CN111929122B - 一种用于免疫细胞化学染色的抗原修复方法、细胞悬液及应用该方法的化学染色方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于免疫细胞化学染色的抗原修复方法，包括如下步骤:采集细胞样本的步骤；加入样本密度分离液的步骤，将细胞样本转移至离心管中，往离心管中加入样本密度分离液，并加入30％～70％的乙酸盐溶液，两者体积比为1:1～3:1；重力离心操作步骤，完毕后，弃去上层废液，得到含有样本细胞的沉淀物；制备细胞悬液步骤，往含有细胞样本的沉淀物的离心管中加入缓冲液，将离心管底部的细胞打散，制成细胞悬液。本发明创新性地在分层离心步骤前在样本密度分离液中加入乙酸盐溶液，有效溶解样本的粘液，更好地打破封闭的抗原决定簇的蛋白质分子与化学键间的交联，达到抗原修复作用，致使化学双染色及多染色效果明显。
Description
技术领域
本发明涉及医学生物技术领域，具体涉及一种用于免疫细胞化学染色的抗原修复方法、细胞悬液，以及应用该方法的化学染色方法。
背景技术
免疫细胞化学染色技术(ICC)是细胞化学技术和免疫学技术相结合的一种检测技术，是以抗原和抗体特异性识别为基础，结合特定的化学显色物质或荧光物质，特异性地检测细胞内或膜表面的多肽、蛋白质等的存在和分布。免疫细胞化学染色技术在病理诊断中是一项重要的参考，被广泛应用于诊断与鉴别诊断中。P16基因是一种细胞的周期素依赖性激酶(CDK)抑制剂，由于与多种肿瘤有关被称为多肿瘤抑制基因，其基因产物对CDK4的活性有抑制作用，也称为p16INK4。细胞处于细胞周期的阻滞期，p16蛋白会过度表达。一过性的HPV感染不会影响细胞周期的调控，而持续性HPV感染的细胞的异常增生，会导致p16过表达，因此p16过表达可作为宫颈高级别病变的特异性标志物。Ki-67则是一种标志着细胞周期进展及增殖期细胞的核抗原基因，其表达仅限于细胞增殖周期的G1、S、G2期和M期，且在G0期表达缺失。处于细胞周期的增殖期时的细胞会过度表达Ki-67。
通常生理机能正常的细胞，p16和Ki-67的同时过表达是不会出现的。如果，p16和Ki-67同时过度表达，则提示细胞周期调控失调。因此，在同一细胞中同时用免疫细胞化学染色技术方法检测p16和Ki-67可作为细胞周期失调的标志物。免疫细胞化学染色是一项由多步骤组成的实验技术，具体为:细胞固定、切片制备、抗原修复、抗原抗体反应、目标抗原显色等。免疫细胞化学染色技术的染色质量及效果受多种因素影响，在众多因素中抗原修复这一步骤最为重要，因为不恰当的抗原修复可能导致假阴性结果。原因是细胞固定液会封闭细胞的抗原决定簇的表达，所以在切片制备完成后需要进行抗原修复。细胞固定液在固定标本期间，能有效增加组织内的蛋白质分子交联，抗原被封闭，在一定程度上能够对免疫细胞化学染色结果产生影响。加剧抗原性物质分子运动是广泛接受热修复抗原的主要因素，从而打破封闭的抗原决定簇的蛋白质分子与化学键间的交联，暴露抗原，实现抗原修复效果。目前，抗原修复常用的方法有酶修复法和热修复法。相比热修复法的抗原免疫细胞染色效果，酶消化法修复相对较差。
