CN108717120A - 一种宫颈癌筛查检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
发明人提供了一种宫颈癌筛查检测试剂盒，所述试剂盒包括p16/Ki‑67混合一抗，混合酶标二抗和染色液，所述染色液包括AP‑Red染色液和DAB染色液，所述AP‑Red染色液的制备方法，包括色原制备、底物制备、染色液制备。上述技术方案提供了一种新型的宫颈癌筛查检测试剂盒，该试剂盒使用了新配方的AP‑Red染色液，可能是该染色液中的色原具有多个反应基团，这些基团可以和组织上的基团进行反应，形成共价键，使得使用该试剂盒的宫颈细胞薄片可在染色后直接过有机试剂，不需使用水性封片剂封片，避免产生气泡，厚度得到控制，节约了时间和人力成本，避免影响染色结果的观察，提高了检测效率和检测质量。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特征涉及一种宫颈癌筛查检测试剂盒。
背景技术
据不完全统计，中国每年有13万新发病例，2-3万女性可能死于宫颈癌。我国宫颈癌的新发病例占全世界新发病例的28％，中国的宫颈癌防治任重而道远。细胞学检查是目前宫颈癌的主要筛查方法,p16/Ki-67细胞学双重染色是新近发展的宫颈癌筛查技术，其高灵敏度和特异性极大改善了宫颈癌筛查分流管理。
AP-Red染色液是免疫细胞化学中常用的染色液。免疫反应中，抗体所带的碱性磷酸酶与AP-Red染色液起反应，最终使细胞薄片中抗原位点上呈现红色着色。在显色完成后，要对细胞薄片进行封片保存。由于目前普通的AP-Red遇到有机溶剂(乙醇、二甲苯)会褪色，因此需要用水性封片剂封片，若要让染色结果长期保存，待水性封片剂干片后再用中性树胶封片。水性封片剂封片容易产生气泡，有一定厚度，存在折光度问题，一定程度影响染色结果的观察，对检测结果造成不确定性的因素，同时水性封片剂耗时费力，给操作人员增加负担，影响检测的效率。另外，水性封片剂封片后如果没有再次用中性树胶封片，AP-Red的所染的红色会在3-5个月后逐渐褪色。
发明内容
为此，需要提供一种检测简单，提高检测效率和质量的宫颈癌筛查检测试剂盒。
为实现上述目的，发明人提供了一种宫颈癌筛查检测试剂盒，所述试剂盒包括p16/Ki-67混合一抗，混合酶标二抗和染色液，所述染色液包括AP-Red染色液和DAB染色液，所述AP-Red染色液的制备方法，包括以下步骤：
色原制备：3.5-3.7g新品红溶解于45-55ml质量百分比为1.5％-2％的盐酸溶液中，制得第一混合溶液；向第一混合溶液中加入的2-2.2g亚硝酸钠，进行重氮化反应，反应温度控制在0-5℃，得到含有重氮化新品红的第一悬浊液，将第一悬浊液进行固液分离，得到含有重氮化新品红的AP-Red色原溶液；
底物制备：0.2-0.4g萘酚AS-BI磷酸盐溶解于40-60mlpH 8.2-8.6的Tris缓冲液中，得到第二混合溶液，将第二混合溶液与0.4-0.6ml二甲基甲酰胺混合，得到AP-Red底物溶液；
染色液制备：将AP-Red色原溶液与等体积的AP-Red底物溶液进行混合，得到AP-Red染色液。
进一步地，所述色原制备步骤中，所述重氮化反应在冰水浴中进行。
进一步地，所述色原制备步骤中，所述亚硝酸钠在25-35min内缓慢加入。
进一步地，所述底物制备步骤中，Tris缓冲液的质量百分比浓度为18％-25％。
进一步地，还包括加入Tween-20，在所述底物制备步骤中，向第二混合溶液中加入0.14-0.16ml的Tween-20。
进一步地，所述p16/Ki-67混合一抗包括：鼠抗p16单克隆抗体和兔抗Ki-67单克隆抗体，所述混合酶标二抗包括：连接了碱性磷酸酶的羊抗鼠二抗和连接了辣根过氧化物酶的羊抗兔二抗。
进一步地，所述AP-Red染色液在使用前30分钟内由色原溶液与底物溶液配置。
进一步地，所述宫颈癌筛查检测试剂盒用于宫颈细胞薄片。
