CN113238038A - 用于免疫组织化学检测的抗体稀释液及其制备方法和应用 - Google Patents

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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies

Abstract

本发明公开了一种用于免疫组织化学检测的抗体稀释液，属于抗体检测技术领域。所述抗体稀释液为含有质量分数为0.1％～1％的牛血清白蛋白、质量分数为0.1％～0.5％的双咪唑烷基脲、体积分数为0.01％～0.1％的吐温的缓冲液。本发明的抗体稀释液，能够提高免疫组织化学检测的强度、灵敏度和稳定性，并且，本发明的抗体稀释液可作为抗体产品的稀释液，用于免疫组化抗体试剂的生产，可以提高免疫组化抗体试剂的储存稳定性。

Description

用于免疫组织化学检测的抗体稀释液及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于抗体技术领域，具体地，涉及用于免疫组织化学检测的抗体稀释液及其制备方法和应用。
背景技术
免疫组织化学(简称免疫组化)是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的底物显色，来确定组织中是否有目标抗原及其表达情况的检测方法。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质，对其进行定位、定性及定量的研究。
抗体稀释液的配方对免疫组织化学的检测强度及抗体产品的稳定性起关键作用。现有免疫组织化学法使用的抗体稀释液配方多样。有采用PBS或PBST作为抗体稀释液，通过其缓冲作用降低因酸碱度变化对实验效果的影响，但该方法存在检测强度低、抗体存储稳定性差以及检测灵敏度低等问题。有采用添加叠氮化钠防腐剂的方法，以增强抗体的存储稳定性，但叠氮化钠毒性高爆炸性强，不利于安全实验和安全管理。
发明内容
为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明的目的在于提供一种用于免疫组织化学检测的抗体稀释液，以提高免疫组织化学检测的强度、灵敏度和稳定性。
为了达到上述目的，本发明采取的技术方案如下：
本发明第一方面提供一种用于免疫组织化学检测的抗体稀释液，所述抗体稀释液为含有质量分数为0.1％～1％的牛血清白蛋白、质量分数为0.1％～0.5％的双咪唑烷基脲、体积分数为0.01％～0.1％的吐温的缓冲液。
其中，牛血清白蛋白作为抗体稳定剂，它可能起到“保护”或“载体”作用，来稳定抗体活性。
采用双咪唑烷基脲作为抑菌剂，其原理是缓释甲醛，对革兰式阳性菌、革兰式阴性菌，包括假单孢菌有抑菌效果，对酵母菌霉菌有选择地抑制。双咪唑烷基脲抑菌剂使用方便、性能稳定、安全可靠，在使用浓度下释放的低浓度甲醛对皮肤和粘膜均无刺激性，对环境无污染。该抑菌剂具有广谱抑菌作用，能有效地抑制大多数细菌，特别是对革兰氏阴性菌抑菌效果较好，其抑菌能力不受体外诊断试剂中的表面活性剂、蛋白质以及酶等添加物的影响，可用于取代常规溶液中的叠氮钠，并可以和常用抑菌剂联合使用。
在本发明的一些实施方案中，所述抗体稀释液为含有质量分数为0.1％～0.5％的牛血清白蛋白、质量分数为0.1％～0.3％的双咪唑烷基脲、体积分数为0.03％～0.08％的吐温的缓冲液。
在本发明的一些具体实施方案中，所述抗体稀释液为含有质量分数为0.25％的牛血清白蛋白、质量分数为0.2％的双咪唑烷基脲、体积分数为0.05％的吐温的缓冲液。
在本发明的一些实施方案中，所述缓冲液为PBS缓冲液。在本发明的一些具体实施方案中，所述PBS缓冲液的制备方法如下：称取8.0份氯化钠、0.2份氯化钾、2.9份十二水磷酸氢二钠和0.2份磷酸二氢钾，溶于800份纯化水中，用1M氢氧化钠溶液调节pH值至7.2-7.6，最后加纯化水定容至1000份，再用0.22μm滤膜过滤后保存备用。