现有技术提供一种密度梯度分层离心法，其不需要高温高压的条件，同样能实现抗原修复的效果，密度梯度分层离心法也属于物理方法，可能在打破封闭的抗原决定簇的蛋白质分子与化学键间的交联起到洗脱细胞固定液的效果，从而暴露抗原，达到抗原修复的作用。但其在应用于双染色(DAB染色系统和AP-RED染色系统)的免疫细胞化学染色的时候发现染色效果并不理想，特别是AP-RED染色发现出现染色效果差、染色不准确(非特异性)的情况。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于免疫细胞化学染色的抗原修复方法，在密度梯度分层离心法之前加入含有乙酸钠溶液的样本密度分离液，达到抗原修复的效果，在免疫细胞化学双染色以及多重染色实验中均能显色。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种用于免疫细胞化学染色的抗原修复方法，其特征在于包括如下步骤：
采集细胞样本的步骤；
加入样本密度分离液的步骤：将细胞样本转移至离心管中，，往离心管中加入样本密度分离液，并加入30％～70％的乙酸盐溶液，所述样本密度分离液与所述乙酸盐溶液体积比为1:1～3:1；
重力离心步骤：加入所述样本密度分离液后在800g～1500g离心力作用下离心5min～10min，完毕后，弃去上层废液，得到含有细胞样本的沉淀物；
制备细胞悬液步骤：往含有细胞样本的沉淀物的离心管中加入缓冲液，用漩涡混匀器将离心管底部的细胞打散，制成细胞悬液。
本技术方案在重力离心步骤前加入含有乙酸离子的溶液，能有效溶解样本的粘液，使样本干净、无粘液，再在这个基础上进行密度梯度分层离心法，能够很好地打破封闭的抗原决定簇的蛋白质分子与化学键间的交联，起到洗脱细胞固定液的效果，从而暴露抗原，达到抗原修复的作用，能使双染色及多染色达到染色理想的效果。
进一步地，所述乙酸盐溶液浓度为30％-50％。
进一步地，所述乙酸盐溶液为乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵、乙酸锌溶液中的一种或多种，所述样本密度分离液与所述乙酸盐溶液体积比为3:1，其中的乙酸离子能够起到溶解细胞样本粘液，使得样本干净无粘液，在此基础上采用密度梯度分层离心法，更好达到抗原修复作用，使得化学双染色效果更好，显色明显。
进一步地，所述样本密度分离液是丙三醇与乙醇的混合溶液，丙三醇与乙醇的体积比为(1-2):(2-1)，所述样本密度分离液与细胞样本的体积比为(3-7):(7-3)，所述细胞沉淀物与缓冲液的体积比为1:1。样本细胞可优选为宫颈细胞。丙三醇的质量较大，可吸附质量较大的细胞样本沉积。
进一步地，所述重力离心步骤分两次进行，加入所述样本密度分离液后先进行微重力离心步骤，再进行重力离心步骤，所述微重力离心步骤为：离心管在150g～200g离心力作用下离心1min～5min，完毕后将上层液体吸走。由于丙三醇的质量较大，可吸附质量较大的细胞样本沉积，而对于中等以及小质量的样本细胞，则需通过两次离心以及离心力和离心时间的调控，将其充分分离，以得到高纯度的细胞样本沉淀。
本发明还提供采用以上步骤制得的细胞悬液，并将该细胞悬液用于免疫细胞化学双染色及多染色实验中。
本发明还提供一种免疫细胞染色方法，包括如下步骤：
将上述获得的细胞悬液滴加到制片仓的载玻片上静止沉降，完成制片；
将上述载玻片用磷酸缓冲液冲洗，然后滴加内源性过氧化物酶阻断剂，室温下孵育；再用磷酸缓冲液冲洗，之后滴加封闭液，室温下孵育；
继续滴加稀释后的一抗溶液，32℃恒温水浴30～60min；然后用磷酸缓冲液冲洗，再滴加二抗溶液，32℃恒温水浴10～20min；再用磷酸缓冲液冲洗；最后滴加DAB显色液，再用磷酸缓冲液冲洗后，滴加AP-RED显色液。其中DAB显色液为预先制备好的DAB显色A系统，AP-RED显色液为预先配置好的AP-RED显色B系统。
进一步地，所述静止沉降时间为10min，所述磷酸缓冲液步骤需进行3次，每次1～2分钟；所述室温下孵育时间为10～20min。
