KR20200020906A

KR20200020906A - 고형종양 진단을 위한 바이오마커 절대 정량 방법 및 장치

Info

Publication number: KR20200020906A
Application number: KR1020207002341A
Authority: KR
Inventors: 젠디 장
Original assignee: 옌타이 콴티시젼 다이애그노틱스 인크.
Priority date: 2017-06-29
Filing date: 2018-06-28
Publication date: 2020-02-26
Also published as: CA3101968A1; CN110753845A; WO2019006156A1; US10788484B2; KR102502745B1; EP3646328A1; SG11201908865WA; JP2020526747A; JP7194128B2; US20190004037A1; US20210011010A1; EP3646328A4; CN110753845B

Abstract

본 발명은 샘플의 정량 분석 방법을 제공한다. 상기 방법은, 상기 샘플의 하나 또는 복수의 특징을 나타내는 단일 마커를 제공하는 단계(a) - 상기 샘플은 상기 마커의 단일 단위의 군체를 포함함 - ; 점블럿 분석으로 마커를 검출하는 단계(b), 그 정량 결과는 샘플 중 마커의 단일 단위의 군체의 절대량이고, 샘플 부피 또는 샘플 중량을 통해 표준화됨 - ; 및 마커의 정량 결과에 기반하여 샘플의 하나 또는 복수의 특징의 객관성 측정을 획득하는 단계(c)를 포함한다. 이 밖에 참조 데이터 베이스 및 환자의 암을 진단하기 위한 상기 참조 데이터 베이스의 사용 방법을 더 개시한다.

Description

고형종양 진단을 위한 바이오마커 절대 정량 방법 및 장치

관련 출원

본원 발명의 관련 쾌속 PCT는 2017년 6월 29일에 제출한 미국 임시 출원 62/526425호의 우선권을 주장하는 바, 상기 개시된 내용은 참조로서 본원 발명에 인용된다. 이 밖에, 2015년 5월 26일에 제출한 미국 특허 출원 14/721205 및 2017년 2월 15일에 제출한 미국 특허 출원 15/433586에 개시된 모든 내용도 참조로서 본원 발명에 인용된다.

본 발명은 면역블러팅 분석 방법을 이용하여 임상 진단을 목적으로 하여 바이오마커(biomarker)에 대해 조직 레벨에서 정량 검출을 진행하는 방법 및 장치에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 정량 점블럿(QDB: quantitative dot blot) 분석을 이용하여 바이오마커의 발현 수준을 검출하고 참조 데이터 베이스 분석과 결부시켜 고형종향에 대해 진단 및 예후를 제공하는 방법 및 장치에 관한 것이다.

단백질 분석은 현대 생물학 연구의 중요한 기초이다. 이러한 기술은 항원-항체 상호 작용의 원리에 기반하여 다양한 의료 또는 실험 조건 하에서의 표적 항원의 발현 수준을 측정하는 것이다. 항원은 인체에 주입될 경우 면역 계통이 항체를 생성하도록 유발할 수 있는 외래 분자로 정의된다. 항체는 특정 한원에 대한 고특이성으로 인해, 임상, 제약 및 생물 의학 연구에 있어서 하나의 유력한 수단으로 사용된다.

항원은 화합물, 폴리펩티드, 단백질, RNA 분자, DNA 분자, 세포(원 위치에서 방출한 단백질) 또는 바이러스 입자(원 위치에서 방출한 단백질)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 항원 분자는 전체 또는 부분적으로 당나귀, 염소, 토끼 등 숙주 동물 체내에 인입되어 표적 항원에 대한 대량의 항체를 생성할 수 있다. 이 밖에, 인입된 항원 또는 항원의 일부분은 하나 또는 복수의 항원 결정기를 구비할 수 있으며, 이에 따라, 항원 결정기 개수의 변화에 따라 숙주 체내에서 표적 항원에 대한 하나 또는 복수의 특이성 항체를 생성할 수 있다.

하나의 전형적인 면역 검출 과정은 3개의 주요 단계로 나뉠 수 있다. 첫 번째 단계에서, 제조된 표적 항원이 함유된 샘플을 먼저 질산 셀룰로오스 막, PVDF 막, 또는 결합 단백질 능력을 구비하는 다공판, 면역 조직화(IHC) 중의 슬라이드 글라스 및 QDB 플레이트 중의 막과 같은 고상 담체의 표면에 전이시킨다. 두 번째 단계에서, 표적 항원 항체 복합물(예를 들어, 면역 복합물)을 형성하여 표기하는데, 이러한 과정은 블로킹, 배양 및 세척 서브 단계를 더 포함한다. 블로킹 서브 단계에서, 막의 비특이성 단백질 결합 사이트는 블로킹 버퍼(blocking buffer)로 처리하여 항체가 막에 비특이적으로 결합되는 것을 방지한다. 면역 조직화의 일부 상황에서, 블로킹 버퍼를 사용하기 전에, 추가적으로 슬라이드 글라스 상의 조직에 대해 절편(탈랍 또는 항원 복원) 처리를 진행해야 한다. 블로킹을 거친 후, 배양 서브 단계에서, 막과 표적 항원에 대한 항체를 함께 배양함으로써, 막에서 항원 항체 복합물을 형성하고, 표적 항원과 결합되지 않은 항체는 이 과정에서 세척되어 제거된다. 여기서 사용되는 항체는 일반적으로 구매 가능하고 미리 표기된 항체이다. 물론, 하나의 표기 서브 단계를 통해 원 위치에서 표기를 진행할 수도 있다. 임의의 상황에서 사용되는 항체는 응당 표기되어야 하고 리포터 효소(reporter enzyme)와 같은 리포터(reporter)를 통해 직접 표기하거나, 리포터에 의해 표기된 제2 항체를 통해 간접적으로 표기한다.

세 번째 단계에서 검출한다. 리포터 효소에 의해 전송된 신호를 검출하여 기록함으로써, 막과 결합된 면역 복합물의 수량 또는 질량 관련 정보를 제공한다.

상이한 표기 방법은 상응하게 상이한 검출 방법이 필요하다. 예를 들어, 세 번째 단계의 검출 반응은 목측한 컬러 변화이거나 스캐너, X-레이 필름 또는 마이크로플레이트 리더를 통해 검출된 화학 발광 신호일 수 있다. 검출 과정에서 항체는 형광을 통해 표기될 수도 있으며, 스캐너를 이용하여 검출한다.

단백질 분석의 다양한 기술은 모두 이러한 전형적인 면역 검출법의 변형이다. 이러한 기술은 웨스턴 블롯 분석 기술, 점상 면역 블롯 분석 기술, 면역 조직화(IHC) 기술, 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA) 기술, 역상 단백질 마이크로어레이(reverse phase protein microarray: RPPM) 기술 및 새로 개발된 정량 점블럿 분석(QDB) 기술 및 Zestern 기술을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

면역 조직화 분석에서, 조직 블록은 먼저 파라핀으로 블록을 포매하거나 블록을 냉동시키는 방식으로 처리하고, 소정 두께의 조각으로 절단하여 슬라이드 글라스에 놓는다. 다음, 조각을 전형적인 면역 검출 과정으로 처리하여 검출 항체 및 표적 항원이 슬라이드 글라스에서 면역 복합물을 형성하도록 한다. 병리 학자들은 상기 미리 표기된 항체를 이용하여 현미경으로 슬라이드 글라스에서의 표적 항원을 검출한다. 파라핀 포매로부터 유래된 조각에 대해, 항원 항체 반응을 촉진시키기 위하여, 조각을 추가적으로 처리해야 한다. 이러한 처리는 조각에 대해 탈랍 및 항원 복원을 진행하는 것을 포함할 수 있음으로써, 항원을 노출시켜 항원 항체 반응을 진행할 수 있다.

임상 실천에서, 임상 진단 및 예후의 목적에서 고려하면, 면역 조직화 분석은 단백질 수준에서 바이오마커 발현의 변화에 대한 검출에 광범위하게 사용된다. 전형적인 바이오마커의 면역 조직화 보고는 "+" 또는 "-"로 표시되거나, "0, 1+, 2+, 3+"로 세분화된다. 예를 들어, 면역 조직화에 의한 방법 분석은 유방암 진단의 바이오마커―인간 표피 성장 인자 수용체2(Her2)의 발현 수준에 흔히 사용되어 치료 과정에 Her2 의존적 요법(Her2-dependent therapy)이 포함되는 지의 여부를 결정한다. 면역 조직화의 결과는 0 및 1+, 2+ 및 3+ 등 4개 그룹으로 나뉜다. 0그룹 및 1+ 그룹의 결과는 음성으로 인정되고, 3+ 그룹은 양성으로 인정되며, 2+ 그룹은 두가지 경우 모두인 것으로 인정된다.

염색 강도와 염색 세포 백분율을 효과적으로 반영시킬 수 있도록, 임상 분야에서 H 점수(H 지수)를 포함하는 평점 시스템을 개발하여 면역 조직화 분석에 관한 보다 많은 상세한 정보를 제공한다. 다른 경우, 염색 강도(예를 들어, 강 및 약) 및 염색 세포의 백분율을 동시에 제공할 수도 있다. 예를 들어, 결과는 "(백분율, 강도)"로 보고될 수 있다. 그러나, 이러한 결과는 본질적으로 모두 반정량의 결과이다.

면역 조직화는 보귀한 형태학 정보를 제공하였고, 사람들은 이미 대량의 노력을 투입하여 분석 절차의 표준화를 구현하였는으나, 그 결과는 여전히 정성적(qualitative)이고, 처리 과정, 시야 및 관찰자 차이 등을 포함하는 요소의 영향을 받는다. 이러한 기술은 또한 하이 스루풋 분석을 구현하기 어렵다.

면역 조직화 분석과 관련되는 불확실성은 진단 과정에서 착오가 현저히 증가되는 현상을 초래한다. 실제로, Her2의 경우, 면역 조직화 분석의 결과와 FISH(Fluorescence In Situ Hybridization technique) 기술의 결과를 비교하면 양자 사이의 불일치성은 30 %에 달한다.

