CN105067816A - 一种即用型抗体及其应用 - Google Patents

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易慕华
方捷迪
张梦玲
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Abstract

本发明提供一种即用型抗体及其稀释液，即，采用SP法，选择即用型抗体c-erbB-2单克隆抗体原液、再稀释液1:2、1:4、1:8和1:16进行免疫组织化学检查，c-erbB-2即用型工作液最适稀释浓度为1:4，得到最弱的背景染色、最大强度的特异性染色、最佳对比度的染色结果。即用型抗体再稀释是一种值得推广使用的免疫组织化学质量控制方法。

Description

一种即用型抗体及其应用
技术领域
本发明提供一种即用型抗体c-erbB-2及其稀释液，并提供一种免疫组织化学染色中的质量控制上的应用。
背景技术
免疫组织化学技术(ImmunohistoChemistry,IHC)应用抗原与抗体特异性结合的基本原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(如同位素、荧光素、金属离子和酶等)定位、定性及定量显示组织细胞内抗原的过程。IHC是目前病理科最常用的确诊疾病和诊断疑难病例辅助检测手段，是肿瘤的个性化治疗、预后判断和药物选择主要参考指标。做好IHC的质量控制，是指导疾病的诊断与治疗的根基。
多种因素影响IHC染色效果，包括组织的取材固定、抗原修复手段、封闭和抗体质量等，其中抗体质量是主要决定性因素。为了避免非特异性染色，在IHC操作过程中常选择特异性强、效价高的单克隆抗体为一抗。即用型抗体是按各公司确定的最佳信噪比的稀释度，用带有防腐剂等成分的抗体稀释剂稀释的浓缩抗体，具有使用方便、操作简单等优势。但在操作过程中我们发现c-erbB-2即用型抗体导致组织切片背景着色或假阳性，因抗体稀释度不当导致的假阳性反应。因此我们尝试对即用型抗体c-erbB-2再稀释后进行操作，确定最佳稀释比例，以达到高标准化的IHC效果。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种即用型抗体。
一种即用型抗体，其即用型抗体为即用型抗体c-erbB-2。所述的即用型抗体包括即用型抗体c-erbB-2与抗体稀释液按体积比1:2、1:4、1:8、1:16稀释后混合。
进一步优选为所述的即用型抗体包括即用型抗体c-erbB-2与抗体稀释液按体积比1:4稀释后混合。
本发明将上述的即用型抗体在免疫组织化学染色中的质量控制上的应用。包括如下步骤：
（1）将乳腺癌切除标本切片厚度为3μm，70℃烤片40min，脱蜡至水；
（2）在高温高压（120℃、70KPa）下利用pH为8.0的EDTA对乳腺癌切片进行抗原修复，喷气后计时2.5min，再用流水冷却，得到修复后的组织抗原，再用3%的H2O2处理10min（浸泡）；
（3）进一步对修复后的组织抗原采用pH为7.2的PBS冲洗3次，每次3min，甩干PBS后迅速滴加即用型抗体或即用型抗体与抗体稀释液的混合试剂，再37℃置于恒温培养箱中孵育60min；
（4）重复PBS冲洗操作一次后，再滴加通用型二抗试剂，再在37℃下孵育30min；
（5）重复PBS冲洗操作一次后，滴加DAB显色液，在显微镜下观察显色效果后自来水水洗、苏木素复染、脱水和封固。
步骤（3）中，若滴加即用型抗体c-erbB-2，则，即用型抗体c-erbB-2的滴加量为充分覆盖住组织并略多些。
若滴加即用型抗体c-erbB-2与抗体稀释液的混合试剂，则，即用型抗体c-erbB-2与抗体稀释液的体积比为1:2、1:4、1:8、1:16，其混合试剂的滴加量为充分覆盖住组织并略多些。步骤（4）中，通用型二抗试剂的滴加量为充分覆盖住组织并略多些。
即用型一抗试剂给病理技术人员带来了方便，不需要重新探讨稀释比例，稳定性好，大大提高了IHC的操作效率，同时由于国内即用型试剂供应商多采用对国外浓缩型抗体按说明书推荐稀释比例进行分装并进行预实验，保障了IHC试剂的质量控制。但由于各种操作流程与条件的差异，即用型一抗试剂效果并不理想，必须重新摸索最适抗体稀释度。IHC操作过程中多种因素影响一抗稀释度，主要包括固定方法和时长、抗原修复方法、修复液种类和pH、抗体孵育温度和时长以及检测系统的敏感性等。本申请中即用型一抗试剂即为本申请的即用型抗体c-erbB-2，经稀释后的即用型抗体c-erbB-2也为即用型一抗试剂。
附图说明
图1为乳腺癌即用型及再稀释型c-erbB-2抗体的免疫表达，其中，A:c-erbB-2即用型(SP，IHC×100)；B:c-erbB-2再稀释1:2(SP，IHC×100);C:c-erbB-2再稀释1:4(SP，IHC×100);D:c-erbB-2再稀释1:8(SP，IHC×100);E:c-erbB-2再稀释1:16(SP，IHC×100)。
具体实施方式
实施例1
随机选取三峡大学仁和医院手术室送检的乳腺癌切除标本共60例。每例标本规范化取材固定、脱水、透明、浸蜡及包埋。
试剂
即用型兔抗人c-erbB-2单克隆抗体(Catalog#JY-0044)和抗体稀释液均购自Thermo公司，显色系统购自DAKO公司。
仪器
隔水式电热恒温培养箱(HENGZI，上海跃进)。
染色步骤
IHC染色采用SP法。实验过程中所有试剂现配现用。再稀释型一抗采用1:2、1:4、1:8和1:16四个梯度比例。本文所述的一抗或即用型一抗均指即用型抗体c-erbB-2或即用型抗体c-erbB-2与抗体稀释液的混合液。
(1)实验中所有切片厚度统一3μm，70℃烤片40min，脱蜡至水。(2)在高温高压下利用EDTA(pH8.0)对组织抗原进行修复，时长2.5min(喷气后开始计时)，流水快速冷却。(3)使用3%H2O2处理10min。(4)PBS(pH7.2)冲洗3次，每次3min，甩干PBS后迅速滴加即用型及再稀释型一抗试剂50μL，置于恒温培养箱(37℃)中孵育60min。(5)重复PBS操作，滴加通用型二抗试剂50μL，37℃孵育30min。(6)重复PBS操作，滴加DAB显色液，显微镜下观察显色效果(显色时长约10min)后自来水水洗、苏木素复染、脱水和封固。
基于固定方法、固定时间和组织处理过程相对一致前提下，抗体最适稀释浓度是以得到最弱的背景染色和最大强度的特异性染色为标准。本实验选取的60例标本所得出的实验结果一致。
即用型抗体c-erbB-2与四个浓度梯度比例的切片IHC染色情况如图1所示。不同稀释浓度梯度比例均有阳性表达，其中以稀释1:4组染色效果最为理想(图1C)，即1mLc-erbB-2即用型工作液中加入4mL抗体稀释液时阳性切片特异性染色最强，着色均匀，阳性部位与阴性部位界线清晰、对比度最佳。而当稀释浓度比例为1:16时(图1E)，切片中强阳性部位组织仅表达弱阳性，此时稀释浓度过大，不能达到检测要求。
在IHC操作中部分即用型抗体导致组织切片出现背景着色，主要原因是即用型抗体浓度过高，而IHC染色质量控制要求组织切片以最弱的背景染色和最大强度的特异性染色为标准，所以在实际操作中需要对即用型抗体进行再稀释。上述实验数据表明，对于c-erbB-2即用型选用最佳的抗体稀释浓度非常重要，其最佳抗体稀释浓度为1:4，但并不是每一种即用型抗体都要进行再稀释，同样每种抗体的再稀释浓度也存在差异，因此选用最佳的抗体的再稀释浓度尤为重要。即用型抗体再稀释对大多数抗体来说能达到理想的染色结果，是一种值得推广使用的IHC质量控制方法。
IHC技术可以判断肿瘤性质、肿瘤来源、细胞属性、增殖活性，并指导肿瘤的治疗与预后，广泛应用于临床病理诊断与治疗工作中。IHC技术地位的重要性，要求每一个病理技术工作人员把好质量控制关，正确认识和努力避免由于技术缺陷和不足给诊断带来的误区。在实际工作中我们应该在参考抗体使用说明书的同时，通过病理医生和病理技术人员的合作、学习和探索，结合自身条件，优化和筛选技术操作方法，寻找最佳的抗体稀释度，提高IHC技术水平，更好发挥IHC技术的指导作用。