进一步地，所述一抗溶液为鼠源抗P16抗体和兔源抗Ki-67抗体的混合溶液，所述二抗溶液为羊抗鼠HRP二抗和羊抗兔AP二抗混合溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
密度梯度分层离心法打破封闭的抗原决定簇的蛋白质分子与化学键间的交联起到洗脱细胞固定液的效果上起到增强，从而暴露抗原，达到抗原修复的作用，但脱落细胞绝大多数样本具有粘液，在进行化学双染色的情况下，因为涉及到多抗体，多染色，所以密度梯度分层离心法的要求更高，需要比较干净、无粘液的环境，具有粘液会增加样本的粘度，使得离心比较难打破封闭的抗原决定簇的蛋白质分子与化学键间的交联，化学双染色以及多染色的要求高使得该问题更加突出，使得最后的染色效果不理想。针对现有密度梯度分层离心法在化学双染色实验以及多染色中存在的不足，本发明创新性地在重力离心步骤前加入含有乙酸盐溶液，使溶液中的乙酸离子能有效溶解样本的粘液，使样本干净、无粘液，再在这个基础上进行密度梯度分层离心法，能够很好地打破封闭的抗原决定簇的蛋白质分子与化学键间的交联，起到洗脱细胞固定液的效果，从而暴露抗原，达到抗原修复的作用，能使双染色及多染色达到染色理想的效果。
附图说明
图1为第一组实验中的染色结果图；
图2为第二组实验中的染色结果图；
图3为第三组实验中的染色结果图；
图4为第四组实验中的染色结果图；
图5为第五组实验中的染色结果图；
图6为第六组实验中的染色结果图；
图7为第七组实验中的染色结果图；
图8为第八组实验中的染色结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1:
一种使用密度梯度分层离心法进行抗原修复的方法，步骤如下：
采集细胞样本的步骤,将宫颈标本采集刷刷头毛尖插入确诊为宫颈癌的志愿者的宫颈口。轻轻用力使刷头上的刷毛紧贴子宫颈口。用手捏住刷杆尾部，顺时针方向旋转五圈。取出采集刷，卸下刷头放入细胞保存液瓶中，封盖；
加入样本密度分离液的步骤：在离心管加入3ml样本密度分离液，所述样本密度分离液是丙三醇与乙醇的混合溶液，丙三醇与乙醇的体积比为1:2，一次性吸管吸取细胞样本6ml，沿离心管壁缓慢转移至离心管中；再沿离心管壁缓慢加入1ml 10％浓度乙酸钠溶液，所述样本密度分离液与细胞样本的体积比为7:3；
进行微重力离心步骤：在150g低速离心力作用下离心5min，然后将上层液体吸走；
进行重力离心步骤:剩余液体第二次离心在800g离心力作用下离心10min，最后缓慢倒掉上清液；
制备细胞悬液步骤：往含有细胞样本的沉淀物的离心管中加入添加2ml的缓冲液；最后用漩涡混匀器将离心管底部的细胞打散，制成细胞悬液。
实施例2:
一种使用密度梯度分层离心法进行抗原修复的方法，步骤如下：
采集细胞样本的步骤,将宫颈标本采集刷刷头毛尖插入确诊为宫颈癌的志愿者的宫颈口。轻轻用力使刷头上的刷毛紧贴子宫颈口。用手捏住刷杆尾部，顺时针方向旋转五圈。取出采集刷，卸下刷头放入细胞保存液瓶中，封盖；
加入样本密度分离液的步骤：在离心管加入3ml样本密度分离液，所述样本密度分离液是丙三醇与乙醇的混合溶液，丙三醇与乙醇的体积比为1:2，一次性吸管吸取细胞样本6ml，沿离心管壁缓慢转移至离心管中；再沿离心管壁缓慢加入1ml 30％浓度乙酸钠溶液，所述样本密度分离液与细胞样本的体积比为7:3；
进行微重力离心步骤：在150g低速离心力作用下离心5min，然后将上层液体吸走；
进行重力离心步骤:剩余液体第二次离心在800g离心力作用下离心10min，最后缓慢倒掉上清液；
制备细胞悬液步骤：往含有细胞样本的沉淀物的离心管中加入添加2ml的缓冲液；最后用漩涡混匀器将离心管底部的细胞打散，制成细胞悬液。