在本发明的另一些实施方案中，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液。在本发明的一些具体实施方案中，所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7.2-7.6。
在本发明中，使用Tris-HCl缓冲液作为缓冲溶剂，比PBS缓冲液的成分更简单、更便于配制，使得抗体稀释液的配制流程更快速便捷易于操作。
在本发明的一些实施方案中，所述抗体稀释液为含有质量分数为0.1％～0.5％的牛血清白蛋白、质量分数为0.1％～0.3％的双咪唑烷基脲、体积分数为0.03％～0.08％的吐温的Tris-HCl缓冲液。
在本发明的一些具体实施方案中，所述抗体稀释液为含有质量分数为0.25％的牛血清白蛋白、质量分数为0.2％的双咪唑烷基脲、体积分数为0.05％的吐温的Tris-HCl缓冲液。
本发明的第二方面提供一种抗体产品，所述抗体产品由本发明第一方面任一所述的用于免疫组织化学检测的抗体稀释液稀释抗体得到。
在本发明的一些实施方案中，所述抗体可以是用于免疫组织化学检测的一抗，也可以是用于免疫组织化学检测的二抗。
本发明的第二方面提供本发明第一方面任一所述的抗体稀释液在制备用于免疫组织化学检测的试剂盒中的应用。
本发明第三方面提供一种用于免疫组织化学检测的试剂盒，包括本发明第一方面任一所述的用于免疫组织化学检测的抗体稀释液。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于免疫组织化学检测的抗体。在本发明的一些具体实施方案中，所述抗体与所述抗体稀释液预混合。在本发明的一些实施方案中，所述抗体可以是用于免疫组织化学检测的一抗，也可以是用于免疫组织化学检测的二抗。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括阴性质控样品和/或阳性质控样品。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于免疫组织化学检测的底物液和/或终止液。
本发明第四方面提供本发明第一方面任一所述用于免疫组织化学检测的抗体稀释液的制备方法，包括将所述牛血清白蛋白、双咪唑烷基脲、吐温和缓冲液混合后搅拌均匀的步骤。
本发明第五方面提供本发明第一方面任一所述用于免疫组织化学检测的抗体稀释液的另一种制备方法，包括以下步骤：
S1，分别配制牛血清白蛋白母液和双咪唑烷基脲母液；
S2，将吐温和缓冲液混合后搅拌均匀，按比例添加配制好的牛血清白蛋白母液和双咪唑烷基脲母液。
本发明第六方面提供本发明第一方面所述基于Tris-HCl缓冲液的抗体稀释液的一种制备方法，包括以下步骤：将牛血清白蛋白、双咪唑烷基脲抑菌剂、吐温、三羟甲基氨基甲烷(Tris)和纯化水混合后搅拌均匀，使用盐酸将溶液pH值调至7.2-7.6，得到所述抗体稀释液。
本发明的有益效果
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种新型抗体稀释液，可以提高免疫组织化学检测灵敏度和强度；由其配制的抗体产品可以在常温下(2-30℃)运输，并且在2-8℃保存下具有较高的储存期限，使用者无需任何配制操作(如稀释)便可直接使用，使用方便。
本发明的抗体稀释液可作为抗体产品的稀释液，用于免疫组化抗体试剂的生产，可以提高免疫组化抗体试剂的储存稳定性。
本发明的抗体稀释液使用Tris-HCl缓冲液配制，成分简单、便于操作。
本发明的抗体稀释液采用双咪唑烷基脲作为抑菌剂，以增强抗体的的存储稳定性；该抑菌剂性能稳定、安全可靠，具有广谱抑菌性。
本发明的抗体稀释液添加了抗体保护剂、非离子表面活性剂，可以保持抗体的活性和稳定性，减少非特异性结合，降低非特异性的背景染色，提高实验的特异性和灵敏度。
附图说明
图1示出了单克隆抗体CK7使用本发明实施例中抗体稀释液#3和抗体稀释液#11稀释后的对前列腺组织的免疫组化染色对比图。左图为抗体稀释液#3稀释后的抗体染色结果，右图为抗体稀释液#11稀释后的抗体染色结果。
图2示出了单克隆抗体CK7使用本发明实施例中抗体稀释液#3和抗体稀释液#11稀释并2-8℃保存12个月后对前列腺组织的免疫组化染色对比图。左图为抗体稀释液#3稀释保存后的抗体染色结果，右图为抗体稀释液#11稀释保存后的抗体染色结果。