면역 조직화의 분류 결과 또한 추가적인 데이터 분석에 사용하기에도 어렵다. 예를 들어, 비록 양성의 개체 환자에서 현저한 차이가 존재하나, 그들이 임상 실천에서 동일한 유형으로 귀납된다. 따라서, 면역 조직화 분석으로부터의 결과는 충분한 데이터 분석을 진행하여 사람들이 희망하는 보다 정확하고 보다 예측 가능한 진단 및 예후를 제공하기 어렵다.

사람들이 조직 레벌에서 바이오마커의 함량의 정량화 검출에 대한 시도를 통해 성공하였다. 예를 들어, 근접성 분석(proximity assay)의 Hermark 테스트에 기반하여 유방암 조직 중의 Her2 발현 수준을 정량 검출할 수 있다. 그러나, 이러한 기술에 의해 검출된 것은 유방암 환자에서 상대적인 Her2 발현 수준이다.

아울러, 사람들은 SRM-MS 질량 스펙트럼 기술을 이용하여 Her2의 절대 함량(절대 수준)을 성공적으로 검출하였다. 사람들은 동위 원소로 표기된 표준 단백질을 이용하여 Her2의 절대 함량을 검출하였고, 피험자 작업 특성(Receiving Operative Characteristics: ROC)을 이용하여 740 amole/g의 임계값을 분석하여 제안하였다.

그러나, 이러한 방법들은 모두 매우 복잡하고, 작업이 번거러우며, 대량 샘플의 하이 스루풋 분석에 적합하지 않다. 복잡한 분석 과정은 또한 작업 비용과 노동력을 증가시킨다.

반면, 최근에 개발된 QDB 방법은 하이 스루풋 처리에 적합하고 세포 또는 조직으로 제조된 복합 분해액에 적용된다. 표준 단백질을 인입할 경우, 재조합 단백질 형태든 정제 단백질 형태든 모두 이러한 방법으로 매우 간편하게 절대 정량의 방법으로 전환시켜 어느 특정된 단백질의 함량에 대해 세포 또는 조직 레벨에서 절대 정량 측정을 진행할 수 있다.

본 발명에서, 발명인은 QDB 기술을 이용하여 조직 레벨에서 바이오마커 발현 수준을 측정하여 임상 진단에 사용한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 현재 임상 진단에서 흔히 사용되는 면역 조직화 기술은 절대 정량 테스트 방법으로 전환될 수 있고, 상기 방법은 정확하고 계량화적이며 객관적이고 하이 스루풋 처리되며 보다 전면적으로 임상 진단 및 예후 에 도모하는 등 방면에 있어서 현저한 장점을 갖는다. QDB 분석에 의한 절대 데이터는 또한 대규모 방식으로 데이터 분석을 진행하여 보다 정확하고 보다 예측 가능한 임상 진단 및 예후를 제공할 수 있다.

본 발명은 조직 레벨에서 바이오마커 발현 수준을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 바이오마커의 평가는 기존의 통상적인 분류 방식이 아닌 정량 방식을 통해 진행된다.

따라서, 본 발명은 연속적인 결과를 제공하여 기존의 통상적인 불연속적인 결과를 대체한다. 따라서, 기존의 면역 조직화 및 FISH 기술과 비교 시, 본 발명은 보다 많은 기회를 제공한다.

본 발명은 샘플의 정량 분석 방법에 관한 것이다. 상기 방법은, 상기 샘플의 하나 또는 복수의 특징을 나타내는 단일 마커(marker)를 제공하는 단계(a) - 상기 샘플은 상기 마커의 단일 단위의 군체를 포함함 - ; 점블럿 분석으로 상기 마커를 검출하는 단계(b) - 그 정량 결과는 샘플 중 상기 마커의 단일 단위의 군체의 절대량이고, 샘플 부피 또는 샘플 중량을 통해 표준화됨 - ; 및 상기 마커의 정량 결과에 기반하여 샘플의 하나 또는 복수의 특징의 객관성 측정을 획득하는 단계(c)를 포함한다.

샘플은 연구 대상의 조직으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 조직은 생체검사 조직을 의미한다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 조직은 냉동 조직을 의미한다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 조직은 포르말린액으로 고정된 샘플을 의미한다. 또 다른 실시형태에서, 조직은 포르말린액으로 고정되고 파라핀으로 포매된 샘플(FFPE 샘플)을 의미한다.

연구 대상은 환자일 수 있다. 보다 구체저으로, 연구 대상은 암 환자일 수 있다.

이 밖에, 상기 방법의 단계(b)는 QDB 방법을 이용하여 상기 마커 함량을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 단계(b)는, 샘플을 결합 인자를 포함하는 용액과 함께 배양하는 단계(b1) - 상기 결합 인자는 상기 마커의 단일 단위에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 결합 인자는 점블럿 분석을 통해 정량화될 수 있음 - ; 및 결합 인자의 QDB 분석을 통해 상기 마커의 함량을 검출하는 단계(b2)를 포함할 수 있다.

결합 인자는 면역 조직화 분석을 포함한 항원 항체 상호 작용의 분석에 기반하여 검출할 수 있다. 이 밖에, 결합 인자는 유동 세포 분석 기술을 이용하여 검출할 수 있다.

바람직하게, 마커는 단백질 마커이고 결합 인자는 항체이다. 나아가, 항체는 분석물질 특정시약(ASR)급 항체 또는 체외 진단(IVD)급 항체일 수 있다.

이 밖에, 상기 방법은 마커의 정량 결과에 따라 환자에 대해 평가하는 단계(d)를 더 포함한다. 구체적으로, 단계(d)는 환자에 대해 암의 진단 및 예후를 진행하는 단계를 포함한다. 환자에 대해 암의 진단 및 예수를 진행하는 예로서, 무질병 생존율, 전반적 생존율, 위험 비율 또는 암 치료 방안 예측을 포함한다.

본 발명이 개시하는 정량 검출의 바이오마커 수준은 본 발명과 기존의 범용 방법을 비교하고 바이오마커의 절대 함량의 임상적 의미를 보다 잘 탐구할 수 있도록, 정보를 이용한 수리 분석 방법에 따라 분류할 수 있다.

본 발명의 일 실시형태는 면역 블롯 분석에 응용될 수 있다. 바이오마커의 발현 수준은 항체에 기반한 방법을 이용하여 검출할 수 있다.

항체에 기반한 방법의 선형 범위를 결정함으로써 바이오마커의 절대량이 동일한 측정에서 표준 단백질(단백질 표준품)을 이용하여 구현될 수 있도록 한다.

본 발명의 일 실시형태에서, 점상 면역 블롯 분석의 방법은 조직 레벨에서의 바이오마커의 절대 정량을 구현할 수 있다.

재조합 단백질 또는 정제 단백질을 이용하여 이미지를 기초로 하는 점상 면역 블롯 분석을 통해 단백질 표준 곡선을 결정한다. 이미지 수집 및 분석을 통해 이미지 디지털화를 구현한다.

획득된 신호로 표준 단백질 곡선을 결정한다.

FFPE 블록으로부터 추출된 전체 단백질은 점상 면역 블롯 분석에 사용될 수 있고, 획득된 신호는 상기 참조 표준 곡선을 이용하여 바이오마커의 절대 함량으로 전환시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시형태에서, 정량 점블럿 분석(QDB)은 조직 레벨에서 바이오마커의 절대 함량을 검출할 수 있다.

표준 단백질이 존재하지 않을 경우, 바이오마커의 단백질 발현량은 QDB 방법을 포함한 면역 블롯 분석 방법을 사용하여 상대적 검출을 진행할 수 있다. 분석 과정(예를 들어, 양성 및 음성 대조를 사용함)을 충분히 제어할 수만 있다면, 이러한 방법은 가치 있는 결과를 참조로서 제공할 수 있다.

QDB 분석에서, 바이오마커의 절대 함량은 이미 검증된 검출 항체를 이용하여 검출할 수 있다. 검출 항체에 대한 검증 방법은 제한되지 않는다. 항체는 웨스턴 블롯 분석 방법을 통해 검증할 수도 있고, 이전의 결과에 따라 검증할 수도 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 광범위하게 사용되는 면역 조직화 분석을 위한 항체는 QDB 분석에 직접 사용될 수 있다. 예를 들어, ASR급 항체 또는 IVD급 항체는 QDB 분석에 사용될 수 있다. 이러한 항체는 Her2 단백질에 사용되는 EP3 및 4B5 클론 항체, ki67 단백질에 사용되는 MIB1항체 및 에스트로겐 수용체 단백질(ER)에 사용되는 SP1항체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 마찬가지로, 다른 항체 검출 방법(유동 세포 분석을 포함하나 이에 한정되지 않음)에 기반한 검출 항체에 사용될 수도 있고, QDB 분석에 사용될 수도 있다.

검출 항체(항체A)는 기존의 검출 항체(항체B)와 비교 연구하여 검증할 수 있다. 2개 이상의 샘플을 동시에 항체A 및 항체B에 의해 분석하여 유사한 결과를 얻을 경우, 항체A는 검증된 것으로 인정될 수 있다.

QDB 분석에 사용되는 샘플은 냉동 조직 또는 포르말린 고정 조직 또는 포르말린으로 고정되고 파라핀으로 포매된 조직 블록(FFPE 블록)을 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 샘플은 다른 방식으로 보존된 조직을 사용하여 제조할 수 있는바, 이러한 샘플에서 항원 항체 반응을 구현할 수만 있다면 모두 가능하다.

2개 이상의 샘플로부터 유래되는 바이오마커의 절대 함량 및 이와 관련된 임상 정보는 단백질 데이터 베이스(즉, QDB 데이터 베이스)를 구축할 수 있다. QDB 데이터 베이스에 대한 수리 분석은 의료용 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, 바이오마커의 절대 함량과 무질병 생존율 사이의 가능한 연관성을 분석함으로써 환자에게 예측 가능한 임상 예후를 제공할 수 있다.

