CN112014577A - 一种提高gpc3检测灵敏度的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒及其制备方法，属于免疫检测技术领域，包括试剂M和试剂R，所述试剂M通过磁珠微粒偶联鼠抗人GPC3单克隆抗体稀释后制得，磁珠微粒直径为0.8μm～3μm；所述磁珠微粒偶联鼠抗人GPC3单克隆抗体的稀释液成分包括：Proclin300、缓冲液、表面活性剂和蛋白；所述试剂R通过碱性磷酸酶标记兔抗人GPC3多克隆抗体稀释后制得。该试剂盒具有更高的GPC3检测灵敏度，同时具有更宽的线性范围。本发明还提供了一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒的制备方法。

Description

一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，涉及一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒及其制备方法。
背景技术
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3/Glypican-3(GPC3)是Glypican家族中的一员，属于膜性硫酸乙酰肝素多糖蛋白。在哺乳动物的胚胎期，GPC3通过影响多个分子信号通路而对组织器官的发育起到重要的调控作用，其功能缺失将导致过度生长和畸变综合征(SGBS)。成人GPC3的异常表达与多种肿瘤的发生发展关系密切。GPC3在肝细胞癌(HCC)中表达上调，与HCC的生物学特性相关，在肝癌的早期诊断、生物治疗和预后评估中具有良好的应用前景。
GP03作为一个有价值的诊断肝癌的标志物已经得到了证实，并已被《原发性肝癌规范化病理诊断指南(2015)》、《原发性肝癌规范化病理诊断方案专家共识》、《原发性肝癌诊疗规范(2019年版)》、《EASL-EORTC Clinical Practice Guidelines：Management ofHepatocellular Carcinoma》和《2010年美国肝病年会(AASLD)肝细胞癌诊疗指南》)等作为HCC公认的诊断指标。
研究发现，循环系统中，游离的GPC3含量与GPC3阳性细胞数量相关，检测血清中sGPC3含量可间接反映体内GPC3阳性细胞数量水平。
从目前各项指南的内容来看，其接受、推荐和建议的GPC3检测方法学为免疫组化的方法，来判断肝癌细胞和癌旁细胞，以染色结果的阴阳性作为指示标准。且大部分文献报道中GPC3物质的检测方法为ELISA方法，有少量文献中报道采用化学发光的检测方法检测血清中GPC3的含量。化学发光的检测方法灵敏度高、线性范围广、定量检测结果精确、误差小、自动化程度高、操作简便，检测速度快，一般30min内，甚至15min内出结果。
R&D的Human Glypican3检测试剂盒(Quantikine ELISA)厂家说明：该试剂盒检测时长4.5h，血清加样量为(100uL)，分析灵敏度为20.6pg/mL，检测范围为78.1- 5000pg/mL，精密度CV＜10％。
发明内容
为了解决现有GPC3检测试剂盒灵敏度不高的技术问题，本发明提供了一种提高GPC3 检测灵敏度的试剂盒，该试剂盒具有更高的GPC3检测灵敏度，同时具有更宽的线性范围。
本发明还提供了一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒的制备方法。
本发明通过以下技术方案实现：
一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒，包括试剂M和试剂R，所述试剂M通过磁珠微粒偶联鼠抗人GPC3单克隆抗体并经稀释后制得，磁珠微粒直径为0.8μm～3μm；
所述磁珠微粒偶联鼠抗人GPC3单克隆抗体并经磁珠微粒偶联抗体稀释液稀释后制成试剂M，所述磁珠微粒偶联抗体稀释液的成分包括：Proclin300、缓冲液、表面活性剂和蛋白；
所述试剂R通过碱性磷酸酶标记兔抗人GPC3多克隆抗体并经碱性磷酸酶标记抗体稀释液稀释后制得。
