CN102405238A - 测定癌症组织学类型的抗体鸡尾酒、测定试剂盒及测定方法 - Google Patents

测定癌症组织学类型的抗体鸡尾酒、测定试剂盒及测定方法 Download PDF

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Abstract

要解决的问题本发明的目的是提供一种用于测定癌症组织学类型的抗体鸡尾酒以及使用该抗体鸡尾酒进行测定的方法。本发明的另一个目的是提供一种测定试剂盒。解决问题的手段一种用于测定肺癌的组织学类型的抗体鸡尾酒，其特征在于：该抗体鸡尾酒包括：与腺癌细胞质中的Napsin-A和腺癌细胞核中的TTF-1有抗原抗体反应的ADC抗体鸡尾酒，和与鳞状细胞癌细胞质中的CK14和位于鳞状细胞癌的细胞核上的p63有抗原抗体反应的SCC抗体鸡尾酒。

Description

测定癌症组织学类型的抗体鸡尾酒、测定试剂盒及测定方法
技术领域
本发明涉及一种采用免疫组化(IHC)测定癌症组织学类型的方法。尤其涉及对测定非小细胞肺癌组织学类型有效的抗体鸡尾酒(cocktail antibody)、通过使用该抗体鸡尾酒来测定非小细胞肺癌组织学类型的方法、以及测定非小细胞肺癌组织学类型的试剂盒。
背景技术
据估计世界上每年有百万或更多的人死于肺癌。组织学上将肺癌分为小细胞肺癌(SCLC，Small Cell Lung Carcinoma)或者非小细胞肺癌(NSCLC，Non-Small Cell Lung Carcinoma)。非小细胞肺癌又被分为腺癌(ADC，Adenocarcinoma)、鳞状细胞癌(SCC，Squamous Cell Carcinoma)以及大细胞癌，大细胞癌是未分化的非小细胞肺癌。
通过再现性测定显示用于治疗肺癌的培美曲塞(pemetrexed)和吉非替尼(gefitinib)对于不同的组织学类型具有不同的效果。
在该研究中，区分鳞状细胞癌和腺癌是格外重要的。
同时，患有鳞状细胞癌并使用培美曲塞进行治疗的病人，其预后比使用安慰剂治疗的病人更为不良。
鉴于上述调查结果，在国际会议上已经讨论了用高灵敏度和高特异性的方法来方便地测定(区分)鳞状细胞癌和腺癌的必要性。
非专利文件1公开了免疫组化法测定肺癌的方法，包括：第一步，使用甲状腺转录因子1(TTF-1，Thyroid Transcription Factor 1)、天冬氨酸蛋白酶A(Napsin-A)以及p63来测定(区分)高级神经内分泌肿瘤、腺癌以及鳞状细胞癌；其中，TTF-1是在甲状腺和肺中特异性表达的转录因子，Napsin-A是初级肺腺癌的特异性标记，p63是肿瘤抑制蛋白；第二步，使用细胞角蛋白18(CK18)来测定(区分)大细胞神经内分泌癌(LCNEC，Large Cell NeuroendocrineCarcinoma)(作为高级神经内分泌肿瘤)和小细胞癌。
角蛋白是上皮细胞的骨架蛋白，且已知的角蛋白已经有20种。
比如，使用细胞角蛋白7(CK7)和细胞角蛋白20(CK20)的染色特性来测定肿瘤细胞。
然而，因为CK18对于腺癌和鳞状细胞癌都是阳性的，所以不合适作鳞状细胞癌的标记物。
此外，在鳞状细胞癌中p63的阳性表达率不是100％。
因此希望得到一种用高灵敏度和高特异性的方法，用于方便地测定(区分)鳞状细胞癌和腺癌。
非专利文献1：日本临床细胞学会杂志，Vol.47No.2，pp.146-147(2008)
发明内容
本发明要解决的问题
本发明的一个目的是提供一种用于测定癌症的组织学类型的抗体鸡尾酒以及使用该抗体鸡尾酒进行测定的方法。
本发明的另一个目的是提供一种测定试剂盒。
解决问题的手段方式