본 발명은 상기 및 기타 응용에서 적어도 부분적으로 하기와 같은 발견에 의존한다. QDB 분석의 절대성은 상이한 곳으로부터 유래되는 정보가 서로 병합되어 분석되도록 확보한다. QDB 분석에 의한 신규 정보의 지속적인 증가는 QDB 데이터 베이스의 끊임없는 성장을 확보한다. QDB 데이터 베이스에 대한 분석에 의해 획득된 정보는 환자에게 진단 및 예후의 의거를 제공한다.

단백질은 비변성(non-denatured) 방식으로 추출할 수 있거나, 가열 및/또는 변성제를 통해 추가적으로 변성시킬 수 있다. 비변성의 형태는 광의적으로 이해되어야 한다. 이는 천연적 형태일 수 있거나, 항원이 변성제(예를 들어, 디티오트레이톨(DTT) 또는 메르캅토에탄올)와 접촉되지 않거나 항원이 철저하게 변성되도록 충분하게 접촉되지 않은 변성제의 상태를 의미할 수 있다.

본 발명의 일 실시형태에서, 실험의 일치성을 확보하기 위하여, 소정량을 포함하는 항원을 작업 대조군으로 할 수 있다. 상기 항원의 절대 함량은 매 번 검출할 때마다 측정해야 하고 검출 결과에서 상기 항원 함량이 소정량의 일정 범위 내에 있을 경우에만 상기 실험이 유효한 것으로 인정된다.

QDB 분석에서, 동일한 분해액에 대해 동일한 바이오마커는 2가지 이상의 항체를 사용하여 분석할 수 있다. 이러한 항체는 바이오마커의 동일하거나 상이한 항원 결정기를 식별할 수 있다. 각각의 항체에 대해 각각 임계값을 얻을 수 있고, 이러한 임계값에 따라 샘플이 양성 또는 음성인 것을 결정할 수 있다. 2가지 이상의 항체로부터 분석하여 얻은 결론이 일치한 샘플은 음성 또는 양성으로 인정될 수 있고, 불일치한 샘플은 불명확(모호)한 것으로 결정할 수 있다.

본 발명의 일 실시형태에서, 동일한 샘플을 사용하여 2가지 이상의 바이오마커의 절대 함량을 검출할 수 있고, 이러한 검출 결과와 관련 임상 정보(무질병 생존율, 전반적 생존율, 위험 비율, 부작용, 연령, 질병의 상이한 발전기를 포함하나 이에 한정되지 않음)를 결부시켜 하나의 모드를 구축할 수 있고, 상기 모드는 진단 및 예후의 목적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시형태에서, 바이오마커의 절대 함량은 2가지 이상의 항체를 통해 검출할 수 있다. 상이한 항체를 이용하여 얻은 바이오마커의 상이한 절대 함량과 관련 임상 정보(무질병 생존율, 전반적 생존율, 위험 비율, 부작용, 연령, 질병의 상이한 발전기를 포함하나 이에 한정되지 않음)를 이용하여 각각 하나의 모드를 구축할 수 있고, 상이한 항체로부터 유래되는 상이한 모드는 항체 특이적 정보를 제공하여 진단 및 예후의 목적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에서, 환자로부터 유래되는 생체검사 조직 샘플 중의 마커의 정량 분석에 기반하여 환자에 대해 암 진단을 진행하는 참조 데이터 베이스에 관한 것이다. 상기 참조 데이터 베이스는 복수의 참조 개체 정보(reference profile)를 포함하고, 복수의 참조 개체 정보 중의 각각은, 이미 명확하게 진단된 환자의 생체검사 조직 샘플을 제공하는 단계(a); 제공된 생체검사 조직 샘플에 대해 정량 점블럿 분석을 통해 상기 마커를 검출하는 단계(b) - 정량 결과는 생체검사 조직 샘플 중 상기 마커의 절대량이고, 생체검사 조직 샘플 부피 또는 생체검사 조직 샘플 중량을 통해 표준화됨 - ; 및 상기 정량 결과를 암 환자의 이미 알고 있는 진단과 연관시켜 참조 개체 정보를 획득하는 단계(c)를 통해 획득된다.

상기 단계(b)는, 상기 생체검사 조직 샘플을 상기 마커에 특이적으로 결합되는 결합 인자를 포함하는 용액과 함께 배양하는 단계(b1); 및 상기 결합 인자의 QDB 분석을 통해 상기 마커를 검출하는 단계(b2)를 포함할 수 있다.

상기 참조 데이터 베이스에서, 바람직하게, 바이오마커는 단백질 마커이고 결합 인자는 항체이다. 참조 데이터 베이스는 바람직하게 연산 메모리 칩(computational memeory chip)에 저장된다.

본 발명의 또 다른 양태는 환자에 대해 종양 진단을 진행하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 상기 참조 데이터 베이스를 제공하는 단계(i); 환자의 생체검사 조직 샘플을 획득하는 단계(ii); 점상 면역 블롯 분석의 방법으로 환자의 생체검사 조직에서의 상기 참조 데이터 베이스에 사용되는 상기 마커의 함량을 검출하는 단계(iii) - 검출된 결과는 상기 생체검사 조직 샘플에서의 상기 마커의 절대 함량임 - ; 상기 생체검사 조직에서의 상기 마커의 정량 결과를 상기 참조 데이터 베이스에 저장된 각각의 참조 개체 정보와 비교하는 단계(iv); 및 상기 참조 데이터 베이스에서 상기 생체검사 조직의 상기 마커의 정량 결과와 가장 매칭되는 참조 개체 정보를 조회하고, 상기 참조 개체 정보와 연관되는 이미 알고 있는 진단 결과를 출력하는 단계(v)를 포함한다.

상기 방법에서, 진단하고자 하는 종양은 고형종양이다.

본 발명의 또 다른 양태는 환자에 대해 종양 진단을 진행할 수 있는 장치이다. 상기 장치는 상기 참조 데이터 베이스를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태는 환자에 대해 종양 진단을 진행할 수 있는 키트이다. 상기 키트는 상기 참조 데이터 베이스를 구비한다. 또는, 상기 키트는 네트워클 통해 상기 참조 데이터 베이스에 액세스하도록 구성된 하나의 유닛을 포함할 수도 있다.

상기 발명의 상세한 내용은 도면 및 아래의 설명에 반영될 것이다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 장점은 당해 기술분야의 통상의 기술자가 이러한 도면, 설명 및 첨부된 청구범위를 열독시 자명한 것이다.

도 1(도 1A 내지 도 1D)는 점상 면역 블럿 분석을 통해 EP3항체를 이용하여 Her2의 절대 함량을 검출하는 것을 나타낸다. 정제된 Her2 단백질은 조제량 곡선을 결정한다. 획득한 이미지는 Li-Cor 회사의 ImageQuant 소프트웨어를 이용하여 숫자로 전환시킨다. 표준 단백질을 이용하여 결정된 조제량 곡선은 환자 샘플로부터 획득된 점상 면역 분석 이미지를 이러한 환자 Her2의 절대 함량으로 전환시킨다.
도 2(도 2A 내지 도 2H)는 Her2, Ki67 및 ER에 대해 이미 알고 있는 3개의 면역 조지화 분석 항체를 이용하여 QDB 분석을 통해 상이한 암 조직에서의 이들의 선형 구간을 각각 결정하는 것을 나타낸다. her2, Ki67 및 ER의 재조합 단백질은 표준 단백질로 사용된다. 이러한 항체들은 QDB 분석을 통해 이러한 암 조직에서의 이들의 조제량 곡선을 각각 결정한다.
도 3(도 3A 내지 도 3D)은 QDB 분석을 적용하여 검출된 FFPE샘플로부터 추출한 유방암 조직에서의 Her2, Ki67 및 ER의 절대 함량, 및 냉동 위 조직에서의 Her2의 절대 함량을 나타낸다. 전술한 결과는 각자의 면역 조직화 결과에 기반하여 추가적으로 그룹화한다.
도 4(도 4A내지 도 4D)는 어떻게 QDB 방법을 이용하여 얻은 Her2의 절대 함량 및 현지 병원에서 제공한 면역 조직화 정보에 따라 임계값을 확정하고 연속적 데이터를 분류 결과로 전환시키는지를 나타낸다.
도 5는 어떻게 바이오마커의 절대 함량을 이용하여 임상 데이터를 분석할 것인가를 나타낸다. 상기 상황 하에, Her2의 절대 함량과 유방암 환자의 조직학 등급 사이의 잠재적 관계를 조사하였다.

본 발명의 방법을 설명하기 전에, 본 발명은 상술한 이러한 방법에 한정되지 않고 구체적인 응용에서 변화가 존재함을 유의해야 한다. 본 명세서에 기재된 용어는 단지 특정 실시형태를 설명하기 위한 목적으로, 이러한 실시형태에 한정되지 않고, 본 발명의 보호범위는 첨부된 청구범위에만 한정됨을 이해할 것이다.

달리 설명되지 않은 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 과학 기술 용어들은 당해 기술분야의 통상의 기술자가 이해한 것과 동일하다.

본 발명이 제공하는 방법은 주로 임상 진단을 목적으로 한다. 따라서, 본 명세서에서, "결정(determining)", "검출(measuring)", "평가(assessing)" 및 "시험(assaying)"은 혼용될 수 있고, 정성 및 정량인 2가지 검출 방식을 포함한다. 이러한 용어들은 정량을 의미할 수도 있고, 반정량을 의미할 수도 있으므로, "결정(determining)" 및 "시험(assaying)" 및 "검출(measuring)" 등 이와 유사한 설명들은 혼용될 수 있다. 정량 검출을 설명해야 할 경우, 시험물에 대한 "양을 검출/검출량” 또는 유사한 설명 문구를 사용해야 한다. 정량 또는 반정량을 설명해야 할 경우, 시험물에 대한 "수준을 검출” 또는 "검정(detecting)"하여 대상(시험물)을 분석할 수 있다.

본 명세서와 관련된 "정량적” 시험은 샘플에서 시험물과 참조물(대조)의 상대 함량 정보를 제공하고, 일반적으로 연속적인 숫자로 나타나며, 여기서 "0"은 시험물의 양이 검출 범위보다 낮은 것으로 정의된다. "반정량” 시험은 물질의 양 또는 대략적인 양을 제공하고, 정성과 정량 사이를 의미한다. 여기서 "0"은 시험물의 양이 검출 범위보다 낮은 것으로 정의된다.