进一步的，所述试剂M中，磁珠微粒与鼠抗人GPC3单克隆抗体的质量比为0.3∶(0.2～0.5)；
所述试剂R中，碱性磷酸酶与兔抗人GPC3多克隆抗体的质量比为(0.25～0.5)∶(0.5～1)；
所述磁珠微粒与碱性磷酸酶的质量比为0.3∶(0.25～0.5)。
进一步的，所述磁珠微粒偶联抗体稀释液各成分的浓度为：
Proclin300∶0.03％～0.1％，缓冲液：0.02～0.05mol/L，表面活性剂：0.2％～2％，蛋白：0.1％～0.5％，pH为7.0～8.0；
所述缓冲液包括PB缓冲液、MOPS缓冲液、TES缓冲液、HEPES缓冲液和DIPSO缓冲液中的任意一种；所述表面活性剂包括Brij-35、S9、EmulgenA90和PEG-6000中的任意一种；所述蛋白为BSA或牛γ球蛋白。
进一步的，所述试剂M中，磁珠微粒直径为3μm；
所述磁珠微粒、鼠抗人GPC3单克隆抗体、碱性磷酸酶和兔抗人GPC3多克隆抗体的质量比为0.3∶0.5∶0.5∶0.5；
所述磁珠微粒偶联抗体稀释液的成分包括0.05％Proclin300、0.02mol/L的DIPSO缓冲液、2％PEG-b000、0.1％牛γ球蛋白，pH＝7.4；
所述碱性磷酸酶标记抗体稀释液成分包括：0.9％氯化钠、1mM六水合氯化镁、0.1mM 无水氯化锌、0.1％牛血清白蛋白、0.05％Proclin300、0.02M pH7.4的Tris-HCl缓冲液。
一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒的制备方法，包括：
直径0.8μm～3μm的磁珠微粒采用活化剂活化；
活化后的磁珠微粒加入鼠抗人GPC3单克隆抗体进行偶联反应；
偶联反应完成后加入甘氨酸溶液淬灭液进行反应，反应完毕后洗涤、重悬，得到磁珠微粒偶联抗体；
取碱性磷酸酶、兔抗人GPC3多克隆抗体和戊二醛进行交联反应；
交联反应结束后加入乙醇胺反应，反应完毕后进行透析，得到碱性磷酸酶标记抗体。
进一步的，所述磁珠微粒在活化前采用PBS缓冲液重复洗涤，所述活化工艺为：洗涤完毕的磁珠微粒采用PBS缓冲液重悬，加入活化剂EDC反应30min，活化完成后分离、弃上清。
进一步的，所述偶联反应为：经活化的磁珠微粒加入鼠抗人GPC3单克隆抗体，在室温进行偶联。
进一步的，所述甘氨酸溶液淬灭液浓度为1mol/L，pH＝8.0。
进一步的，所述交联反应为：取碱性磷酸酶、兔抗人GPC3多克隆抗体溶于生理盐水中，加入1％的戊二醛，在室温120rmp下反应15min后避光反应4h。
进一步的，所述乙醇胺浓度为1mol/L，加入乙醇胺后室温120rmp下反应2h，反应完毕后，混合溶液在PBS缓冲液中4℃过夜透析，用含1％BSA且与透析后混合物等体积的甘油于-20℃保存。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明提供一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒，本发明通过调整磁珠微粒直径、碱性磷酸酶及抗体用量，并改进磁珠微粒偶联抗体的稀释液，可在显著提高GPC3检测灵敏度的同时，扩大GPC3检测线性范围，GPC3检出限可达到10pg/mL，检测范围可达36-19860pg/mL，精密度CV＜5％。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
本发明通过调整磁珠微粒直径、碱性磷酸酶及抗体用量、优化磁珠微粒偶联抗体的稀释液，提高GPC3检测灵敏度的同时，扩大GPC3检测线性范围。
本发明通过调节磁珠微粒的直径来优化试剂盒的最低检测限，较小直径的磁珠微粒在同等质量浓度下提供较大的抗体结合面积，从而有助于拓宽免疫分析的线性范围。较大直径的磁珠微粒将提高反应体系对低浓度样本被检出的性能，可以优化最低检测限，但是直径的增大会带来固相载体总表面积下降，导致结合在载体上的抗体量下降，从而影响检测上限。
戊二醛交联标记法是以双功能交联剂为桥，使酶与抗体结合。最常用的交联剂是戊二醛。它具有两个活性醛基，可分别与酶分子和抗体分子上的氨基结合。戊二醛法又根据试剂加入的方法分为一步法和二步法，本发明中采用一步法，此法操作简便。