区别于现有技术，上述技术方案提供了一种新型的宫颈癌筛查检测试剂盒，该试剂盒使用了新配方的AP-Red染色液，可能是该染色液中的色原具有多个反应基团，这些基团可以和组织上的基团进行反应并形成共价键，AP-Red染色液与组织的连接力增强,使得使用该试剂盒的宫颈细胞薄片可在染色后直接过有机试剂，不需使用水性封片剂封片，避免产生气泡，厚度得到控制，节约了时间和人力成本，避免影响染色结果的观察，提高了检测效率和检测质量。
附图说明
图1为使用宫颈癌筛查检测试剂盒的Hela细胞(宫颈癌细胞系)免疫细胞化学染色图；
图2为使用市售AP-Red染色液的Hela细胞(宫颈癌细胞系)免疫细胞化学染色图。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。
实施例1：宫颈癌筛查检测试剂盒对宫颈细胞薄片进行免疫细胞化学染色
试剂盒包括：p16/Ki-67混合一抗，(鼠抗p16单克隆抗体和兔抗Ki-67单克隆抗体)；混合酶标二抗(连接了碱性磷酸酶的羊抗鼠二抗和连接了辣根过氧化物酶的羊抗兔二抗)；DAB染色液和AP-Red染色液。
其中AP-Red染色液的制备包括：
色原制备：将3.65g的新品红溶解于50ml质量百分比为1.9％的盐酸溶液中制得第一混合溶液,将第一混合溶液置于0℃冰水浴中，并在30分钟内缓慢加入2.07g的亚硝酸钠，得到第一悬浊液，将第一悬浊液进行固液分离，去除固体后，得到AP-Red色原溶液；
底物制备：将0.3g的萘酚AS-BI磷酸盐加入50mlpH8.4的21％的Tris缓冲液中，混合得到第二混合溶液，将第二混合溶液与0.5ml的二甲基甲酰胺、0.15ml的Tween-20混合，得到AP-Red底物溶液。
染色液制备：将AP-Red色原溶液与同体积的AP-Red底物溶液进行混合，得到AP-Red染色液。配置好的AP-Red染色液避光存放，30分钟内有效。
免疫反应中，抗体所带的碱性磷酸酶与AP-Red底物中的萘酚AS-BI磷酸盐起反应，反应后的物质与AP-Red色原(主要为重氮盐)起反应，最终使细胞切片中抗原位点上呈现红色着色。
用宫颈癌筛查检测试剂盒进行Hela细胞(宫颈癌细胞系)的免疫细胞化学染色，试验步骤如下：
a)细胞固定
宫颈细胞薄片置于95％乙醇中，浸泡30分钟；
风干。
b)抗原修复
抗原修复液隔水加热至95℃；
将固定后的细胞薄片置于耐高温染色架上，蒸馏水浸泡湿润，放入95℃抗原修复液中修复20分钟后，自然冷却至室温；
流水冲洗1分钟；
用PBS溶液冲洗3分钟×2次。
c)阻断内源性过氧化物酶
除去PBS液，加100μl内源性过氧化物酶阻断剂，室温下孵育10分钟；
PBS冲洗3分钟×3次。
d)加(p16+Ki-67)混合一抗
除去PBS液，加100μl(p16+Ki-67)混合一抗，室温下孵育60分钟；
PBS冲洗3分钟×3次。
e)加HPR+AP酶标第二抗体(混合酶标二抗)
除去PBS液，加100μlHPR+AP酶标第二抗体，室温下孵育15分钟；
PBS冲洗3分钟×3次。
f)加AP-Red染色液
除去PBS液，加100-200μl实施例1配制好的AP-Red染色液，显色10-15分钟，必要时可在显微镜下观察掌握染色时间，阳性染色为红色；
PBS冲洗3分钟×3次。
g)加DAB显色液
除去PBS液，加100-200μl配制好的DAB显色剂，显色5分钟，可在显微镜下观察掌握染色时间，阳性染色为棕黄(褐)色；
流水冲洗终止显色。
h)复染
除去水分，加100-200μl苏木素染色液浅染15-30秒，流水冲洗干净；
PBS冲洗返蓝，流水冲洗干净。
i)脱水、透明、封片
85％乙醇中，浸泡1分钟；
95％乙醇中，浸泡1分钟；
无水乙醇中，浸泡1分钟；
二甲苯透明；
中性树胶和盖玻片封片。
使用了实施例1中宫颈癌筛查检测试剂盒的Hela细胞(宫颈癌细胞系)的红色染色部位则定位清晰、细胞薄片内见同一细胞细胞质呈红色着色，细胞核呈棕黄色或红褐色着色,具体可见图1。染色片在常温保存3年后色泽依然鲜艳没有出现褪色的情况。
而当使用了市售AP-Red染色液代替实施例1配置的AP-Red染色液，配合宫颈癌筛查检测试剂盒的其余组分进行细胞薄片染色，发现Hela细胞在h)脱水、透明封片步骤后(没有使用水性封片剂封片，直接过有机试剂)，红色的p16抗原位点染色部位出现了褪色的情况，具体见图2。