본 명세서의 "진단”은 분자 또는 병리 상태, 질병 및 증상에 대한 감별을 의미하는데, 예를 들어, 유방암 또는 다른 암의 분자 아형(subtype)을 감별하는 것이다.

“예후”는 암에 의해 유발될 수 있는 사망 또는 병세 발전 가능성에 대한 예측을 의미하고, 종양 질병(예를 들어, 유방암)의 재발률, 확산 가능성 및 약물 내성에 대한 예측을 포함한다.

“치료효과 예측”은 치료적 개입 결과에 대한 예측을 의미한다.

“실험 대상(subject)", "숙주(host)", "환자” 및 "개체”는 본 명세서에서 혼용될 수 있고, 진단 또는 치료가 필요한 임의의 포유류(특히, 인간) 대상을 의미한다.

QDB 정량 검출

조직 레벨에서 하나의 바이오마커의 발현 수준에 대한 정량 검출은 면역 블럿 분석 방법을 통해 구현할 수 있다. 면역 블럿 분석 방법은 그의 가장 광범위한 외연을 포함한다. 분석 과정에서 항체 및 언급된 고상에 기반하면, 면역 블럿 분석 과정인 것으로 인정될 수 있다. 상기 고상은 막, ELISA 플레이트, QDB 플레이트(즉, QDB 분석에 사용되는 플레이트)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

항체 특이성의 검증 방법에 대해 한정하지 않는다. 해당 항원 결정기가 선형일 경우, 항체는 웨스턴 블럿 분석을 통해 검증할 수 있고, 이전의 경험에 따라 검증할 수도 있다. 예를 들어, 수많은 항체들이 임상 진단 및 예후에 광범위하게 응용된다. 이러한 항체들은 ASR항체와 IVD항체, 면역 조직화 및 유동 세포 분석에 사용될 수 있는 임상에서 허용 가능한 다른 항체들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 항체들은 모두 추가적으로 검증할 필요없이 QDB 분석에 바로 사용될 수 있다.

검출 항체에 대해, 이미 알고 있는 항체를 통해 검증할 수도 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 검출 항체는 2개 이상의 샘플의 분석에 사용될 수 있고, 그 결과와 이미 알고 있는 항체(예를 들어, Roche 회사의 Her2 단백질에 사용되는 4B5 클론)로부터의 결과를 비교할 수 있다. 이 2개의 항체의 일치율이 일정한 정도를 초과할 경우, 상기 항체는 검증을 거친 항체인 것으로 인정될 수 있다.

본 발명의 일 실시형태에서, 바이오마커의 발현 수준은 전형적인 면역 블럿 분석 방법을 통해 검출할 수 있다. 이러한 방법에는, (1) 검증을 거친 항체; (2) 표준 단백질을 이용하여 구축한 조제량 곡선인 등 2가지 특징이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 실시형태에서, 바이오마커의 발현 수준은 전형적인 면역 블럿 분석 방법을 통해 검출할 수 있다. 이러한 방법에는, (1) 검증을 거친 항체; (2) 표준 단백질을 이용하여 구축한 조제량 곡선; (3) 검출 과정에서 막에서의 면역 복합물을 단독으로 검출하고 인접한 유닛의 간섭을 받지 않는 등 3가지 특징이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 실시형태에서, 시험에서 참조 샘플을 포함할 수 있다. 동일한 면역 블럿 분석에서, 참조 샘플은 표적 샘플과 함께 처리된다. 참조 샘플의 양과 표적 샘플의 양을 비교한다. 표적 샘플 중 바이오마커의 함량이 참조 샘플 중 바이오마커의 함량보다 높으면, 타겟 샘플이 양성인 것으로 결정되고, 이와 반대이면, 음성인 것으로 결정된다.

본 발명의 다른 일 실시형태에서, 실험에서 2가지 이상의 참조 샘플을 포함할 수 있다. 참조 샘플은 표적 샘플과 함께 하나의 면역 블럿 분석 과정에서 처리되고, 참조 샘플의 결과는 샘플 등급순 결정에 사용되며, 이러한 참조 샘플을 참조하여 표적 샘플 결과를 분류한다. 예를 들어, 참조 샘플1 및 참조 샘플2가 각각 1+ 및 2+ 상한을 정의하고 표적 샘플의 양이 참조 샘플1+과 참조 샘플2+ 사이에 있을 경우, 표적 샘플은 2+로 정의된다.

본 발명의 일 실시형태에서, 바이오마커의 발현 수준은 점상 면역 블럿 분석을 통해 정량 검출할 수 있다. 점상 면역 블럿 분석은, (1) 검증을 거친 항체; (b) 항체가 한 가지 유형의 샘플 분석에 사용될 시 결정된 선형 범위(linear range); (c) 막에서의 면역 복합물이 이미지의 형태로 검출됨; (d) 이미지를 디지털화하는 등 특징들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 다른 일 실시형태에서, 바이오마커의 발현 수준은 QDB 방법을 통해 정량 검출할 수 있다. QDB 방법은, (1) 검증을 거친 항체; (b) 항체가 한 가지 유형의 샘플 분석에 사용될 시 결정된 선형 범위; (c) 검출 과정에서 막에서의 면역 복합물을 단독으로 검출하고 인접한 유닛의 간섭을 받지 않는 등 특징들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

기존의 범용 면역 조직화 분석에 의한 분류 결과는 응당 그의 가장 광범위한 외연을 포함해야 한다. 이러한 결과는 바이너리(양성 또는 음성), 등급(0, 1+, 2+, 3+ 또는 강, 중, 약), 백분율에 기반하거나 상기 몇 가지 유형의 결합일 수 있다. 며역 조직화 분석에서 사용되는 몇 가지 평가 방식(H평점을 포함)은 여전히 분류 결과로 인정되는데, 이러한 결과는 본질적으로 불연속적인 것이기 때문이다.

본 발명이 개시한 방법에 의한 결과는 하나의 연속적인 데이터이다. 상기 데이터는 범용하는 면역 조직화와 같은 분류 결과로 전환될 수 있음으로써, 본 발명의 결과의 임상 의미를 비교하고 이해하도록 한다. 그러나, 이러한 전환 과정은 수리 분석으로 얻은 임계 참조값에 기반하여 구현된 것이고, 이러한 분류 결과는 임계값이 다름에 따라 변화된다. 본 발명의 일 실시형태에서, 유방암 조직에서 검출된 her2 수준은 통계학 분석에 사용될 수 있고, 면역 조직화 결과는 피험자 작업 특성(ROC) 곡선 분석을 통해 임계값을 얻는다. 유방암 조직에서의 절대 함량은 ROC 분석에서 얻은 임계값에 따라 양성 또는 음성으로 정의될 수 있다. her2의 절대 함량이 임계값보다 높으면 양성이고, 이와 반대이면 음성이다.

절대적 검출

본 발명의 분석에 의한 결과는 상대적일 수 있거나, 또는 표준 단백질과 결합되어 절대적일 수 있다. "상대적” 및 "절대적”은 2가지 검출 방법을 의미하는데, 이는 그의 가장 광범위한 외연을 포함해야 한다. 상대적 검출은 다른 결과와의 결과를 이용하여 검출하는 것이고, 절대적 검출은 이미 알고 있는 양의 표준 단위를 이용하여 검출하는 것이다. 2가지 검출 방법의 가장 현저한 차이점은 이들의 응용 범위가 상이할 수 있다는 것이다. 상대적 결과는 단지 동일한 실험 조건 하에서만 의미있고, 절대적 결과는 상이한 지점 및 상이한 시간에서 진행된 분석 결과를 비교한 것일 수 있다.

상응하게, 본 발명의 절대적 검출은 표준 단백질을 포함하여 구현된다. 전술한 표준 단백질은 이의 가장 광범위한 외연을 포함해야 한다. 이는 이미 알고 있는 양의 항원 또는 2개 이상의 이미 알고 있는 한 가지 항원을 의미한다. 이는 중량, 질량, 백분율, 부피 또는 분자수(예를 들어, 몰수) 또는 상기 2가지 이상의 조합으로 미리 결정한 양을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이는 정제된 형태 또는 혼합물 형태로 존재할 수 있다. 이는 천연적일 수도 있고, 비변성 또는 변성의 상태일 수도 있다. 본 발명에서, 천연과 변성 사이의 임의의 상태는 모두 비변성 상태로 인정될 수 있다.

바이오마커

본 명세서에서 혼용되는 "샘플”, "환자 샘플” 및 "생물 샘플”은 일반적으로 특정된 분자의 샘플 검출에 사용되는 것을 의미하는데, 바람직하게, 예를 들어 아래에서 기술된 바이오마커 등 생물 특징과 관련되는 특정된 마커 분자이다. 샘플은 조혈모세포, CNS액, 혈청, 혈장, 구강 스웝(swab), 오줌, 타액, 눈물, 흉수 및 이의 유사물을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서의 샘플은 일반적으로 조직을 의미한다.

용어 "마커” 및 "바이오마커”는 응당 이의 제일 광범위한 외연으로 정의되어야 한다.여기서 혼용되는 "마커” 및 "바이오마커”는 일반적으로 한 가지 표현형(예를 들어, 환자)으로부터 유래되는 샘플에서 다른 표현형(예를 들어, 질병이 없거나 상이한 질병을 가지고 있음)으로부터 유래되는 것과 비교 시 상이한 형태로 존재하는 유기 생물 분자(예를 들어, 폴리펩티드)인 것을 의미한다. 첫 번째 표현형에서의 바이오마커의 평균값 또는 중간값과 두 번째 표현형에서의 바이오마커의 평균값 또는 중간값을 비교하여 통계학적으로 현저한 차이가 나타날 경우, 상이한 표현형에서 상이하게 발현함에 따라 결정된다.

본 발명에서, 바이오마커는 질병 상태 또는 생물 상태와 관련되는 검출 가능한 단백질 분자를 의미한다. 이는 충분히 결정된 임상 진단용 바이오마커(예를 들어, 면역 조직화 분석용 임상 바이오마커) 또는 새로 감정된 체외 진단용 바이오마커일 수 있다.