样本中GPC3与已包被抗GPC3单克隆抗体的磁珠微粒以及抗GPC3多克隆抗体-碱性磷酸酶标记物经过孵育后，GPC3和已包被抗GPC3单克隆抗体的磁珠微粒结合，同时GPC3另一个位点与抗GPC3多克隆抗体-碱性磷酸酶标记物结合形成复合物。反应完成后，磁场吸附磁珠微粒，清洗未被结合的物质。加入的发光底物被碱性磷酸酶分解，磷酸酯基发生水解而脱去一个磷酸基，生成一个不稳定的中间体，此中间体经分子内电子转移裂解为一分子的金刚烷酮和一分子处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子，当其回到基态时产生化学发光，再通过光电倍增管对反应中的光子数进行测量，产生的光子数与样本中GPC3的浓度成正比。根据校准曲线，可计算出样本中GPC3的含量。
具体的，本发明
一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒，包括试剂M和试剂R，所述试剂M通过磁珠微粒偶联鼠抗人GPC3单克隆抗体并经稀释后制得，磁珠微粒直径为0.8μm～3μm；
所述磁珠微粒偶联鼠抗人GPC3单克隆抗体并经磁珠微粒偶联抗体稀释液稀释后制成试剂M，所述磁珠微粒偶联抗体稀释液的成分包括：Proclin300、缓冲液、表面活性剂和蛋白；
所述试剂R通过碱性磷酸酶标记兔抗人GPC3多克隆抗体并经碱性磷酸酶标记抗体稀释液稀释后制得。
进一步的，所述试剂M中，磁珠微粒与鼠抗人GPC3单克隆抗体的质量比为0.3∶(0.2～0.5)；
所述试剂R中，碱性磷酸酶与兔抗人GPC3多克隆抗体的质量比为(0.25～0.5)∶(0.5～1)；
所述磁珠微粒与碱性磷酸酶的质量比为0.3∶(0.25～0.5)。
进一步的，所述磁珠微粒偶联抗体稀释液各成分的浓度为：
Proclin300：0.03％～0.1％，缓冲液：0.02～0.05mol/L，表面活性剂：0.2％～2％，蛋白：0.1％～0.5％，pH为7.0～8.0；
所述缓冲液包括PB缓冲液、MOPS缓冲液、TES缓冲液、HEPES缓冲液和DIPSO缓冲液中的任意一种；所述表面活性剂包括Brij-35、S9、EmulgenA90和PEG-6000中的任意一种；所述蛋白为BSA或牛γ球蛋白。
在磁珠微粒偶联抗体稀释液中：
MOPSO属于Good′s缓冲液，它的中文名全称3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸，生物研究的新型两性离子缓冲液，缓冲能力在pH6.2～7.6范围，是低温生化工作中最常用的缓冲剂之一；TES中文名全称N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸，该缓冲体系的缓冲能力在pH6.8～8.2范围；HEPES中文名全称4-羟乙基哌嗪乙磺酸，是一种氢离子缓冲剂，该缓冲体系的缓冲能力在pH6.8～8.2范围；DIPSO中文名全称3-[N，N-二(羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸，该缓冲体系的缓冲能力在pH7.0～8.2范围；这几种缓冲体系能较长时间在pH7.4 附近范围恒定控制。
聚乙二醇系列产品可作为酯型表面活性剂，PEG-6000属于相对分子量较低的聚乙二醇，可用作溶剂、助溶剂和稳定剂；聚氧乙烯月桂醚又称Brij35，为非离子表面活性剂，用作扩散剂，通过膜渗透有效分离亲水性蛋白质和疏水性蛋白质，而不改变其生物学活性；表面活性剂S9(Tetronic1307)是优良的消泡剂和分散剂，可减少血液样本的基质效应；聚氧乙烯基联苯乙烯化苯基醚又称EmulgenA90，是一种非离子型表面活性剂，低泡性表面活性剂。
与抗原抗体反应无关的蛋白类物质，例如BSA、牛γ球蛋白，都能起到封闭作用，减少非特异性吸附，降低0点信号值，从而增加信噪比，提高灵敏度。
下面将结合实施例、对照例及实验数据对本申请一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒进行详细说明。
实施例
本申请设置14个实施例和4个对比例。
一、试剂的制备
1.1试剂M的制备：