实施例3:
一种使用密度梯度分层离心法进行抗原修复的方法，步骤如下：
采集细胞样本的步骤,将宫颈标本采集刷刷头毛尖插入确诊为宫颈癌的志愿者的宫颈口。轻轻用力使刷头上的刷毛紧贴子宫颈口。用手捏住刷杆尾部，顺时针方向旋转五圈。取出采集刷，卸下刷头放入细胞保存液瓶中，封盖；
加入样本密度分离液的步骤：在离心管加入3ml样本密度分离液，所述样本密度分离液是丙三醇与乙醇的混合溶液，丙三醇与乙醇的体积比为2:1，一次性吸管吸取细胞样本6ml，沿离心管壁缓慢转移至离心管中；再沿离心管壁缓慢加入1ml 50％浓度乙酸钠溶液，所述样本密度分离液与细胞样本的体积比为3:7；
进行微重力离心步骤：在150g低速离心力作用下离心1min，然后将上层液体吸走；
进行重力离心步骤:剩余液体第二次离心在1500g离心力作用下离心10min，最后缓慢倒掉上清液；
制备细胞悬液步骤：往含有细胞样本的沉淀物的离心管中加入添加2ml的缓冲液；最后用漩涡混匀器将离心管底部的细胞打散，制成细胞悬液。
实施例4:
一种使用密度梯度分层离心法进行抗原修复的方法，步骤如下：
采集细胞样本的步骤,将宫颈标本采集刷刷头毛尖插入确诊为宫颈癌的志愿者的宫颈口。轻轻用力使刷头上的刷毛紧贴子宫颈口。用手捏住刷杆尾部，顺时针方向旋转五圈。取出采集刷，卸下刷头放入细胞保存液瓶中，封盖；
加入样本密度分离液的步骤：在离心管加入3ml样本密度分离液，所述样本密度分离液是丙三醇与乙醇的混合溶液，丙三醇与乙醇的体积比为2:1，一次性吸管吸取细胞样本6ml，沿离心管壁缓慢转移至离心管中；再沿离心管壁缓慢加入1ml 70％浓度乙酸钠溶液，所述样本密度分离液与细胞样本的体积比为4:6；
进行微重力离心步骤：在200g低速离心力作用下离心5min，然后将上层液体吸走；
进行重力离心步骤:剩余液体第二次离心在1500g离心力作用下离心5min，最后缓慢倒掉上清液；
制备细胞悬液步骤：往含有细胞样本的沉淀物的离心管中加入添加2ml的缓冲液；最后用漩涡混匀器将离心管底部的细胞打散，制成细胞悬液。
实施例5:
一种使用密度梯度分层离心法进行抗原修复的方法，步骤如下：
采集细胞样本的步骤：将宫颈标本采集刷刷头毛尖插入确诊为宫颈癌的志愿者的宫颈口。轻轻用力使刷头上的刷毛紧贴子宫颈口。用手捏住刷杆尾部，顺时针方向旋转五圈。取出采集刷，卸下刷头放入细胞保存液瓶中，封盖。
加入样本密度分离液的步骤：在离心管加入3ml样本密度分离液，所述样本密度分离液是丙三醇与乙醇的混合溶液，丙三醇与乙醇的体积比为2:1，一次性吸管吸取细胞样本6ml，沿离心管壁缓慢转移至离心管中；
进行微重力离心步骤：在150g低速离心力作用下离心5min，然后将上层液体吸走；
进行重力离心步骤:剩余液体第二次离心在1500g离心力作用下离心10min，最后缓慢倒掉上清液；
制备细胞悬液步骤：往含有细胞样本的沉淀物的离心管中加入添加2ml的缓冲液；最后用漩涡混匀器将离心管底部的细胞打散，制成细胞悬液。
效果实施例染色效果验证
设计8组实验：第一组：膜式制片方式(非离心法)+高温抗原修复；第二组：膜式制片方式(非离心法)+不进行高温抗原修复；第三组：仅采用密度梯度分层离心法制片方式(不加入乙酸钠溶液)+高温抗原修复；第四组：仅采用密度梯度分层离心法制片方式(不加入乙酸钠溶液)+不进行高温抗原修复；第五组：改良的密度梯度分层离心法制片方式(加入10％乙酸钠溶液)+不进行高温抗原修复；第六组：改良的密度梯度分层离心法制片方式(加入30％乙酸钠溶液)+不进行高温抗原修复；第七组：第七组：改良的密度梯度分层离心法制片方式(加入50％乙酸钠溶液)+不进行高温抗原修复；第八组：改良的密度梯度分层离心法制片方式(加入70％乙酸钠溶液)+不进行高温抗原修复。