본 발명의 일 실시형태에서, 바이오마커는 고형종양 진단에 사용된다.

이미 알고 있는 진단용 바이오마커는 ACTH, ACTIN, ADENOVIRUS, AFP, ALK-1, AMYLOID A, ANDROGEN RECEPTOR, ANNEXIN, ARGINASE-1, BAP1, B-AMYLOID, BCL-1, BCL-2, BCL-6, BEREP4, Beta-Catenin, BOB1, BRACHYURY, BRST-2, C3d, C4d, CALCITONIN, CALDESMON, CALPONIN, CALRETININ, CD14, CD117, CD117, BM, CD123, CD138, CD15, CD163, CD1a, CD2, CD20, CD21, CD23, CD25, CD3, CD30, CD31, CD33, CD34, CD34, BM, CD38, CD4, CD43, CD45RA, CD45RB, CD45RO, CD5, CD56, CD57, CD61, CD68, CD7, CD79a, CD8, CD99, CDX2, CEAm, CEAp, Chromogranin, Chymotrypsin, Claudin 3, Claudin 4, CK MIX, CK20, CK34BE12, CK5/6, CK7, CK19, CKAE1/AE3, CKCAM5.2, CMV, c-Myc, CXCL13, CYCLIN D3, D2-40, DBA-44, Desmin, DOG-1, EBV, LMP, E-Cadherin, EGFR, EMA, EMA-Perineurioma, ER, ERG, Factor 13a, Factor 8, FOXP1, FSH, GALECTIN-3, Gastrin, GATA-3, GFAP, GH, Glucagon, Glut1, Glutamine synthetase, Glypican-3, GPC, GRANZYME, H. pylori, HBC, HBS, hCG, HepPar 1, Her2neu, HGAL, HHV-8, HMB-45, HPL, HSV, IDH1, IgA, IgD, IgG , IgG4, IgM, Inhibin, INI, Insulin, ISH EBV, ISH KAPPA, ISH LAMBDA, KAPPA, KBA62, KI67, Lambda, LANGERIN, LAT, LEF1, LH, LM02, LYSOZYME, MAP-2, MCT, MELAN A, MITF, MLH1, MNDA, MOC-31, MPO, MSH2, MSH6, MUC2, MUC5AC, MUM1, Myogenin, Napsin A, NB84, NEU N, Neurofilament, NKI/C3, NKX3.1, NPM, NSE, NUT, 2-Oct, Oct-3/4, p16, p53, p57, p63, Parvovirus, PAX-2, PAX-5, PAX8, PCSK9, PD-1, Perforin, PHH3, PHLDA1, PIN4, PLAP, PMS2, PR, PRAP, Prolactin, Prox1, PSA, RNA, S100, S100P, SALL4, SF-1, SMA, SMMS, Somatostatin, SOX-10, SOX11, SCAP, S1P, SREBP, Spirochetes, STAT6, SV40, SYNAP, Tamm-Horsfall, T-bet, TCL-1, TCR, TCR, Gamma, TdT, THYRO, TIA-1, TOXO, Transthyretin, TRAP, TSH, TTF1, Tyrosinase, Vimentin, WT1, WT1(C-19), ZAP70을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명은 신선한 조직에서의 항원의 함량을 분석할 수 있고, FFPE 블록에서의 항원의 함량을 분석할 수도 있다. 항원은 조직 또는 FFPE 블록으로부터 임의의 형태로 추출될 수 있고, 추출 과정에서의 항원이 항원 항체 반응을 진행할 수 있으면 된다. FFPE 블록으로부터 유래되는 항원에 대해, 항원 항체 반응을 일으키도록, 조각에 대해 탈랍을 진행해야 하고 이 과정에 항원 복원 단계가 수반되거나 수반되지 않는다.

참조 데이터 베이스

2개 이상의 표적 샘플로부터의 QDB 결과는 이와 매칭되는 임상 정보와 결합되어 수리 분석을 진행하는 데이터 베이스(즉, AKA, QDB 데이터 베이스)를 구축할 수 있다. 따라서, 임상 진단을 목적으로 하는 참조 데이터 베이스를 구축할 수 있다.

본 명세서에서 "참고”, "참조”는 호환되어 사용될 수 있고 관찰되는 데이터 비교에 대한 이미 알고 있는 데이터 또는 시리즈의 이미 알고 있는 데이터를 의미한다. 이미 알고 있는 데이터는 2개의 파라미터 사이의 이미 알고 있는 상호 관계를 대표하는데, 예를 들어, 바이오마커의 발현 수준과 이와 관련되는 표현형 사이의 상호 관계를 대표한다. 여기서, 이미 알고 있는 데이터는 참조 데이터 베이스 중의 참조 개체 정보를 구성한다.

상응하게, 참조 데이터 베이스는 복수의 참조 개체 정보를 저장하여 진단 목적으로 사용될 수 있고, 각각의 참조 개체 정보는 이미 알고 있는 진단 결과 또는 치료 후 이미 알고 있는 임상 치료 효과 결과의 대상 개체로부터 획득한 샘플 중 바이오마커의 발현 수준을 포함한다.

본 발명의 일 실시형태에서, 참조 데이터 베이스 중의 하나 또는 복수의 참조 개체 정보와 가장 매칭되는 환자 개체 정보를 확인하는 방법을 더 포함한다. 상기 방법은, 적합한 프로그램 컴퓨터에서, 환자로부터 유래되는 샘플 중의 바이오마커의 발현 수준(함량)과 참조 데이터 베이스 중의 참조 개체 정보와 비교하여 전술한 환자의 개체 정보와 참조 데이터 베이스 중의 각각의 참조 개체 정보의 유사도를 결정하는 단계(a); 적합한 프로그램 컴퓨터에서, 단계(a)에서 결정된 유사도 중의 가장 큰 유사도에 따라 참조 데이터 베이스로부터 환자 개체 정보와 가장 매칭되는 참조 개체 정보를 조회하는 단계(b); 환자 개체 정보와 가장 매칭되는, 참조 데이터 베이스 중의 참조 개체 정보의 가장 큰 유사도 또는 이의 관련 표현형을 사용자 인터페이스 기기, 컴퓨터 판독 가능 저장 매체 또는 영역성 또는 원격 액세스 가능한 컴퓨터 시스템에 저장하거나, 직접 표시하는 단계(c)를 포함한다.

절대량에 기반한 진단 방법

수학적 방법을 이용하여 QDB 데이터 베이스로부터의 정보를 분석하여 바이오마커의 발현 수준과 임상 특성 사이의 추정 관계를 조회한다. 예로서, her2의 상대적 발현 수준과 환자 무질병 생존율 사이의 관계, 및 위암 환자 치료에 대한 Ki67 발현 수준의 유효성의 예측을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 정보는 동일한 유형의 분석에서의 다른 환자에 예후를 제공할 수 있다.

상술한 바와 같이, 임상 진단에서의 임상 시험은 흔히 단일한 분석물에 의존하므로, 상기 분석물과 다른 파라미터(일부 임상 데이터를 포함함) 사이의 잠재적인 내재적 연결을 포착하기 어렵다. 이 밖에, 임상 시험의 결과는 흔히 정량적이지 않고 면역 조직화 분석 방법에 의존하는데, 이러한 방법은 흔히 상이한 실험실에서 상이한 결과를 얻게 되고, 일부분 원인은 사용된 시약을 통일하기 어렵기 때문이고, 다른 일부분 원인은 판독대가 주관적 요소를 지니므로 정량화를 구현하기 어려운 것에 있다.

QDB 분석으로의 표준 단백질의 인입은 바이오마커의 절대 함량 측정을 구현하므로, 상이한 임상 실험실 사이 결과의 비교에 큰 편의를 제공하였다. 2개 이상의 표적 샘플로부터의 QDB 결과는 이와 가장 매칭되는 임상 정보와 결합되어 수리 분석에 사용되는 QDB 데이터 베이스를 구축할 수 있다. 수학적 방법을 이용하여 바이오마커의 절대 함량과 임상 파라미터 사이의 추정 연관성을 탐구한다. 예를 들어, Her2의 절대 발현량과 환자 무질병 생존율 사이의 관계를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 환자의 바이오마커의 절대 함량이 측정된 후, 이러한 정보는 추후 환자에 대한 진단 및 예후를 제공할 수 있다.

QDB 분석에 의한 2번 이상의 절대 정량 결과를 합병하여 수리 분석에 사용되는 데이터 베이스의 규모를 증가시킬 수 있다. 바이오마커의 절대 함량과 임상 파라미터의 추정 관계는 수리 분석 방법을 통해 탐구할 수 있다. 예로서, Her2의 절대 함량과 환자 무질병 생존율 사이의 관계, 또는 위암 환자 치료에 대한 Ki67 발현 수준의 유효성의 예측을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 정보는 이미 알고 있는 바이오마커 절대 함량의 환자에 대한 진단 또는 예후를 제공한다.

표적 샘플을 사용하여 2가지 이상의 바이오마커의 절대 함량을 검출할 수 있다. 이러한 결과는 환자의 관련 임상 정보와 결합되어 수리 분석에 사용되는 QDB참조 데이터 베이스를 구축할 수 있고, 이미 검출된 이러한 바이오마커의 절대 함량의 환자에 진단 및 예후를 제공한다. 참조 개체 정보는 이미 알고 있는 진단 또는 임상 치료 결과의 환자의 2가지 이상의 바이오마커 분자 절대 함량을 수집하여 획득할 수 있다. 다음, 새로운 환자에 대해, 이러한 바이오마커의 절대 함량을 측정할 수 있고 참조 데이터 베이스 중의 정보와 비교할 수 있다. 저장된 참조 개체 정보 중 이러한 절대 함량과 매칭되는 정보에 기반하여 새로운 환자에 치료 측면에서 진단 및 예후를 제공할 수 있다.