磁珠微粒偶联抗体中的抗体为鼠抗人GPC3单克隆抗体，所述磁珠微粒的直径为0.8μm～3μm，取100μL的3mg/mL磁珠微粒到2mL的EP管中，置于磁分离器上4min，弃去上清液；加入150μL的0.1M PBS缓冲液，吹打均匀，置于磁分离器上分离4min，弃去上清液，重复洗涤3次；
洗涤完毕后，加入90μL的0.1mol/L PBS缓冲液重悬；加入10mg/mL的EDC活化剂100μL，吹打均匀后，置于振荡器上，反应30min，置于磁分离器上分离4min，弃去上清液；
然后加入20～500ug的鼠抗人GPC3单克隆抗体进行偶联，具体在实验中采用500ug的鼠抗人GPC3单克隆抗体，用0.1mol/L PBS缓冲液稀释至总体积为500μL，室温过夜震荡后，置于磁分离器上分离4min，弃去上清液，PBS缓冲液洗2次；
加入1mol/L pH8.0的甘氨酸溶液淬灭液室温混匀30min，加入含0.1％吐温20，0.1％BSA的0.01M的PBS缓冲液洗2次，磁分离去上清后用0.1％BSA的PBS缓冲液洗重悬定容到1mL，置于2～8℃备用。用磁珠微粒偶联抗体稀释液稀释50倍后可作为试剂M直接使用。
1.2试剂R的制备：
分别取0.25～0.5mg碱性磷酸酶、0.5～1mg兔抗人GPC3多克隆抗体溶于0.5mL生理盐水中，加入0.05mL 1％的戊二醛，在室温120rmp下反应15min后避光反应4h，加入 0.1mL1M的乙醇胺在室温120rmp下反应2h，混合溶液在PBS缓冲液中4℃过夜透析，用含1％BSA且与透析后混合物等体积的甘油在-20℃保存。用碱性磷酸酶标记抗体稀释液稀释1000倍后可作为试剂R直接使用。
二、比对试剂性能测试
以R&D的Human Glypican3检测试剂盒(Quantikine ELISA)作为比对试剂盒，测试其灵敏度。
分析灵敏度又称检测限(limit of detection)，是基于零浓度基础上，用于区分从无到有的分析能力。本发明以低浓度样本的信号值和0点的信号值的比值(用“信噪比”表示)来评价试剂的检测低浓度样本的能力，信噪比越大说明该样本与0点越能区分开，检测限越低。
2.1采用不同浓度的校准品测试比对试剂盒线性，结果如表1：
表1比对试剂盒测校准品结果
校准品浓度(pg/mL) 校准品0D值
0 0.110
78.1 0.135
156 0.194
313 0.266
625 0.421
1250 0.812
2500 1.501
5000 2.498
r 0.9931
结论：比对试剂盒测校准品(检测范围78.1-5000pg/mL)的线性相关系数r＝0.9931
2.2比对试剂盒测高低值混合样本的线性。
高值样本用低值样本(低值样本接近线性区间的下限)按一定比例稀释成不同浓度的样本。用比对试剂盒分别测定以上样本，每个稀释浓度测定3次，分别求出每个稀释浓度检测0D值结果的均值，根据校准曲线算出样本浓度平均值。
表2对比试剂测样本结果
Figure BDA0002667273700000071
结论：根据厂家提出的分析灵敏度为20.6pg/mL，以及实际测试结果，比对试剂盒无法检测≤20pg/mL的样本，超出5000p/mL的样本需要稀释后检测。
三、实施例和对比例的设置及其灵敏度测试
实施例1-14和对比例1-4通过上述试剂制备方法制得，试剂盒具体成分或制备原料如表3、4所示。
制得的试剂盒进行灵敏度测试，采用化学发光法并进行了优化，反应参数为：50μL试剂M、50μL试剂R、50μL血清样本(该样本用R&D的ELISA试剂盒检测过浓度)， 37℃温育20min，洗涤磁分离后读数，结果如表3、5所述：
3.1优化磁珠微粒直径及碱性磷酸酶与抗体比例提高灵敏度
表3化学发光法优化标记工艺结果
Figure BDA0002667273700000072
Figure BDA0002667273700000081
表3中，对比例1及实施例1、2和4的磁珠微粒偶联抗体稀释液成分与实施例3相同。