具体实施方式
除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。
本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如，如果记载组分、物理或其它性质(如分子量，熔体指数等)是100至1000，意味着明确列举了所有的单个数值，例如100，101，102等，以及所有的子范围，例如100到166，155到170，198到200等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1，1.5等)的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。
关于化学化合物使用时，除非明确地说明，否则单数包括所有的异构形式，反之亦然(例如，“己烷”单独地或共同地包括己烷的全部异构体)。另外，除非明确地说明，否则用“一个”，“一种”或“该”形容的名词也包括其复数形式。
术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均按照《分子克隆实验指南》(第四版)(J.萨姆布鲁克、M.R.格林，2017)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。其他实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1抗体稀释液#1-#5的配制
本实施例提供5种以Tris-HCl缓冲液为主要成分的抗体稀释液#1-#5，均包括牛血清白蛋白(BSA)、双咪唑烷基脲抑菌剂和吐温，具体配方如表1所示。
表1抗体稀释液#1-#5配方
Figure BDA0003060530600000061
制备方法如下：
准确称取或量取BSA、双咪唑烷基脲、吐温于洁净灭菌容器中，加Tris-HCl缓冲液(pH7.4)后，充分搅拌混匀，再用0.22μm滤膜过滤后保存备用。
实施例2抗体稀释液#6的配制
本实施例提供1种以PBS缓冲液为主要成分的抗体稀释液#6，包括牛血清白蛋白(BSA)、双咪唑烷基脲抑菌剂和吐温，具体配方如表2所示。
表2抗体稀释液#6配方
组分 含量
1×PBS(mL) 999.5
吐温-20(mL) 0.5
双咪唑烷基脲(g) 2
BSA(g) 2.5
其制备方法如下：
准确称取或量取BSA、双咪唑烷基脲、吐温于洁净灭菌容器中，加1×PBS缓冲液(pH7.4)后，充分搅拌混匀，再用0.22μm滤膜过滤后保存备用。
其中，1×PBS缓冲液的配制方法如下：
称取8.0g氯化钠、0.2g氯化钾、2.9g磷酸氢二钠十二水和0.2g磷酸二氢钾，溶于800毫升纯化水中，用1M氢氧化钠溶液调节pH值至7.2-7.6，最后加纯化水定容至1升，再用0.22μm滤膜过滤后保存备用。
实施例3抗体稀释液#7-#9的配制
本实施例提供3种以Tris-HCl缓冲液为主要成分的抗体稀释液#7-#9，均包括牛血清白蛋白(BSA)、双咪唑烷基脲抑菌剂和吐温，具体配方如表3所示。
表3抗体稀释液#7-#9配方
Figure BDA0003060530600000071
制备方法如下：
准确称取或量取BSA、双咪唑烷基脲、吐温于洁净灭菌容器中，加Tris-HCl缓冲液(pH7.4)后，充分搅拌混匀，再用0.22μm滤膜过滤后保存备用。
实施例4抗体稀释液#10的配制
本实施例提供1种以Tris-HCl缓冲液为主要成分的抗体稀释液#10，包括牛血清白蛋白(BSA)、硫酸庆大霉素和吐温，具体配方如表4所示。
表4抗体稀释液#10配方
Figure BDA0003060530600000081
制备方法如下：
准确称取或量取BSA、硫酸庆大霉素(初始浓度15mg/mL,终浓度为100mg/L)、吐温于洁净灭菌容器中，加Tris-HCl缓冲液(pH7.4)后，充分搅拌混匀，再用0.22μm滤膜过滤后保存备用。
实施例5抗体稀释液#11的配制