임상 특성은 이의 가장 광범위한 외연을 포함한다. 상기 특징은 연령, 성별, 혈압, 혈당 수준, 암 시기, 위험 비율, 무질병 생존기 또는 환자의 진단, 예방 및 치료와 관련되는 임의의 정보를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 다른 한 현저한 장점은 진단 방법에 있다. 구체적으로, 상기 방법은 임상 시험에 참여한 환자를 선별할 수 있다. 환자 개성화 치료를 구현하는 것을 목적으로 한 암 치료의 임상 시험의 주요 장애는 환자에 대해 단계화를 진행할 수 있는 바이오마커가 부족하다는 것이다. 암 환자의 절대 함량에 따른 선별 도구에 기반한 진단 확인은 단일한 표준 및 개선된 실험을 이용한 시작 과정을 통해 이러한 종류의 시험의 원가를 현저하게 감소시킬 수 있다. 환자를 감정하고 선별하는 원가가 낮기 때문에, 본 발명의 선별을 위한 신규 방법은 보다 광범위한 군중 및/또는 임상 환경에서 환자를 모집, 선별 및/또는 선택하는데 유리함으로써, 서비스가 부족한 환자 군체에 임상 시험에 참여하는 기회를 제공하는데, 이는 기존에 시행된 대다수 종양 시험의 주요 제한 조건이였다.

이 밖에, 현재의 종양 학자들은 흔히 그들이 선택할 수 있는 수많은 치료 수단을 구비하고, "표준 치료”로 표기된 그러한 치료 방안 및 이러한 라벨이 없지만 다른 일부 유형의 암 환자에서 효과를 나타내는 약물을 포함한다. 진단 후 환자로 하여금 최대한 빨리 상응한 최적의 암 치료 선택 항목을 얻을 수 있을 경우, 환자가 좋은 치료 결과를 얻는 가능성을 크게 향상시킨다. 본 발명의 방법은 실행 가능한 방법을 제공하여 이러한 수요를 만족시킨다.

바이오마커의 절대 수준은 QDB 분석을 통해 검출할 수 있고, 다른 방법 및 QDB 분석을 통해 공동으로 검출할 수도 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 표적 샘플의 절대 함량은 QDB 분석을 통해 검증한다.

QDB 데이터 베이스를 구축하기 위한 바이오마커의 절대 함량은 QDB 분석을 통해 검출할 수 있거나, QDB 분석을 통해 검증할 수 있다. QDB 데이터 베이스는 응당 가장 광의적으로 이해되어야 한다. QDB 데이터 베이스는 적어도 하나의 표적 샘플을 포함하고 QDB 방법으로 검출 또는 검증된 하나의 바이오마커의 절대 함량을 구비한다.

바이오마커의 절대 함량은 2가지 이상의 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 이러한 항체는 전술한 바이오마커의 동일한 항원 결정기 또는 상이한 항원 결정기에 관한 것일 수 있다. 이러한 항체로 측정된 바이오마커의 절대 함량은 동일할 수도 있고, 서로 상이할 수도 있다. 상기 절대 함량이 상이한 항체를 사용함에 따라 서로 상이할 경우, 이들을 모든 항체와 함께 명확하게 표기하여 진단 및 예후를 만족시키는 목적으로 각각 처리해야 한다.

본 발명의 일 실시형태에서, 2가지 이상의 검출 항체를 사용하여 샘플 중 바이오마커의 절대 함량을 검출할 경우, 이러한 항체가 제공한 진단 또는 예후가 동일하면, 진단 또는 예후는 유효한 것으로 인정된다. 이들의 진단 또는 예후가 불일치하면, 진단 또는 예후는 "모호”한 것으로 인정되므로, 추가적으로 검증해야 한다.

검증을 거쳐 표적 항원에 특이적인 것이면, 항원-항체 상호 작용을 위한 임의의 항체는 모두 QDB 분석에 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서 항체는 단일 클론인 것이고, 본 발명의 다른 실시형태에서의 항체는 다클론인 것이다.

본 발명의 일 실시형태에서, 면역 조직 화학 분석에 사용되는 항체는 인간 또는 동물의 조직 또는 세포에 대한 QDB 분석에 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시형태에서, 유동 세포 분석에 사용되는 항체는 인간 또는 동물의 조직 또는 세포에 대한 QDB 분석에 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 실시형태에서, 항원-항체 분석에 기반한 항체는 인간 또는 동물의 조직 또는 세포에 대한 QDB 분석에 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시형태에서, 샘플의 바이오마커의 QDB 분석에 사용되는 항체는 어느 파장에서 검출 가능한 형광 염료로 표기하는데 사용될 수 있고, 동일한 샘플의 다른 바이오마커의 QDB 분석에 사용되는 다른 항체는 다른 파장에서 검출 가능한 형광 염료로 표기하는데 사용될 수 있다. 이로써, 동일한 샘플 중의 2가지 바이오마커를 동시에 분석할 수 있다.

본 발명의 다른 실시형태에서, 샘플의 바이오마커의 QDB 분석에 사용되는 항체는 동위 원소로 표기할 수 있고, 동일한 샘플의 다른 바이오마커의 QDB 분석에 사용되는 항체는 다른 동위 원소로 표기할 수 있음으로써, 동일한 샘플 중의 2가지 바이오마커를 동시에 분석할 수 있다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 샘플의 바이오마커의 QDB 분석에 사용되는 항체는 예컨대 겨자무과산화효소(HRP)로 표기하는 방법을 사용할 수 있다. 동일한 샘플의 다른 바이오마커의 QDB 분석에 대한 다른 항체는 형광 염료로 표기할 수 있음으로써, 동일한 샘플 중의 2가지 바이오마커를 동시에 검출할 수 있다.

여기서 사용되는 "리포터 효소”는 응당 가장 광의적으로 이해되어야 한다. 리포터 효소는 면역 검출 측정에서 항체에 대한 임의의 변형으로서 항체 검출을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 리포터 효소에 있어서, 항체는 요오드화물125와 같은 방사성 동위 원소로 직접 표기하거나, 알칼리성 인산가수 분해효소 또는 겨자무과산화효소 등 리포터 효소로 표기하거나, 형광 염료로 직접 표기하는 등 방식을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 표기된 항체의 리포터 효소 수량의 검출은 검출 가능한 산물을 형성하여 완성할 수 있다. 상기 산물은 방사성을 구비하거나 화학적으로 발광하거나 형광을 생성할 수 있다. 또는, 가시광선 내 또는 가시광선 외에서 특정된 흡수 또는 반사 스펙트럼의 산물을 생성할 수 있다. 보체가 결합된 항원-항체 복합물 검출에 사용될 경우, 이는 상기 방식 중의 어느 한 가지로 표기될 수 있거나, 특정된 항-보체 항체를 통해 추가적으로 검출할 수 있다.

리포터 효소는 항체가 방사성 동위 원소(예를 들어, 요오드 이온 125)로 간접적으로 표기되거나, 리포터 효소(예를 들어, 알칼리성 인산가수 분해효소 또는 겨자무과산화효소)로 표기되는 될 수 있으며 그 방식은 이에 한정되지 않는다. 항체는 제2 항체로 간접적으로 표기되고, 제2 항체는 방사성 동위 원소(예를 들어, 요오드 이온 125)로 직접 또는 간접적으로 표기되거나, 리포터 효소(예를 들어, 알칼리성 인산가수 분해효소 또는 겨자무과산화효소)로 표기된다. 일 실시형태에서, 제2 항체는 비오틴으로 표기되고, 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase)로 표기된 스트렙트아비딘 분자를 통해 간접적으로 표기된다.

본문에서 사용된 "항원” 및 "항체”의 정의도 가장 넓은 범위를 포함한다. "항원”은 분자, 세포, 바이러스 또는 입자일 수 있다. "항원”은 화합물, 펩티드, 단백질, RNA 분자, DNA 분자, 세포(원 위치에서 방출한 단백질) 또는 바이러스 입자(원 위치에서 방출한 단백질), 또는 숙주 동물(인간을 포함함)이 한 가지 또는 여러 가지 항체를 생성하도록 할 수 있는 임의의 분자일 수 있다. 항원은 상기 분자 또는 분자 일부분(moiety) 중의 임의의 2가지 또는 여러 가지가 함께 가교된 산물일 수도 있다. 항원은 순수물 형태 또는 혼합물 형태로 존재할 수 있다. 항원은 복원되지 않은 형태 또는 복원된 후의 형태(예를 들어, 화학 물질에 의해 복원됨)로 존재할 수 있다.

본문에서 사용되는 "항체”의 정의도 가장 넓은 범위를 포함한다. 항체는 "항원”과 결합될 수 있는 폴리펩티드이다. 항체는 기존의 항체, 항원 결합 사이트를 함유한 기존의 항체의 단편, 한원 결합 사이트를 함유한 재조합 항체, 항원과 결합된 단백질, 또는 임의의 상기 2가지 또는 여러 가지가 가교된 것을 함유한 산물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 항체는 순수물 형태 또는 혼합물 형태로 존재할 수 있다. 항체는 복원되지 않은 형태 또는 복원된 후의 형태(예를 들어, 화학 물질에 의해 복원됨)로 존재할 수 있다.

“고형종양”은 응당 가장 넓은 의미로 이해되어야 한다. 고형종양은 세포 수준에서 서로 연결되어 단일 세포로서 존재하지 않는 임의의 종양 또는 비종양의 조직을 의미한다. 이는 유방암, 전립선암, 방광암, 위암, 신장암, 피부 흑색종, 자궁경부암, 난소암, 두경부암, 뇌암, 갑상선암, 폐암, 간암, 췌장암 및 결직장암을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

설명해야 할 것은, 여기서 설명한 예시적 구현예는 현재 바람직한 실시예이므로, 단지 설명을 위한 것일 뿐 이에 한정되지 않는다. 각각의 실시예에서의 특징 또는 중점은 일반적으로 다른 실시예에서의 다른 유사한 특징 또는 중점을 포함하는 것으로 인정되어야 한다.

또한, 언급된 실시예는 아래 실험이 전부 또는 진행 가능한 실험만 포함하는 것으로 해석되지 말아야 한다. 비록 모든 숫자(예를 들어, 함량, 온도 등)의 정확성을 확보하려고 애써 강구하였으나, 여전히 일부 실험 오차 및 편차의 발생을 피할 수 없다.

