸钠标记法、马来酰亚胺标记法。抗体标记酶包括但不限于碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶等公知酶类。
⑤ 清洗液包括但不限于pH值6.5-8.5的缓冲液、表面活性剂、防腐剂等。
⑥ 底物液包括但不限于显色底物、荧光底物、发光底物等公知底物,所述底物液优选发光底物,如:3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐溶液。
⑦ 试剂条:试剂盒包括瓶装、卡式、条式等,优选以卡式或条式。
⑧ 适用仪器:适用仪器包括半自动或全自动免疫分析仪,样本测定时间为30分钟以下。
6. 红细胞预处理流程:
使用抗凝剂管抽取静脉全血,静置后,按照2000-4000RPM离心10min,去除上层血清及中间层,留下层红细胞做稀释实验。抗凝管包括市面上所有抗凝管。以上稀释可以手工进行也可以仪器自动进行。
样本稀释流程:使用样本稀释液将红细胞稀释10倍或20倍,使用涡旋混匀仪混匀裂解,裂解后12000RPM离心5min,上机测试上清液。其中,样本稀释液包括pH为6.5-8.5的磷酸盐缓冲液、0-0.1%DTT、0-1%脱氧胆酸钠、0-1%NP-40和0-0.1%EDTA。
7. 试剂性能:
试剂盒分别取三批进行精密度实验。抽取的试剂盒测定三份高、中、低值样本各10次。计算测定浓度的变异系数结果表明变异系数小于8.0%,试剂盒性能如图3所示。另外,图4示出了α-突触核蛋白寡聚体配对1抗体的线性数据。图5示出了α-突触核蛋白寡聚体配对2抗体的线性数据。图6示出了α-突触核蛋白寡聚体配对3抗体的线性数据。图7示出了α-突触核蛋白寡聚体配对4抗体的线性数据。
最后需要说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应对理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或对其中部分技术特征进行等同替换。而这些修改或替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (13)
1.抗体或其抗原结合片段,其特征在于,其靶向α-突触核蛋白,其序列为以下所示的任意一种:
(1) 包含SEQ ID NO.2所示的包含重链CDR1-3的重链可变区氨基酸序列和SEQ IDNO.3所示的包含轻链CDR1-3的轻链可变区氨基酸序列;
(2) 包含SEQ ID NO.4所示的包含重链CDR1-3的重链可变区氨基酸序列和SEQ IDNO.5所示的包含轻链CDR1-3的轻链可变区氨基酸序列;
(3) 包含SEQ ID NO.6所示的包含重链CDR1-3的重链可变区氨基酸序列和SEQ IDNO.7所示的包含轻链CDR1-3的轻链可变区氨基酸序列。
2. 根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体包括单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和鼠源抗体中的至少一种,所述抗原结合片段包括Fab、Fab’、scFv、scFv Fc片段和单链抗体ScAb中的至少一种。
3.核酸分子,其特征在于,其编码根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段。
4.用于对受试者样本中α-突触核蛋白寡聚体进行检测或定量的试剂盒,其特征在于,其包含根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述样本为流体样本。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述流体样本为血液样本。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括ELISA检测试剂盒、板式化学发光检测试剂盒、全自动化学发光检测试剂盒、放射免疫分析试剂盒、荧光免疫试剂盒、化学发光免疫分析试剂盒、免疫印迹试剂盒、免疫共沉淀试剂盒、流式细胞检测试剂盒、胶体金法检测试剂盒、生物发光免疫试剂盒、免疫层析检测试剂盒、电泳分析试剂盒、基于乳胶法的试剂盒、和基于直接竞争法或间接竞争法的试剂盒中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,其进一步包括处理所述样本中红细胞的稀释液,所述稀释液包括磷酸盐缓冲液、DTT、脱氧胆酸钠、NP-40和EDTA。
9.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,其包括捕获抗体和检测抗体,所述捕获抗体和所述检测抗体分别选自权利要求1所示任意一种抗体或其抗原结合片段。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒用于α-突触核蛋白相关疾病的诊断。
11.试剂在制备用于检测或定量来自受试者的生物样本中α-突触核蛋白寡聚体的试剂盒中的应用,其特征在于,所述试剂包括稀释液和权利要求1或2所述的抗体或抗原结合片段,所述稀释液包括磷酸盐缓冲液、DTT、脱氧胆酸钠、NP-40和EDTA,所述检测或定量包括:
a. 获取受试者外周血样本;
b. 在所述样本中分离用于检测的红细胞;
c. 处理所述红细胞,使处理后的红细胞与根据权利要求1或2所述的抗体或抗原结合片段接触的步骤;和
d. 检测所述抗体或其抗原结合片段与来自所述生物样本中α-突触核蛋白寡聚体的结合或对α-突触核蛋白寡聚体进行定量的步骤。
12.根据权利要求11所述的应用,其特征在于,将所述外周血样本进行离心后,得到红细胞。
13.根据权利要求12所述的应用,其特征在于,所述处理包括使用所述的稀释液稀释并裂解所述红细胞,经离心得到上清液。
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