实施例2：
实施例2与实施例1的区别在于：AP-Red染色液的配方不同。
AP-Red染色液的制备包括以下步骤：
色原制备：将3.5g的新品红溶解于45ml质量百分比为1.5％的盐酸溶液中制得第一混合溶液,将第一混合溶液置于0℃冰水浴中，并在25分钟内缓慢加入2g的亚硝酸钠，得到第一悬浊液，将第一悬浊液进行固液分离，得到AP-Red色原溶液；
底物制备：将0.2g的萘酚AS-BI磷酸盐加入40ml质量百分比浓度为18％的Tris缓冲液pH8.2中，混合得到第二混合溶液，将第二混合溶液与0.4ml的二甲基甲酰胺、0.14ml的Tween-20混合，得到AP-Red底物；
染色液制备：将AP-Red色原与同体积AP-Red底物进行混合，得到AP-Red染色液。
实施例3：
实施例3与实施例1的区别在于，AP-Red染色液的配方不同。
AP-Red染色液的制备包括以下步骤：
色原制备：将3.7g的新品红溶解于55ml质量百分比为2％的盐酸溶液中制得第一混合溶液,将第一混合溶液置于冰水浴中，35分钟内加入2.2g亚硝酸钠，得到第一悬浊液，将第一悬浊液进行固液分离，得到AP-Red色原溶液；
底物制备：将0.4g的萘酚AS-BI磷酸盐加入60ml质量百分比浓度为25％的Tris缓冲液pH8.6中，混合得到第二混合溶液，将第二混合溶液与0.6ml的二甲基甲酰胺、0.16ml的Tween-20混合，得到AP-Red底物；
染色液制备：将AP-Red色原与同体积AP-Red底物进行混合，得到AP-Red染色液。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。
Claims (8)
1.一种宫颈癌筛查检测试剂盒，所述试剂盒包括p16/Ki-67混合一抗，混合酶标二抗和染色液，其特征在于，所述染色液包括AP-Red染色液和DAB染色液，所述AP-Red染色液的制备方法，包括以下步骤：
色原制备：3.5-3.7g新品红溶解于45-55ml质量百分比为1.5％-2％的盐酸溶液中，制得第一混合溶液；向第一混合溶液中加入的2-2.2g亚硝酸钠，进行重氮化反应，反应温度控制在0-5℃，得到含有重氮化新品红的第一悬浊液，将第一悬浊液进行固液分离，得到含有重氮化新品红的AP-Red色原溶液；
底物制备：0.2-0.4g萘酚AS-BI磷酸盐溶解于40-60mlpH8.2-8.6的Tris缓冲液中，得到第二混合溶液，将第二混合溶液与0.4-0.6ml二甲基甲酰胺混合，得到AP-Red底物溶液；
染色液制备：将AP-Red色原溶液与等体积的AP-Red底物溶液进行混合，得到AP-Red染色液。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述色原制备步骤中，所述重氮化反应在冰水浴中进行。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述色原制备步骤中，所述亚硝酸钠在25-35min内缓慢加入。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述底物制备步骤中，Tris缓冲液的质量百分比浓度为18％-25％。
5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括加入Tween-20，在所述底物制备步骤中，向第二混合溶液中加入0.14-0.16ml的Tween-20。
6.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述p16/Ki-67混合一抗包括：鼠抗p16单克隆抗体和兔抗Ki-67单克隆抗体，所述混合酶标二抗包括：连接了碱性磷酸酶的羊抗鼠二抗和连接了辣根过氧化物酶的羊抗兔二抗。
7.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述AP-Red染色液在使用前30分钟内由色原溶液与底物溶液配置。