本发明涉及的抗体鸡尾酒是用于测定癌症组织学类型的抗体鸡尾酒。该抗体鸡尾酒是由与各组织学类型中定位于细胞质的表达因子有抗原抗体反应的抗体和与各组织学类型中定位于细胞核的表达因子有抗原抗体反应的抗体组合而成。本发明通过混合与细胞质中的肿瘤标记物有特异性抗原抗体反应的抗体和与细胞核中的肿瘤标记物有特异性抗原抗体反应的抗体，来提供适合于测定肺癌组织学类型的肿瘤标记物。
具体地，本发明涉及的抗体鸡尾酒被用于测定肺癌的组织学类型，该抗体鸡尾酒是由ADC抗体鸡尾酒和SCC抗体鸡尾酒组合使用，其中ADC抗体鸡尾酒与定位于腺癌细胞质中的Napsin-A和定位于这种腺癌细胞核中的TTF-1有抗原抗体反应，SCC抗体鸡尾酒与定位于鳞状细胞癌细胞质中的角蛋白14(CK14)和定位于这种鳞状细胞癌细胞核中的p63有抗原抗体反应。
其中，ADC抗体鸡尾酒用于显示出腺癌(ADC)的标记物。
并且，SCC抗体鸡尾酒用于显示出鳞状细胞癌(SCC)的标记物。
一种用于测定非小细胞肺癌组织学类型的试剂盒可以包括：ADC抗体鸡尾酒、SCC抗体鸡尾酒以及使用所述抗体进行免疫组化分析的试剂，进一步还包括腺癌的测定对照和鳞状细胞癌的测定对照。
本发明涉及的癌瘤组织学类型的测试方法是使用权利要求1中所记载的抗体鸡尾酒来测定非小细胞肺癌组织学类型的方法，其中，与ADC抗体鸡尾酒反应呈阳性的肿瘤测定为腺癌，而与SCC抗体鸡尾酒反应呈阳性的肿瘤测定为鳞状细胞癌。
进一步地，当肿瘤与ADC抗体鸡尾酒和SCC抗体鸡尾酒反应都呈阴性时，使用CK7对其进行免疫组化分析，当测定该肿瘤呈阳性时，则确定该肿瘤为腺癌。
以下详细说明该测定过程。首先，对于腺癌，使用TTF-1和Napsin-A抗体鸡尾酒(ADC抗体鸡尾酒)检测，具有TTF-1阳性(细胞核阳性)或Napsin-A阳性(细胞质弥漫性阳性)的肿瘤被认为是腺癌。对于鳞状细胞癌，进行上述免疫组化分析(下文称为“免疫染色”)时，其结果是阴性的。
其次，使用p63和CK14抗体鸡尾酒(SCC抗体鸡尾酒)检测，具有p63免疫染色阳性(核内弥散性阳性)和角蛋白免疫染色阳性(细胞质阳性)的肿瘤，被认为是鳞状细胞癌。
腺癌的测定中，没有与p63和CK14的抗体鸡尾酒的免疫染色。
以下详细说明本发明。
根据本发明，用于抗体鸡尾酒的抗体分别是TTF-1、Napsin-A、p63及CK14的抗体。对抗体的类型(比如，免疫球蛋白G(IgG)或免疫球蛋白M(IgM))和来源(比如，小鼠、兔子、山羊或绵羊)不进行限定。
在上文中，优选使用单克隆抗体。在可以特异性检测出TTF-1、Napsin-A、p63和CK14的条件下，也可以使用寡克隆抗体(几种到几十种抗体的鸡尾酒)或多克隆抗体。
也可以使用抗体片段(比如，Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、dsFv抗体等)。
上述抗体可以是商品，或者可以通过诸如免疫学方法或者噬菌体展示法这些已知的方法来制备。
当使用本发明中的抗体鸡尾酒来测定(区分)鳞状细胞癌和腺癌时，可使用从活体处收集来的细胞/组织制备样品，且用一般用于病理诊断的免疫组化法来分析该样品。
比如，样品可以是通过切割包埋有从活体处收集来的细胞/组织的石蜡块而得到的薄切片，由其中包埋有从活体处收集来的细胞/组织的石蜡块制备的细胞/组织微阵列薄片等。
本发明所使用的免疫染色可以采用免疫组化技术进行(比如，取样→样品制备→抗原抗体反应→可视化)。
优选地，抗原抗体反应和可视化使用酶标抗体法来实现。
酶标抗体法的标准实验方案是众所周知的，可以参照《酶标记抗体法，修订第3版》(渡边庆一、中根一穗编辑，学祭企画出版)。
下面对免疫组化的免疫染色方法和过程的例子进行描述。
(1)固定和石蜡包埋
用福尔马林、多聚甲醛等固定从活体(进行尸检的尸体)收集来的组织。
然后，对该组织进行石蜡包埋。
一般地，用酒精对组织进行脱水，然后用二甲苯处理，最后包埋于石蜡中。