结论：如表3所示，对比例1使用磁珠微粒直径(0.8μm)，72/0信噪比为3.15， 4965/2489信噪比为1.97，线性相关系数r＝0.9980；与对比例1比较，实施例1使用磁珠微粒直径(1.5μm)，测得样本的光子值升高，72/0信噪比为3.55，4965/2489信噪比为 1.96，线性相关系数r＝0.9987；实施例2使用磁珠微粒直径(3μm)，测得样本的光子值升高，72/0信噪比为3.89，4965/2489信噪比为2.00，线性相关系数r＝0.9982，说明直径1.5～3μm的磁珠微粒可以进一步提高GPC3的检测灵敏度；
与实施例2比较，实施例3碱性磷酸酶的用量从0.25mg提高至0.5mg，72/0信噪比为4.34,4965/2489信噪比为2.04，线性相关系数r＝0.9996，说明提高碱性磷酸酶的用量可以提高GPC3的检测灵敏度；与实施例2比较，实施例4提高了碱性磷酸的用量至 0.5mg，提高了抗体用量至1mg，测得样本的光子值升高，72/0信噪比为4.09,4965/2489 信噪比为2.01，线性相关系数r＝0.9992；但是实施例4与实施例3比较，继续提高了抗体用量至1mg，但是0点信号值升高了，信噪比和线性没有进一步提高，说明抗体浓度太高也会有不利影响。优化标记工艺中，实施例3的条件最佳。
3.2优化磁珠微粒偶联抗体稀释液提高灵敏度
表4优化磁珠微粒偶联抗体稀释液
Figure BDA0002667273700000082
Figure BDA0002667273700000091
表4中，实施例5-14、对比例2-4的磁珠微粒直径及碱性磷酸酶与抗体用量均与实施例3相同。
表5磁珠微粒偶联抗体稀释液优化测试结果
Figure BDA0002667273700000092
结论：如表5所示，实施例3(pH7.4)的光子值、信噪比和线性均高于对比例2(pH6.5)、对比例3(pH8.5)，说明稀释液适宜pH7.4左右；实施例3(添加0.1％BSA)的光子值、信噪比和线性均高于对照例4(不添加BSA)；与实施例3(PB缓冲体系)比较，实施例5(MOPS缓冲体系)、实施例6(TES缓冲体系)、实施例7(HEPES缓冲体系)、实施例8(DIPSO缓冲体系)都降低0点信号值，进一步提高信噪比，其中实施例8 (DIPSO)效果最佳；与实施例3(不添加表面活性剂)比较，实施例9(添加2％PEG- 6000)、实施例10(添加2％Brij-35)、实施例11(添加0.2％S9)、实施例12(添加 0.2％EmulgenA90)能降低0点信号值，提高其他浓度的信号值，从而提高信噪比，其中实施例9(添加2％PEG-6000)效果最佳；与实施例3(添加0.1％BSA)比较，实施例13(添加0.1％牛γ球蛋白)也能降低0点信号值，提高其他浓度的信号值，从而提高信噪比；实施例14，用DIPSO缓冲体系，添加2％PEG-6000，添加0.1％牛γ球蛋白，综合效果更佳。
四、实施例14与比对试剂盒进行比较
从检测范围和线性、空白限、检出限、分析灵敏度、精密度来评价两种检测试剂盒。
4.1检测范围和线性
实施例14和R&D试剂盒同时检测浓度10-19860pg/mL的样本，样本浓度用比对试剂检测过，超过比对试剂检测范围(36-4965pg/mL)的浓度是根据稀释比例计算出的理论浓度。
表6实施例14与比对试剂比对结果
样本浓度pg/mL R&D试剂盒测得0D值 实施例14测得光子值
0 0.115 3256
10 / 4256
20 0.113 7156
36 0.116 13156
72 0.149 26123
162 0.202 46411
360 0.288 119654
635 0.431 211563
1246 0.81 401236
2489 1.457 798456
4965 2.396 1612354
9930 3.265 3256471
19860 3.468 6598731
10/0信噪比 / 1.31
36/0信噪比 1.01 4.04
4965/2489信噪比 1.64 2.02
19860/9930信噪比 1.06 2.03
(36-4965)r 0.9918 0.9999
(36-19860)r 0.8049 0.9999