本实施例提供1种以Tris-HCl缓冲液为主要成分的抗体稀释液#10，包括牛血清白蛋白(BSA)、ProclinTM 950和吐温，具体配方如表5所示。
表5抗体稀释液#11配方
成分 含量
Tris-HCl(mL) 996
吐温-20(mL) 0.5
Proclin<sup>TM</sup> 950(mL) 3.5
BSA(g) 2.5
制备方法如下：
准确称取或量取BSA、ProclinTM 950、吐温于洁净灭菌容器中，加Tris-HCl缓冲液(pH7.4)后，充分搅拌混匀，再用0.22μm滤膜过滤后保存备用。
实施例6抗体稀释液#1-#11的效果检测
1.抗体稀释
分别利用实施例1配制的抗体稀释液#1-#5、实施例2配制的1×PBS缓冲液和抗体稀释液#6，以及实施例3-5配制的抗体稀释液#7-#11，按抗体适宜稀释度对抗体进行稀释，抗体货号、克隆号、稀释度如表6所示。
表6抗体信息
抗体靶点 货号 克隆号 稀释度 供应商
CK7 BX50055 BP6060 1:400 杭州百凌生物科技有限公司
IgD BX50130 BP6134 1:200 杭州百凌生物科技有限公司
CAM5.2 BX50146 CAM5.2 1:150 杭州百凌生物科技有限公司
Nestin BX50154 10C2 1:100 杭州百凌生物科技有限公司
p16 BX50158 BPM6147 1:200 杭州百凌生物科技有限公司
Pax-8 BX50179 BP6157 1:1600 杭州百凌生物科技有限公司
CD56 BX50165 123C3.D5 1:1600 杭州百凌生物科技有限公司
PLAP BX50170 BP6022 1:400 杭州百凌生物科技有限公司
2抗体检测
将载有组织样本的切片置于62℃烤片1小时。在通风橱中将玻片依次浸入2缸脱蜡液中，每次15分钟。将切片依次浸入无水乙醇、95％乙醇、75％乙醇中，每种溶液各浸泡2次，每次5分钟。取出切片后复水5分钟。将切片置于预先加热至沸腾状态的抗原修复液中，保持微沸腾15分钟，待恢复至室温后将样本切片取出。添加3％过氧化氢溶液，室温孵育10分钟去除内源性过氧化物酶。使用上述稀释好的一抗孵育切片，室温孵育30分钟。添加偶联了HRP的多聚物二抗，室温孵育30分钟。添加DAB显色液，室温孵育2分钟。显色结束后进行苏木素复染、脱水透明。切片取出吹干后，中性树胶封片。
3染色结果
分别利用实施例配制的抗体稀释液#1-#11按抗体适宜稀释度对单克隆抗体进行稀释后，进行组织染色，以实施例2中的PBS缓冲液为对照。染色结果如表7、表8所示。
表7单克隆抗体名称和对应的组织染色情况
抗体靶点 组织 #1 #2 #3 #4 #5 #6 PBS缓冲液
CK7 前列腺 合格 合格 合格 合格 合格 合格 合格
IgD 扁桃体 合格 合格 合格 合格 合格 合格 合格
CAM5.2 结肠 合格 合格 合格 合格 合格 合格 合格
Nestin 黑色素瘤 合格 合格 合格 合格 合格 合格 合格
p16 宫颈癌 偏弱 合格 合格 合格 合格 合格 偏弱
Pax-8 浆液性卵巢癌 偏弱 合格 合格 合格 合格 偏弱 偏弱
CD56 小细胞肺癌 偏弱 合格 合格 合格 合格 合格 偏弱
PLAP 胎盘 合格 合格 合格 合格 弱背景 合格 合格
表8单克隆抗体名称和对应的组织染色情况
抗体靶点 组织 #7 #8 #9 #10 #11 PBS缓冲液
CK7 前列腺 合格 出现核非特染 出现核非特染 合格 偏弱 合格
IgD 扁桃体 合格 合格 合格 合格 偏弱 合格
CAM5.2 结肠 合格 合格 合格 合格 合格 合格
Nestin 黑色素瘤 合格 合格 合格 合格 合格 合格
p16 宫颈癌 合格 合格 合格 合格 合格 偏弱
Pax-8 浆液性卵巢癌 合格 合格 合格 合格 合格 偏弱
CD56 小细胞肺癌 合格 合格 合格 合格 合格 偏弱
PLAP 胎盘 合格 合格 合格 弱背景 合格 合格