8.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述宫颈癌筛查检测试剂盒用于宫颈细胞薄片。
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|---|---|
| CN (1) | CN108717120A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111077302A (zh) * | 2019-12-26 | 2020-04-28 | 江苏美克医学技术有限公司 | 一种基于葡聚糖信号放大ki67和p16INK4a检测试剂盒 |
| CN111089964A (zh) * | 2019-12-26 | 2020-05-01 | 江苏美克医学技术有限公司 | 一种用于宫颈癌辅助诊断的免疫荧光双染试剂盒 |
| CN111929122A (zh) * | 2020-06-29 | 2020-11-13 | 广州江元医疗科技有限公司 | 一种用于免疫细胞化学染色的抗原修复方法、细胞悬液及应用该方法的化学染色方法 |
| CN114460299A (zh) * | 2022-04-12 | 2022-05-10 | 南京黎明生物制品有限公司 | 一种家用型宫颈癌筛查试剂卡 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107677827A (zh) * | 2017-10-09 | 2018-02-09 | 亚能生物技术（深圳）有限公司 | 一种宫颈癌辅助分级诊断的双染试剂盒及其应用 |
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2018
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107677827A (zh) * | 2017-10-09 | 2018-02-09 | 亚能生物技术（深圳）有限公司 | 一种宫颈癌辅助分级诊断的双染试剂盒及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 小川和朗 等著: "《酶组织细胞化学技术》", 31 May 1989 * |
| 来茂德: "《病理学高级教程》", 28 February 2015 * |
| 王文勇 等: "《免疫细胞（组织）化学和分子病理学技术》", 30 November 2010 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111077302A (zh) * | 2019-12-26 | 2020-04-28 | 江苏美克医学技术有限公司 | 一种基于葡聚糖信号放大ki67和p16INK4a检测试剂盒 |
| CN111089964A (zh) * | 2019-12-26 | 2020-05-01 | 江苏美克医学技术有限公司 | 一种用于宫颈癌辅助诊断的免疫荧光双染试剂盒 |
| CN111929122A (zh) * | 2020-06-29 | 2020-11-13 | 广州江元医疗科技有限公司 | 一种用于免疫细胞化学染色的抗原修复方法、细胞悬液及应用该方法的化学染色方法 |
| CN111929122B (zh) * | 2020-06-29 | 2022-10-28 | 广州江元医疗科技有限公司 | 一种用于免疫细胞化学染色的抗原修复方法、细胞悬液及应用该方法的化学染色方法 |
| CN114460299A (zh) * | 2022-04-12 | 2022-05-10 | 南京黎明生物制品有限公司 | 一种家用型宫颈癌筛查试剂卡 |
| CN114460299B (zh) * | 2022-04-12 | 2022-07-08 | 南京黎明生物制品有限公司 | 一种家用型宫颈癌筛查试剂卡 |
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