切割包埋于石蜡中的样品至所需厚度(比如，3～5μm)，并将其涂覆在载玻片上。
需要说明的是，也可以使用冷冻样品来代替石蜡包埋的样品。
(2)脱蜡
通常，用二甲苯、酒精及纯净水按顺序处理样品。
(3)预处理(抗原激活)
为了激活抗原，可选择地进行酶处理、热处理和/或压力处理。
(4)内源性过氧化物酶的去除
在使用过氧化物酶作为染色的标记物时，用双氧水处理来阻断内源性过氧化物酶的活性。
(5)抑制非特异性反应
用牛血清白蛋白溶液(比如，1％的溶液)处理几分钟到几十分钟来抑制非特异性反应。
当使用含有牛血清白蛋白的抗体溶液来进行随后的初步抗体反应时，该步骤可以省略。
(6)初级抗体反应
将稀释到适当浓度的抗体滴到载玻片上的样品上，使其反应几十分钟到几个小时。
反应完成后，用适量的缓冲剂(比如磷酸盐缓冲剂)洗涤该样品。
(7)添加标记试剂
通常，过氧化物酶作为标记物使用。
将与过氧化物酶结合的二抗滴到载玻片上的样品上，使其反应几十分钟到几个小时。
反应完成后，用适量的缓冲剂(比如磷酸盐缓冲剂)洗涤样品。
(8)显色反应
将DAB(3，3’-二氨基联苯胺(diaminobenzidine))溶于三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液中。
然后向该溶液中加入双氧水。
用于显色反应的最终溶液对样品渗透数分钟(比如，5分钟)，进行显色。
显色后，用自来水充分洗涤以去除DAB。
(9)脱水、透明、封片
使用酒精对样品进行脱水，用二甲苯进行透明，然后用合成树脂、甘油、树胶等进行封片。
根据本发明所涉及的抗体鸡尾酒，其使用实施例的过程描述如下。
(1)提供细胞/组织样品(在下文中称为“样品”)，其从石蜡块或阵列薄片切割得到。
(2)用TTF-1和Napsin-A的抗体鸡尾酒对样品进行免疫染色。
(3)观察免疫染色的样品，TTF-1为阳性(细胞核阳性)和/或Napsin-A阳性(细胞质弥漫性阳性)的肿瘤被测定为腺癌。
(4)然后用p63和CK14的抗体鸡尾酒对样品进行免疫染色。
(5)观察免疫染色的样品，p63为阳性(即，细胞核弥漫性染色)和CK14为阳性(即，细胞质染色)的肿瘤被测定为鳞状细胞癌。
进一步，作为本发明方法的第3步，可以使用作为辅助腺癌标记的角蛋白7(CK7)抗体。
本发明方法的试剂盒包括以下的抗体鸡尾酒：
(a)TTF-1和Napsin-A的ADC抗体鸡尾酒；
(b)p63和CK14的SCC抗体鸡尾酒。
比如，ADC鸡尾酒和SCC鸡尾酒可以是冻干的，或者是含有ADC鸡尾酒或SCC鸡尾酒的溶液。从方便地角度来看，优选的，是使用溶液。
比如，上述试剂盒也可以包括抗原激活液、洗涤液、封闭液、缓冲剂、染色液、标记的二抗、反应底物、对照载片等等。
发明效果
p63对鳞状细胞癌的阳性表达率不是100％，可以通过使用含有抗-p63的抗体和抗-CK14的抗体(以辅助抗-p63抗体)的抗体鸡尾酒来区别非鳞状上皮NSCLC和鳞状上皮NSCLC，其精确度提高到近100％。
此外，根据本发明的方法可以简化免疫染色方法和病理诊断的测定。
附图说明
图1示出了与肿瘤候选标记有关的鳞状细胞癌和腺癌病理样品的免疫染色图；
图2示出了使用抗体鸡尾酒的免疫染色方法及该方法的灵敏度，以及对染色结果的评估方法；
图3示意性示出了用于鳞状细胞癌和腺癌的测定/筛选的算法；
图4示出了使用非小细胞肺癌组织阵列得到的ADC鸡尾酒的验证结果；
图5示出了使用非小细胞肺癌组织阵列得到的SCC鸡尾酒的验证结果；
图6示出了第2步中SCC鸡尾酒的验证结果；
图7示出了对ADC鸡尾酒和SCC鸡尾酒都为阴性的病例。
具体实施方式
实施例1
1、对非小细胞肺癌的鳞状细胞癌和腺癌的特异性免疫组化标记的选择