재료와 방법

피험자 및 인간 유래 세포계

냉동 조직 및 포르말린 고정 파라핀 포매(formalin fixed paraffin-embedded: FFPE) 조각을 그 임상 정보, 면역 조직화에 속하는 분류(0, 1+, 2+ 또는 3+)는 모두 현지 병원에서 얻었다. 부분 샘플도 FISH 결과를 제공한다. MCF-7 및 BT-474 세포계는 중국 과학원 세포 은행(중국 상하이)에서 구매하였다. 이 두 주의 세포계를 이용하여 제조된 분해액은 HER2 음성 및 양성 대조로 사용된다.

일반 시약

세포 배지 및 배양 접시를 포함한 세포 배양에 사용되는 모든 범용 시약은 모두 Thermo Fisher Scientifics(Waltham, MA, USA)에서 구매하였다. 프로테아제 억제제는 Sigma Aldrich 회사(St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다. 모든 다른 화학 물질은 시노팜 화학(중국 베이징)에서 구매하였다. 재조합 인간 HER2/ErbB2/CD340(676-1255) 단백질은 베이징 Sino Biological Inc.(중국 베이징)에서 구매하였다. QDB 플레이트는 중국 옌타이 Zestern Biotechnique Co. Ltd에서 생산하였다.

Ventana 항 HER2/neu(4B5) 토끼 단일 클론 1차 항체 및 항 인간 에스트로겐 수용체(클론 Sp1)는 Roche Diagnostics GmbH 회사에서 구매하였다. 토끼 항 HER2 항체(클론 EP3) 및 마우스 항 인간 Ki67(클론 MIB1)은 ZSGB-BIO 회사(중국 베이징)에서 구매하였다. HRP로 표기된 당나귀 항 토끼 IgG 2차 항체는 Jackson Immunoresearch 실험실(Pike West Grove, PA, USA)에서 구매하였다.

세포 및 조직 분해액의 제조

냉동 조직: 생체검사 조직으로부터 약 150 mg의 조직을 추출하고, 프로테아제 억제제(2 μg/ml의 류펩틴, 2 μg/ml의 아프로티닌, 1 μg/ml의 펩스타틴, 2 mM의 PMSF, 2 mM의 NaF)가 첨가된 300 μl의 분해 완충액(50 mM의 HEPES, 137 mM의 NaCl, 5 mM의 EDTA, 1 mM의 MgCl, 10 mM의 Na₂P₂O₇, 1 ％의 TritonX-100, 10 ％의 글리세롤)에서 핸드헬드 조직 균질기로 30초 동안 처리한 다음, 12000×g으로 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 수집하여 면역 블럿 분석을 진행한다. 전체 단백질 농도는 제조업체의 설명에 따라 Pierce BCA 단백질 측정 키트를 사용하여 검출한다. MCF-7 및 BT-474 세포 분해액을 준비할 시, 프로테아제 억제제가 첨가된 분해 완충액(lysis buffer)에서 세포를 피펫으로 위아래로 50번 피펫팅한다. 원심분리 후 상청액을 수집하고, BCA 단백질 측정 키트를 사용하여 전체 단백질 함량을 검출한다.

포르말린 고정 파라핀 포매 블록 처리

2개의 15 μm의 조각을 수집하고, 파라핀을 제거한 후, 프로테아제 억제제(2 μg/ml의 류펩틴, 2 μg/ml의 아프로티닌, 1 μg/ml의 펩스타틴, 2 mM의 PMSF, 2 mM의 NaF)가 첨가된 300 μl의 분해 완충액(50 mM의 HEPES, 137 mM의 NaCl, 5 mM의 EDTA, 1 mM의 MgCl, 10 mM의 Na₂P₂O₇, 1 ％의 TritonX-100, 10 ％의 글리세롤)에서 처리한 다음, 12000×g으로 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 수집하여 면역 블럿 분석을 진행한다. 전체 단백질 농도는 제조업체의 설명에 따라 Pierce BCA 단백질 측정 키트를 사용하여 검출한다.

점블럿 분석

정제된 her2 단백질을 도시된 바와 같이 구배 희석을 진행하고, FFPE 조각으로부터 추출된 전체 단백질과 함께 막에 점을 찍는다. 이러한 샘플은 Li-Cor 회사의 C-Digit Western 블럿 스캐너를 사용하여 이미지를 포착할 때까지 전형적인 점상 면역 블럿 분석 과정을 통해 처리한다. Li-Cor 회사의 ImageQuanti 소프트웨어를 사용하여 이미지를 숫자로 전환시킴으로써, 단백질 표준 곡선을 구축하여 환자에게서 유래되는 샘플의 이미지를 이의 절대 바이오마커 함량으로 전환시킨다.

QDB 분석

특이성 항체(Her2에 대한 EP3 또는 4B5 클론, Ki67에 대한 MIB1 클론, 에스트로겐 수용체(ER)에 대한 SP1) 각자의 선형 범위는, 이러한 바이오마커에 대해 각각 양성 반응을 나타내는 몇 명 환자로부터의 분해액을 혼합한 혼합물 사용하여 확정된 것이다. 먼저, 유방암 또는 위암 조직으로부터 등량의 3개 내지 4개의 조직 분해액을 혼합하고, 혼합된 분해액을 0 ~ 2 μg로부터 구배 희석을 진행하여 QDB 분석의 선형 범위를 확정한다. 상품으로서 구매하거나 회사 내부에서 자체적으로 발현하고 정제한 표준 단백질도 0 ~ 500 pg에 따라 구배 희석을 진행하여 QDB 분석의 선형 범위를 확정한다.

샘플을 1식 3부로 하여 2 μl/단위로 QDB 플레이트에 첨가하고, 선행 기술에서 개시된 바와 같이 처리한다. 각 웰에 100 μl의 제1 항체를 넣고, 4 ℃에서 하룻밤 배양한다. 다음, 실온에서 당나귀 항 토끼 또는 당나귀 항 마우스 제2 항체와 QDB 플레이트를 4시간 동안 배양한다. 먼저 TBST를 사용하여 QDB 플레이트를 간단히 2번 세척한 다음, 또다시 5번 세척하되, 매 번 10분 동안 세척하며, 다음, 이들을 백색 96웰 플레이트에 3분 동안 놓고, 상기 백색 96웰 플레이트에 100 μl/웰의 제조업체의 설명서에 따라 제조한 ECL 용액이 미리 첨가되어 있다. 그 다음, Tecan Infiniti 200 pro 마이크로플레이트 리더를 사용하여 사용자 인터페이스에서 "커버의 플레이트(plate with cover)"를 선택하여 조합 플레이트로부터의 각 웰의 화학 발광 신호를 정량 검출한다.

구배 희석된 표준 단백질을 각각 사용하여 선형 회귀 공식을 구축한다. 상기 공식은 각각의 유방암 조직 샘플에서의 전체 HER2 수준, BCA 단백질 측정 키트를 통해 검출된 전체 단백질량을 계산하여 교정 결과를 얻는다. 실험의 일치성을 확보하기 위하여, BT474 및 MCF7인 2가지 세포를 제조하는 세포 분해액은 실험에서 각각 양성 및 음성 대조로 사용된다. 2가지 세포 분해액은 작은 분량으로 나눈다. 이의 절대 바이오마커 수준은 먼저 QDB 분석을 통해 검출 기록된 후 통상적인 샘플로서 모든 QDB 실험에 포함되어 사용된다. 화학 발광 눈금이 2배 블랭크값보다 적은 샘플은 그 함량이 검출 범위보다 낮은 것으로 인정되고, 데이터 분석에서 0으로 기록한다. 최종 결과는 재조합 HER2 단백질의 순도 백분율을 통해 교정한다.

통계학 분석

유의도(significance)를 통계하는 흔히 보는 시험에는 t검출, ANOVA, Kruskal-Wallis, Wilcoxon, Mann-Whitney 및 우세비 등이 포함된다. 단독 또는 조합 바이오마커는 검출 대상이 표적 표현형에 속하는 상대적 가능성 정도를 제공한다. 따라서, 바이오마커 함량은 예를 들어 질병, 약물 치료 효과 등의 마커로 사용될 수 있다. 따라서, 바이오마커는 시험용 분석 물질로서 진단 수준 또는 유사 용도를 향상시킬 수 있다.

모든 데이터는 모두 평균값 ± 표준차(SD)로 표시된다. 각 그룹 사이의 차이는 Microsoft Excel의 매칭되지 않은 two-tailed Student's t 검출을 통해 계산한다. P값 < 0.05를 선택하여 통계학 유의도 표준으로 한다. 도면에 도시된 바와 같이, GraphPad Prism 소프트웨어 버전 7.0(미국 GraphPad Software Inc.)을 사용하여 피험자 작업 특성(ROC) 곡선 분석을 진행한다.

실시예

실시예 1은 점블럿 분석을 사용하여 FFPE 샘플 중의 Her2의 절대 함량을 검출하는 것을 나타낸다.

도 1A에서, 재조합 Her2 단백질에 대해 구배 희석을 진행하여 FFPE 블록으로부터 추출된 4명의 환자 샘플과 함께 막에 떨군다.

막에 떨군 표준 단백질과 환자 샘플에 대해, 점플럿 분석에서 항 Her2 단백질의 EP3 클론을 사용하여 처리한다. 또한, 도 1A 및 도 1B에 도시된 바와 같이, Li-Cor 회사의 C-Digit Western 블럿 스캐너를 사용하여 이미지를 포착한다.

도 1C에 도시된 바와같이, Li-Cor 회사의 ImageQuant 소프트웨어를 사용하여 도 1A 중의 이미지를 숫자로 전환시키고, 이러한 숫자를 이용하여 단백질 표준 곡선을 구축한다.

4명의 환자에게서 유래되는 샘플의 이미지도 동일한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 숫자로 전환시킨다. 이러한 숫자는 도 1C에서 구축된 단백질 표준 곡선에 기반하여 Her2절대 함량으로 전환된다.