结论：如表6所示，实施例14，使用磁珠微粒直径(3μm)，碱性磷酸酶与抗体比例为0.5mg：0.5mg，磁珠微粒偶联抗体稀释液包含2％PEG-6000、0.1％牛γ球蛋白、0.05％Proclin300，pH7.4的0.02mol/L DIPSO缓冲液。反应参数为：50μL试剂M、50μL 试剂R、50μL血清样本，37℃温育20min，洗涤磁分离后读数。实施例14测得信噪比和线性相关系数高于R&D试剂，样本检测范围比R&D试剂盒更广。
4.2空白限
用零浓度校准品作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测定结果的OD值或RLU值(相对发光值)，计算其平均值
Figure BDA0002667273700000111
标准差(SD)和LOB值
Figure BDA0002667273700000112
根据零浓度校准品和相邻浓度校准品之间的OD值或RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将
Figure BDA0002667273700000113
即LOB值带入上述方程，求出对应的浓度值，即为空白限。
表7空白限测试结果
测定次数 比对试剂测定OD值 实施例14测定RLU值
1 0.111 3256
2 0.112 3321
3 0.109 3150
4 0.114 3210
5 0.108 3012
6 0.111 3412
7 0.109 3214
8 0.104 2108
9 0.102 3510
10 0.113 3245
11 0.104 3175
12 0.106 3026
13 0.105 2964
14 0.104 3126
15 0.117 3071
16 0.113 3148
17 0.113 3254
18 0.115 3164
19 0.112 3058
20 0.109 3192
平均值 0.110 3131
标准差 0.004 274
LOB值 0.118 3680
空白限 11.90 1.54
结论：比对试剂空白限为11.90pg/mL，实施例14空白限为1.54pg/mL。实施例14的空白限低于比对试剂。
4.3检出限
对5份浓度近似检出限(LOD)的低值样本进行检测，每份样本检测5次，低于空白限(LOB)数值的检测结果的数量应小于或等于3个。
表8检出限测试结果
Figure BDA0002667273700000121
结论：实施例14检出限低于比对试剂，具有更高灵敏度。
4.4重复性
对3个不同浓度的人血清样本进行测定，分别重复测定10次，计算10次测定结果的平均值和标准差，计算变异系数(CV)。
Figure BDA0002667273700000122
Figure BDA0002667273700000131
结论：比对试剂CV＜10％，实施例14的CV＜5％。
4.6结论
本发明采用化学发光的检测方法，从标记工艺、磁珠微粒偶联抗体稀释液进行了优化，提高检测灵敏度和检测范围。使用适宜大小直径的磁珠微粒、适量增加碱性磷酸酶的用量和抗体用量，可以显著提高测试光子值和信噪比，从而提高检测灵敏度。
使用化学发光方法的实施例性能优于ELISA，其中实施例14最佳，使用磁珠微粒直径 (3μm)，碱性磷酸酶与抗体比例为0.5mg：0.5mg，磁珠微粒偶联抗体稀释液包含2％PEG-6000、0.1％牛γ球蛋白、0.05％Proclin300、pH7.4，0.02M的DIPSO缓冲液。反应参数为：50μL试剂M、50μL试剂R、50μL血清样本，37℃温育20min，洗涤磁分离后读数，测得信噪比和线性相关系数高于R&D ELISA试剂，样本检测范围比R&D试剂盒更广，检出限更低，CV更好。检出限为10pg/mL，检测范围为36-19860pg/mL，精密度CV＜5％。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种提高GP03检测灵敏度的试剂盒，其特征在于，包括试剂M和试剂R，所述试剂M通过磁珠微粒偶联鼠抗人GPC3单克隆抗体并经稀释后制得，磁珠微粒直径为0.8μm～3μm；
所述磁珠微粒偶联鼠抗人GPC3单克隆抗体并经磁珠微粒偶联抗体稀释液稀释后制成试剂M，所述磁珠微粒偶联抗体稀释液的成分包括：Proclin300、缓冲液、表面活性剂和蛋白；