Claims (7)

1.一种即用型抗体，其特征在于，其即用型抗体为即用型抗体c-erbB-2。
2.权利要求1所述的即用型抗体还包括即用型抗体c-erbB-2与抗体稀释液按体积比1:2、1:4、1:8、1:16稀释后混合。
3.权利要求2所述的即用型抗体还包括即用型抗体c-erbB-2与抗体稀释液按体积比1:4稀释后混合。
4.权利要求1-3任一项所述的即用型抗体在免疫组织化学染色中的质量控制上的应用。
5.权利要求4所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
1)将乳腺癌切除标本切片厚度为3μm，70℃烤片40min，脱蜡至水；
2)在70KPa、120℃的高温高压下利用pH为8.0的EDTA对乳腺癌切片进行喷气式组织抗原修复，修复2.5min，再用流水冷却，得到修复后的组织抗原，再用3%的H2O2浸泡10min；
3)进一步对修复后的组织抗原采用pH为7.2的PBS冲洗3次，每次3min，甩干PBS后迅速滴加即用型抗体c-erbB-2或即用型抗体c-erbB-2与抗体稀释液的混合试剂，在37℃置于恒温培养箱中孵育60min；
4)重复PBS冲洗操作一次后，再滴加通用型二抗试剂，再在37℃下孵育30min；
5)重复PBS冲洗操作一次后，滴加DAB显色液，在显微镜下观察显色效果后自来水水洗、苏木素复染、脱水和封固。
6.权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，若滴加即用型抗体c-erbB-2，则，即用型抗体c-erbB-2的滴加量为充分覆盖住组织抗原；
若滴加即用型抗体c-erbB-2与抗体稀释液的混合试剂，则，即用型抗体c-erbB-2与抗体稀释液的体积比为1:2、1:4、1:8、1:16，其混合试剂的滴加量为充分覆盖住组织抗原。
7.权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（4）中，通用型二抗试剂的滴加量为充分覆盖住组织抗原。
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