1.各组制片步骤如下：
(1)第一组和第二组制片步骤：使用TCT膜式机制片，通过负压和正压将附在TCT膜管上的细胞吹在载玻片上。一个样本制备两个片子进行对照，将第一组片子进行高温修复，第二组不进行高温修复。
(2)第三组和第四组制片步骤：滴加800ml采用实施例5方法制得的细胞悬液到制片仓的载玻片上静止沉降10min，即可完成制片。该方案同一样本制备两张进行对照，一张进行高温修复(第三组)，即放置于高压锅中高压高温处理10min。，另一张不进行高温修复(第四组)。
(3)第五组制片步骤：滴加800ml采用实施例1方法制得的细胞悬液到制片仓的载玻片上静止沉降10min，即可完成制片。
(4)第六组制片步骤：滴加800ml采用实施例2方法制得的细胞悬液到制片仓的载玻片上静止沉降10min，即可完成制片。
(5)第七组制片步骤：滴加800ml采用实施例3方法制得的细胞悬液到制片仓的载玻片上静止沉降10min，即可完成制片。
(6)第八组制片步骤：滴加800ml采用实施例4方法制得的细胞悬液到制片仓的载玻片上静止沉降10min，即可完成制片。
2.进行化学染色步骤
(1)每张玻片磷酸缓冲液冲洗3次，每次1-2分钟；
(2)每张玻片滴加2-3滴内源性过氧化物酶阻断剂H2O2，室温下孵育10-20min。
(3)每张玻片磷酸缓冲液冲洗3次，每次1-2分钟；
(4)每张玻片滴加2-3滴或50-80ulBSA封闭液，室温下孵育10-20min；
(5)每张玻片滴加1-2滴稀释后的混合一抗溶液(鼠源抗P16抗体和兔源抗Ki-67抗体)，32℃恒温水浴30-60min；
(6)每张玻片磷酸缓冲液冲洗3次，每次1-2分钟；
(7)每张玻片滴加1-2滴混合二抗溶液(羊抗鼠HRP二抗和羊抗兔AP二抗)，32℃恒温水浴10-20min；
(8)每张玻片磷酸缓冲液冲洗3次，每次1-2分钟；
(9)每张玻片滴加2滴配置好的DAB显色A系统,显色A系统采用DAB kit(20×)试剂盒，其中DAB显色A系统为预先配置好的，配置步骤为在小试管中先加入80ul显色液A2(DAB底物液)，再加入4ul显色液A1(DAB色原液)，混匀后即成84ul显色液，配置后需在30min内使用完毕，如一次染多片可按比例增加配制量，在室温下染色时间约为5-10分钟，染色结果为棕黄色。
(10)磷酸缓冲液冲洗3次，每次1-2分钟；
(11)每张玻片滴加2滴配置好的AP-RED显色B系统，显色B系统采用AP-Red Kit试剂盒，其中AP-RED显色B系统为预先配置好，配置步骤为在小试管中将40ul显色液B1(染色色原液)，与40ul显色液B2(染色底物液)混匀后即成80ul显色液。配置后需在20min内使用完毕，室温下染色时间约为5-15分钟，染色结果为红色。
上述8组实验结果显示如下表：第一组进行高温修复与第二组不进行高温修复的染色效果差别很大，进行高温修复的样本片子为棕红色，不进行高温修复的样本片子为非特异性红色，不显黄棕色。而用本发明密度梯度分层离心法的制片方式(第三组和第四组)，在不进行高温抗原修复的操作下，染色效果仅为棕色，不染红色，进行高温抗原修复的为棕红色，第五组染色效果为棕色，不显红色，第六组到第八组染色结果为棕红色。
化学双染色实验效果表