由表7、表8可知，以上单克隆抗体染色中，抗体稀释液#1稀释的抗体中有3个抗体染色偏弱，5个抗体染色符合要求；抗体稀释液#2、抗体稀释液#3、抗体稀释液#4和抗体稀释液#7稀释的8个抗体染色均符合要求；抗体稀释液#5稀释的抗体中有1个抗体染色出现弱背景，7个抗体染色符合要求；抗体稀释液#6稀释的抗体中有1个抗体染色偏弱，7个抗体染色符合要求；抗体稀释液#8稀释的抗体中有1个抗体染色出现核非特染，7个抗体染色符合要求；抗体稀释液#9稀释的抗体中有1个抗体染色出现核非特染，7个抗体染色符合要求；抗体稀释液#10稀释的抗体中有1个抗体染色出现弱背景，7个抗体染色符合要求；抗体稀释液#11稀释的抗体中有2个抗体染色偏弱，6个抗体染色符合要求。相比对而言，PBS缓冲液稀释的抗体中有3个抗体染色偏弱，5个抗体染色符合要求。
分别利用实施例1配制的抗体稀释液#3以按抗体适宜稀释度对抗体进行稀释后，2-8℃保存12个月再进行染色，以实施例5中的抗体稀释液#11为对照，染色结果如表9所示。
表9抗体稀释保存12个月后对组织染色结果
Figure BDA0003060530600000111
由表9结果可知，抗体稀释液#3稀释保存的8个抗体染色均符合要求，相对而言，抗体稀释液#11保存的抗体染色仅有3个抗体符合要求，5个抗体染色偏弱或阴性。
发明人分别利用抗体稀释液#3和抗体稀释液#11稀释单克隆抗体CK7，然后对前列腺组织进行染色，结果如图1所示。
发明人进一步分别利用抗体稀释液#3和抗体稀释液#11稀释单克隆抗体CK7后，2-8℃保存12个月，再对前列腺组织进行染色，结果如图2所示。
由图1和图2可知，利用抗体稀释液#3和抗体稀释液#11稀释单克隆抗体CK7，检测效果均比较理想。但稀释后在2-8℃保存12个月后再进行染色，利用抗体稀释液#3稀释保存的单克隆抗体CK7仍有非常好的染色效果，但利用抗体稀释液#11稀释保存的单克隆抗体CK7没有任何染色效果。
综上所述，本发明所提供的抗体稀释液可以提高免疫组织化学检测的强度、灵敏度和稳定性。本发明提供的抗体稀释液可用于稀释制备抗体产品，用于免疫组化抗体试剂的生产，以提高免疫组化抗体试剂的储存稳定性；由其配制的抗体产品在2-8℃保存下具有较长的储存期限。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种用于免疫组织化学检测的抗体稀释液，其特征在于，所述抗体稀释液为含有质量分数为0.1％～1％的牛血清白蛋白、质量分数为0.1％～0.5％的双咪唑烷基脲、体积分数为0.01％～0.1％的吐温的缓冲液。
2.根据权利要求1所述的用于免疫组织化学检测的抗体稀释液，其特征在于，所述缓冲液为PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
3.根据权利要求2所述的用于免疫组织化学检测的抗体稀释液，其特征在于，所述抗体稀释液的pH值为7.2-7.6。
4.一种抗体产品，其特征在于，所述抗体产品利用权利要求1-3任一所述的用于免疫组织化学检测的抗体稀释液稀释抗体得到。
5.权利要求1-3任一所述的抗体稀释液在制备用于免疫组织化学检测的试剂盒中的应用。
6.一种用于免疫组织化学检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任一所述的用于免疫组织化学检测的抗体稀释液。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于免疫组织化学检测的抗体。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体与所述抗体稀释液预混合。
9.权利要求1所述用于免疫组织化学检测的抗体稀释液的制备方法，其特征在于，包括将所述牛血清白蛋白、双咪唑烷基脲、吐温和缓冲液混合后搅拌均匀的步骤。
10.权利要求1所述用于免疫组织化学检测的抗体稀释液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，分别配制牛血清白蛋白母液和双咪唑烷基脲母液；
S2，将吐温和缓冲液混合后搅拌均匀，按比例添加配制好的牛血清白蛋白母液和双咪唑烷基脲母液。
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