(1)表1所示的候选标记用于对鳞状细胞癌(5个病例)和腺癌(7个病例)进行测验，选择角蛋白7(CK7)、角蛋白14(CK14)、Napsin-A、TTF-1、p63作为抗体鸡尾酒(见图1)的候选标记。
表1
  候选标记   位置   抗体   克隆   制造商
  CK5/6   细胞质   小鼠单克隆   D5/16B4   Dako公司
  CK7   细胞质   小鼠单克隆   K72   Bio SB公司
  CK8/18   细胞质   小鼠单克隆   B22.1&B23.1   Bio SB公司
  CK14   细胞质   小鼠单克隆   LL002   Novocastra公司
  CK17   细胞质   小鼠单克隆   E3   Novocastra公司
  Napsin-A   细胞质   兔多克隆   IBL公司
  TTF-1   细胞核   小鼠单克隆   SPT24   Novocastra公司
  P63   细胞核   小鼠单克隆   4A4   Dako公司
研究定位于细胞质的标记物和定位与细胞核的标记物的组合，以充分利用每种抗体的特异性及其互补的反应性。
结果如图1所示，对腺癌呈阳性并且对鳞状细胞癌呈阴性的腺癌标记组合(ADC鸡尾酒)为细胞质中的Napsin-A和细胞核中的TTF-1的组合；对腺癌呈阴性并且对鳞状细胞癌呈阳性的鳞状细胞癌标记组合(SCC鸡尾酒)为细胞质中的CK14和细胞核中的p63的组合。
2、用于鳞状细胞癌和腺癌的抗体鸡尾酒
研究和优化抗原激活方法、繁琐处理的简化以及各种抗体的浓度和混合比，使各种候选抗体鸡尾酒的特异性和反应性最大限度的发挥作用。
如图2所示，根据抗体鸡尾酒的灵敏性和反应性来确定最优的免疫染色方法和染色结果评估方法。
(1)使用各种抗体鸡尾酒的免疫染色法的验证及其有效性的确认
通过选择富山大学医院病理科确诊的15个鳞状细胞癌病例和15个腺癌病例，用以制备非小细胞肺癌组织阵列(见表2)，用该组织阵列来验证抗体鸡尾酒的免疫染色方法。
在表2中，左半部分(列0.000～6.000)表示鳞状细胞癌，右半部分(列9.000～15.000)表示腺癌。
表2
  0.000   3.000   6.000   9.000   12.000   15.000
  0.000   03-0244-19   02-2468-17   00-2098-3   01-1518-5   01-1187-4   98-3836
  3.000   03-0845-15   01-3517-15   00-1615-3   00-3062   00-3083-1   97-2803
  6.000   03-1050-9   00-3577-1   00-0502-3   04-2931-10   02-2136-12   98-3350
  9.000   02-0213-2   00-3005-14   99-1679-3   03-2781-9   03-2835-7   98-2665
  12.000   02-12724-14   00-2416   99-745   00-3363-4   03-06468   97-3353
(2)测定/筛选鳞状细胞癌和腺癌的算法(图3)
在测定/筛选鳞状细胞癌和腺癌的算法中，第一步：使用ADC鸡尾酒进行免疫染色，测定呈阳性的病例为非鳞状细胞癌(即腺癌)；第2步：使用SCC鸡尾酒对在第一步中测定为阴性的病例进行免疫染色，在该步骤中，测定呈阳性的病例为鳞状细胞癌。进一步地，对用ADC鸡尾酒和SCC鸡尾酒测定均呈阴性的病例，使用辅助腺癌标记CK7进行第3步免疫染色。在第三步中测定呈阳性的病例为腺癌，测定呈阴性的病例为其它罕见的组织学类型的癌。并且测定标准是10％以上的肿瘤细胞的细胞质或细胞核染色呈阳性，则被认为呈阳性。