도 2A ~ 도 2H는 어떻게 특이성 항체를 사용하여 QDB 분석의 선형 범위를 결정하는지를 나타낸다. 도 2A는 Her2-EP3항체를 이용하여 냉동 유방암 조직에 대해 QDB 분석을 진행한 선형 범위를 나타낸다. 도 2B는 Her2-EP3항체를 사용하여 FFPE 조각에 대해 QDB 분석을 진행한 선형 범위를 나타낸다. 도 2C는 재조합 Her2 단백질에 대해 QDB 분석을 진행한 선형 범위를 나타낸다. 도 2D는 MIB1항체를 사용하여 냉동 위암 조직에 대해 QDB 분석을 진행한 선형 범위를 나타낸다. 도 2E는 항 Ki67의 MIB1항체를 사용하여 FFPE 조각에 대해 QDB 분석을 진행한 선형 범위를 나타낸다. 도 2F는 MIB1항체를 사용하여 Ki67 단백질 재조합 단편에 대해 QDB 분석을 진행한 선형 범위를 나타낸다. 도 2G는 SP1항체를 사용하여 에스트로겐 수용체(ER) 단백질 재조합 단편에 대해 QDB 분석을 진행한 선형 범위를 나타낸다. 도 2H는 SP1항체를 사용하여 FFPE 조각 중 ER의 함량에 대해 QDB 분석을 진행한 선형 범위를 나타낸다.

도 3A ~ 도 3D는 각각 Her2-4B5, MIB1 및 SP2 항체를 사용하여 검출한 유방암 조직 중 Her2(A), Ki67(B) 및 ER(C)의 절대 함량을 나타낸다. 도 3D에서, Her2-EP3 항체를 사용하여 냉동 위암 조직 중 Her2의 절대 함량을 검출한다. 실험 결과는 3번의 독립적인 실험이고 각각의 실험은 3개의 중복된 결과의 평균값을 포함하며, IHC 평점에 따라 그룹화한다.

도 4A ~ 도 4D는 어떻게 피험자 작업 특성(ROC) 곡선 분석으로 QDB 결과를 분류 결과로 전환시키는지를 나타낸다. QDB 분석에 의한 결과는 이의 IHC 결과에 따라 음성군과 양성군으로 나뉘고, 이 2 그룹의 데이터로 최적화된 특이성 및 민감성의 임계값을 계산한다. 도 4A 및 도 4B는 각각 HER2-EP3 및 HER2-4B5 항체의 QDB 분석 결과에 기반하여 얻은 ROC 곡선을 나타낸다. 도 4C 및 도 4D는 어떻게 ROC 분석에 의하여 계산된 임계값에 따라 QDB 결과를 음성군과 양성군으로 나누는지를 나타낸다.

도 5에서, 263개의 FFPE 샘플의 Her2 절대 함량에 대한 검출을 완성한 후, 이러한 데이터를 조직학 등급(histologic grade)에 기반하여 그룹화하고, 여기서, 상기 조직학 등급은 현지 병원에서 노팅엄 조직학 평점에 의해 제공된다. 여기서, I급 그룹은 34건의 샘플, II 그룹은 125건의 샘플, III 그룹은 104건의 샘플을 포함한다. 3개 등급의 평균값은 각각 0.08 nmole/g, 0.73 nmole/g 및 3.15 nmole/g이다. III 그룹 Her2 수준은 I급 그룹 및 II 그룹보다 현저히 높다. II 그룹 Her2 절대 함량은 I급 그룹보다 현저히 높다. 현재 주요한 IHC 및 FISH 분류 시스템은 이러한 목적에 도달하기 어렵다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물 및 특허는, 각각의 개별 출판물 또는 특허가 명백하고 개별적으로 참조로서 포함되듯이, 전부 본 명세서에 참조로 포함된다. 또한, 참조로서, 본 명세서 중의 방법 및/또는 재료와 인용된 간행물 사이의 관계에 대한 개시 및 기술도 마찬가지로 포함된다. 임의의 간행물에 대한 인용은 모두 이들이 출원일 이전에 이미 개시되었기 때문이며, 이에 따라 본 발명이 선행 발명으로 인해 이러한 간행물보다 우선 권리가 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이 밖에, 제공된 게시 날짜는 독립적인 확인이 필요한 실제 게시 날짜와 다들 수 있다. 본 명세서에참초로 포함된 문서에서 제시되는 용어의 정의가 본 명세서에서 명확하게 정의된 용어의 정의와 상충되는 경우, 본 명세서에서 설명된 정의를 기준으로 한다.

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Claims

샘플의 정량 분석 방법으로서,
상기 샘플의 하나 또는 복수의 특징을 나타내는 단일 마커를 제공하는 단계(a) - 상기 샘플은 상기 마커의 단일 단위의 군체를 포함함 - ;
점블럿 분석으로 상기 마커를 검출하는 단계(b) - 그 정량 결과는 샘플 중 상기 마커의 단일 단위의 군체의 절대량이고, 샘플 부피 또는 샘플 중량을 통해 표준화됨 - ; 및
상기 마커의 정량 결과에 기반하여 샘플의 하나 또는 복수의 특징의 객관성 측정을 획득하는 단계(c)를 포함하는 샘플의 정량 분석 방법.
제1항에 있어서,
단계(b)는,
정량 점블럿(QDB) 분석을 통해 마커를 검출하는 단계를 포함하는 샘플의 정량 분석 방법.
제2항에 있어서,
단계(b)는,
샘플을 결합 인자를 포함하는 용액과 함께 배양하는 단계(b1) - 상기 결합 인자는 상기 마커의 단일 단위에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 결합 인자는 상기 점블럿 분석을 통해 정량화를 진행할 수 있음 - ; 및
상기 결합 인자의 QDB 분석을 통해 상기 마커를 검출하는 단계(b2)를 포함하는 샘플의 정량 분석 방법.
제3항에 있어서,
상기 마커는 단백질 마커이고, 상기 결합 인자는 항체인 샘플의 정량 분석 방법.
제4항에 있어서,
상기 항체는 분석물질 특정시약(ASR)급 항체인 샘플의 정량 분석 방법.
제4항에 있어서,
상기 항체는 체외 진단(IVD)급 항체인 샘플의 정량 분석 방법.
제4항에 있어서,
상기 항체는 면역 조직 화학에서 검정될 수 있는 샘플의 정량 분석 방법.
제1항에 있어서,
상기 샘플은 실험 대상으로부터 유래되는 생체검사 조직인 샘플의 정량 분석 방법.
제8항에 있어서,
상기 생체검사 조직은 포르말린으로 고정하고 파라핀으로 포매한 조직인 샘플의 정량 분석 방법.
제8항에 있어서,
상기 실험 대상은 암 환자인 샘플의 정량 분석 방법.
제10항에 있어서,
마커의 정량 결과에 따라 환자에 대해 평가하는 단계(d)를 더 포함하는 샘플의 정량 분석 방법.
제11항에 있어서,
상기 단계(d)에서, 상기 환자에 대해 평가하는 것은 환자에 대해 암의 진단 및 예후를 진행하는 것을 포함하는 샘플의 정량 분석 방법.
제12항에 있어서,
상기 암의 진단 및 예후는 무질병 생존율, 전반적 생존율, 위험 비율 및 치료 방안의 예측을 포함하는 샘플의 정량 분석 방법.
환자로부터 유래되는 생체검사 조직 샘플 중의 마커의 정량 분석에 기반하여 환자에 대해 암 진단을 진행하는 참조 데이터 베이스로서,
복수의 참조 개체 정보를 포함하고,
상기 복수의 참조 개체 정보 중의 각각은,
이미 명확하게 진단된 암 환자의 생체검사 조직 샘플을 제공하는 단계(a);
정량 점블럿(QDB) 분석을 통해 상기 마커를 검출하는 단계(b) - 정량 결과는 생체검사 조직 샘플 중 상기 마커의 절대량이고, 생체검사 조직 샘플 부피 또는 생체검사 조직 샘플 중량을 통해 표준화됨 - ; 및
상기 정량 결과를 암 환자의 이미 알고 있는 진단과 연관시켜 참조 개체 정보를 획득하는 단계(c)를 통해 획득되는 참조 데이터 베이스.
제14항에 있어서,
상기 단계(b)는,
상기 생체검사 조직 샘플을 상기 마커에 특이적으로 결합되는 결합 인자를 포함하는 용액과 함께 배양하는 단계(b1); 및
상기 결합 인자의 QDB 분석을 통해 상기 마커를 검출하는 단계(b2)를 포함하는 참조 데이터 베이스.
제15항에 있어서,
상기 마커는 단백질 마커이고, 상기 결합 인자는 항체인 참조 데이터 베이스.
환자에 대해 암 진단을 진행하는 방법으로서,
제14항에 따른 참조 데이터 베이스를 제공하는 단계;
환자의 생체검사 조직 샘플을 획득하는 단계;
QDB의 방법으로 환자의 생체검사 조직 샘플에서의 상기 참조 데이터 베이스에 사용되는 상기 마커의 함량을 검출하는 단계 - 검출된 결과는 상기 생체검사 조직 샘플에서의 상기 마커의 절대 함량임 - ;
상기 생체검사 조직에서의 상기 마커의 정량 결과를 상기 참조 데이터 베이스에 저장된 각각의 참조 개체 정보와 비교하는 단계; 및
상기 참조 데이터 베이스에서 상기 생체검사 조직의 상기 마커의 정량 결과와 가장 매칭되는 참조 개체 정보를 조회하고, 상기 참조 개체 정보와 연관되는 이미 알고 있는 진단 결과를 출력하는 단계를 포함하는 환자에 대해 암 진단을 진행하는 방법.
제17항에 있어서,
상기 암은 고형종양인 환자에 대해 암 진단을 진행하는 방법.
제14항에 따른 참조 데이터 베이스를 포함하는 환자에 대해 암 진단을 진행하는 키트.
네트워크를 통해 제14항에 따른 참조 데이터 베이스에 액세스하도록 구성된 유닛을 포함하는 환자에 대해 암 진단을 진행하는 키트.