综合上述化学双染色实验的结果可知，在不需要高温高压的条件下，对液基脱落细胞样本仅使用密度梯度分层离心法，其在双染色效果不好，仅显棕色，无法显红色，需经过高温抗原修复后才能达到较好的双染色效果，可显棕红色。而采用本发明提供技术方案，即在进行密度梯度分层离心前加入一定浓度的乙酸钠溶液，可达到与热修复法同样的抗原修复效果，其双染色效果良好，两次染色均能显色，最终呈棕红色，其直接用于化学染色实验的染色效果和经高温修复的染色效果基本无差别。由此可见，本发明提供的技术方案对抗原修复效果良好，在涉及到多抗体，多染色的情况下，加入乙酸钠溶液再进行密度梯度分层离心法，能够很好地打破封闭的抗原决定簇的蛋白质分子与化学键间的交联，起到洗脱细胞固定液的效果，从而暴露抗原，达到抗原修复的作用，能使双染达到染色理想的效果。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
Claims (6)
1.一种用于免疫细胞化学染色的抗原修复方法，其特征在于包括如下步骤，
采集细胞样本的步骤：
将宫颈标本采集刷刷头毛尖插入确诊为宫颈癌的志愿者的宫颈口；轻轻用力使刷头上的刷毛紧贴子宫颈口；用手捏住刷杆尾部，顺时针方向旋转五圈；取出采集刷，卸下刷头放入细胞保存液瓶中，封盖；
加入样本密度分离液的步骤：将细胞样本转移至离心管中，往离心管中加入样本密度分离液，并加入30%～70%质量浓度的乙酸盐溶液，所述样本密度分离液与所述乙酸盐溶液体积比为1:1～3:1；所述样本密度分离液为丙三醇与乙醇混合液，所述丙三醇与所述乙醇的体积比为(1-2):(2-1)，所述样本密度分离液与所述细胞样本的体积比为(3-7):(7-3);
重力离心步骤：所述重力离心步骤分两次进行，先进行微重力离心步骤，再进行第二步离心步骤，所述微重力离心步骤为：离心管在150g～200g离心力作用下离心1min～5min，完毕后将上层液体吸走；所述第二步离心步骤：剩余液体在800g～1500g离心力作用下离心5min～10min，完毕后，弃去上层废液，得到含有细胞样本的沉淀物；
制备细胞悬液步骤：往含有细胞样本的沉淀物的离心管中加入2mL缓冲液，将离心管底部的细胞打散，制成用于免疫细胞化学双染色的细胞悬液。
2.根据权利要求1所述的抗原修复方法，其特征在于，所述乙酸盐溶液质量浓度为30%-50%。
3.根据权利要求1所述的抗原修复方法，其特征在于，所述乙酸盐溶液为乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵、乙酸锌溶液中的一种或多种，所述样本密度分离液与所述乙酸盐溶液体积比为3:1。
4.一种免疫细胞化学染色方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求1所述的细胞悬液滴加到制片仓的载玻片上静止沉降，完成制片；
将上述载玻片用磷酸缓冲液冲洗，然后滴加内源性过氧化物酶阻断剂，室温下孵育；再用磷酸缓冲液冲洗，之后滴加封闭液，室温下孵育；
继续滴加稀释后的一抗溶液，32℃恒温水浴 30～60min；然后用磷酸缓冲液冲洗，再滴加二抗溶液，32℃恒温水浴 10～20min；再用磷酸缓冲液冲洗；最后滴加DAB 显色液，用磷酸缓冲液冲洗后，滴加AP-RED显色液。
5.根据权利要求4所述的免疫细胞化学染色方法，其特征在于，所述静止沉降时间为10min，所述磷酸缓冲液冲洗步骤需进行3次，每次1～2分钟；所述室温下孵育时间为10～20min。
6.根据权利要求5所述的免疫细胞化学染色方法，其特征在于，所述一抗溶液为鼠源抗P16抗体和兔源抗Ki-67抗体的混合溶液，所述二抗溶液为羊抗鼠HRP二抗和羊抗兔AP二抗混合溶液。
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