3、用非小细胞肺癌组织阵列验证抗体鸡尾酒的结果
(1)在第一步骤中，使用ADC鸡尾酒进行反应(其中1例，因为没有收集到足够量的肿瘤细胞，这里不作研究)，29个病例中右半部分的15个腺癌病例中有13个病例被测定为阳性(图4)。
图4中，右半部分的腺癌病例中有13个病例被测定为阳性。
根据上述结果，对在第一步中测定呈阴性的所有病例(图5中的16个病例)使用SCC鸡尾酒反应进行研究。
图5中，左半部分的14个鳞状细胞癌病例和右半部分的2个腺癌病例呈阴性。
(2)在第二步中，与SCC鸡尾酒反应，其中ADC鸡尾酒测定呈阴性的16个病例中有14个病例被测定呈阳性(图6)。
用ADC鸡尾酒和SCC鸡尾酒测定均呈阴性的病例有2个(图7)。
上述2个病例中，有一个病例通过苏木精-伊红(HE)染色复查的形态学重新测定，明显测定其为腺癌，并且用辅助腺癌标记的CK7也测定该病例呈阳性。
4、对用组织阵列验证的讨论
在使用ADC抗体鸡尾酒和SCC抗体鸡尾酒反应的讨论结果中，15个腺癌病例中有一个病例(ID：97-3353)对ADC抗体鸡尾酒反应呈阴性，对SCC抗体鸡尾酒反应呈阳性。
并且，在14个鳞状细胞癌病例中有一个病例(ID：01-3517-15)是对ADC抗体鸡尾酒和SCC抗体鸡尾酒反应均呈阴性。
为了确认上述结果，根据其它的标记物的反应性和HE染色，进行重新测定。结果是，病例97-3353先前被诊断为腺癌，经重新测定为罕见的基底细胞样鳞状细胞癌。
另一方面，病例01-3517-15对角蛋白标记物Pan-CK和CK8/18反应呈阳性，显示出其为腺上皮起源，通过HE染色形态学重新测定研究结果，且基于肿瘤细胞的大小等测定该病例为大细胞癌。
对上述罕见的基底细胞样鳞状细胞癌和上述大细胞癌2个病例从新进行归类，所研究的病例是14个腺癌病例、14个鳞状细胞癌病例、一个其它癌(大细胞癌)病例，合计29个病例。
最后，对于ADC抗体鸡尾酒，腺癌(14个病例)的特异性是100％，灵敏度为92％。
当对14个病例用SCC抗体鸡尾酒时，特异性是100％，灵敏度为100％。
工业实用性
根据本发明，当测定非小细胞肺癌(NSCLC)的组织学类型(鳞状细胞癌或腺癌)时，用ADC抗体鸡尾酒和SCC抗体鸡尾酒的免疫组化法示出了极佳的特异性和灵敏度，且对病理诊断也非常有用。

Claims (5)

1.一种用于测定肺癌的组织学类型的抗体鸡尾酒，其特征在于，
该抗体鸡尾酒包括：与腺癌细胞质中的天冬氨酸蛋白酶A(Napsin-A)和腺癌细胞核中的TTF-1有抗原抗体反应的ADC抗体鸡尾酒，和与鳞状细胞癌细胞质中的CK14和鳞状细胞癌细胞核中的p63有抗原抗体反应的SCC抗体鸡尾酒。
2.一种测定非小细胞肺癌组织学类型的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：ADC抗体鸡尾酒、SCC抗体鸡尾酒以及使用所述抗体进行免疫组化分析的试剂。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒进一步包括：
腺癌的测定对照和鳞状细胞癌的测定对照。
4.一种使用根据权利要求1中所述的抗体鸡尾酒来测定非小细胞肺癌的组织学类型的方法，其特征在于，该方法包括：
与ADC抗体鸡尾酒反应呈阳性的肿瘤测定为腺癌；
与SCC抗体鸡尾酒反应呈阳性的肿瘤测定为鳞状细胞癌。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，该方法进一步包括：
与ADC抗体鸡尾酒反应呈阴性且与SCC抗体鸡尾酒反应也呈阴性的肿瘤，使用CK7进行免疫组化分析，当测定该肿瘤呈阳性时，确定该肿瘤为腺癌。
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