所述试剂R通过碱性磷酸酶标记兔抗人GPC3多克隆抗体并经碱性磷酸酶标记抗体稀释液稀释后制得。
2.根据权利要求1所述的一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒，其特征在于，所述试剂M中，磁珠微粒与鼠抗人GPC3单克隆抗体的质量比为0.3∶(0.2～0.5)；
所述试剂R中，碱性磷酸酶与兔抗人GP03多克隆抗体的质量比为(0.25～0.5)∶(0.5～1)；
所述磁珠微粒与碱性磷酸酶的质量比为0.3∶(0.25～0.5)。
3.根据权利要求1或2所述的一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒，其特征在于，所述磁珠微粒偶联抗体稀释液各成分的浓度为：
Proclin300∶0.03％～0.1％，缓冲液：0.02～0.05mol/L，表面活性剂：0.2％～2％，蛋白：0.1％～0.5％，pH为7.0～8.0；
所述缓冲液包括PB缓冲液、MOPS缓冲液、TES缓冲液、HEPES缓冲液和DIPSO缓冲液中的任意一种；所述表面活性剂包括Brij-35、S9、EmulgenA90和PEG-6000中的任意一种；所述蛋白为BSA或牛γ球蛋白。
4.根据权利要求3所述的一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒，其特征在于，所述试剂M中，磁珠微粒直径为3μm；
所述磁珠微粒、鼠抗人GPC3单克隆抗体、碱性磷酸酶和兔抗人GPC3多克隆抗体的质量比为0.3∶0.5∶0.5∶0.5；
所述磁珠微粒偶联抗体稀释液的成分包括0.05％Proclin300、0.02mol/L的DIPSO缓冲液、2％PEG-6000、0.1％牛γ球蛋白，pH＝7.4；
所述碱性磷酸酶标记抗体稀释液成分包括：0.9％氯化钠、1mM六水合氯化镁、0.1mM无水氯化锌、0.1％牛血清白蛋白、0.05％Proclin300、0.02MpH7.4的Tris-HCl缓冲液。
5.一种如权利要求1-4中任一项所述的提高GPC3检测灵敏度的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：
直径0.8μm～3μm的磁珠微粒采用活化剂活化；
活化后的磁珠微粒加入鼠抗人GPC3单克隆抗体进行偶联反应；
偶联反应完成后加入甘氨酸溶液淬灭液进行反应，反应完毕后洗涤、重悬，得到磁珠微粒偶联抗体；
取碱性磷酸酶、兔抗人GPC3多克隆抗体和戊二醛进行交联反应；
交联反应结束后加入乙醇胺反应，反应完毕后进行透析，得到碱性磷酸酶标记抗体。
6.根据权利要求5所述的一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述磁珠微粒在活化前采用PBS缓冲液重复洗涤，所述活化工艺为：洗涤完毕的磁珠微粒采用PBS缓冲液重悬，加入活化剂EDC反应30min，活化完成后分离、弃上清。
7.根据权利要求5所述的一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述偶联反应为：经活化的磁珠微粒加入鼠抗人GPC3单克隆抗体，在室温进行偶联。
8.根据权利要求5所述的一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述甘氨酸溶液淬灭液浓度为1mol/L，pH＝8.0。
9.根据权利要求5所述的一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述交联反应为：取碱性磷酸酶、兔抗人GPC3多克隆抗体溶于生理盐水中，加入1％的戊二醛，在室温120rmp下反应15min后避光反应4h。
10.根据权利要求5所述的一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述乙醇胺浓度为1mol/L，加入乙醇胺后室温120rmp下反应2h，反应完毕后，混合溶液在PBS缓冲液中4℃过夜透析，用含1％BSA且与透析后混合物等体积的甘油于-20℃保存。
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