CN105241726A - 一种免疫细胞化学染色方法及其在宫颈肿瘤性病变筛查中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及肿瘤性病变的细胞学筛查技术领域，具体涉及一种免疫细胞化学染色方法及其在宫颈肿瘤性病变筛查中的应用，该方法包括如下步骤：得到含有样本细胞的沉淀物；得到含有样本细胞的悬浮液；得到细胞涂片或细胞芯片；取细胞涂片或细胞芯片，用固定液进行固定，将细胞芯片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，加入抗体或探针，再加入封闭液封闭背景后进行免疫细胞化学染色。本发明可以解决肿瘤性病变细胞学筛查的假阴性及假阳性问题，明显减轻病理医师的工作量及负担，解决细胞涂片中免疫化学及原位杂交染色的背景及非特异性上色问题，明显降低肿瘤筛查的人均费用。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤性病变的细胞学筛查技术领域，具体涉及一种免疫细胞化学染色方法及其在宫颈肿瘤性病变筛查中的应用。
背景技术
肿瘤性病变的细胞学筛查及诊断可以早期发现部分恶性肿瘤，现在普及开展的宫颈液基细胞学检查有效降低了宫颈癌的发生率和病死率。然而，以巴氏染色为基础的液基细胞检查有其天然的缺陷：⑴、宫颈活检中尚有一部分病变要依赖P16及Ki67的检测才能区别出是高级别病变（HSILE）还是对炎症的应激性改变，这一部分病例在巴氏染色的细胞学中无能为力；⑵、取材不当，不合格，送检标本中病变细胞过少；⑶、部分病例基因水平已改变且已造成P16升高，细胞周期失控，但形态学尚未改变；⑷、医生未受严格长期培训，阅片量未达到最低要求，镜下有很多病变细胞而医生不敢确认，据信，有些病理医生一年几千例液基片，从未发过HSILE；⑸、医生工作量过大，长时间疲劳阅片，导致漏诊率上升；⑹、制片技术未过关，人为改变细胞形态，病变细胞形态失真，无法辨认。
由于上述诸多原因，导致：大型三甲医院或顶级医疗中心，包括在病理医师训练严格的美国，假阴性率高达10%，基层医院比例更高。至于一年下来从未发过HSILE的医院，对于病人而言无异于灾难。参与宫颈癌筛查的人，如本已是HSILE或早癌，病理医师发一阴性报告，以后很长时间内，病人本身及给该病人诊疗的医生都会因这份假阴性报告而忽略早癌的相关症状（不体检反不会忽略），在这一过程中，病理医师帮了倒忙。因此，发展一种客观的指标帮助病理医师从大量的细胞中轻易发现病变细胞具有巨大的社会和经济效益。
导致宫颈癌的主要原因是人乳头瘤病毒（HPV）的持续感染，超过99%的宫颈癌都由高危型HPV引起，从正常宫颈发生病变继而进展到宫颈癌大概约需8-12年。宫颈癌癌前病变即宫颈上皮内瘤样病变（CIN）按严重程度可分为CIN1、CIN2和CIN3，不同阶段对应的治疗策略也不同。p16INK4a是多瘤抑制因子1（MTS1）基因p16的蛋白产物，逐渐受到广大临床医生的重视，它有助于辅助H&E判读，可显著提高CIN2、CIN3准确性和病理医师之间诊断的一致性。2012年，美国病理学会（CAP）和美国阴道镜与宫颈病理学会（ASCCP）的指南建议，使用特定克隆号（E6H4）的p16INK4a抗体作为检测HPV感染是否影响到细胞周期调控的生物标志物，该克隆号是全球唯一获得IVD认证的p16INK4a抗体。在世界卫生组织2014年出版的《女性生殖器官肿瘤分类》（WHOClassificationofTumoursofFemaleReproductiveOrgans）第4版中，明确指出宫颈、外阴和阴道鳞状上皮病变的诊断采用LAST（LowerAnogenitalSquamousTerminologyStandardizationofHPV-associatedNeoplasia，肛门及下生殖道HPV相关的鳞状上皮瘤变术语标准化）术语，应用二级分类命名法LSIL（Lowgradesquamousintraepitheliallesion，低级别鳞状上皮内病变）和HSIL（Highgradesquamousintraepitheliallesion，高级别鳞状上皮内病变），有利于诊断的一致性和可重复性，推荐使用p16INK4a作为辅助LSIL和HSIL诊断的分子生物学指标。
由CAP和ASCCP的LAST项目研究，通过对6,063篇摘要、1,210篇全文以及452组数据分析进行回顾，形成关于HPV组织病理学的命名推荐，参与讨论的涵盖病理和临床专业的44位委员与13位专家得出共识：采用二级命名法（LSIL和HSIL）更具可重复性，有利于病理医师和临床医师之间的交流。此外，加入p16INK4a检测可帮助对CIN进行更准确的分级。建议对临床医生较难处理的CIN1-CIN2样本，p16INK4a阳性时，可归为HSIL，判为CIN2；p16INK4a阴性则可判为CIN1，归为LSIL。
此外，LAST项目还证实，p16INK4a的应用对提高诊断一致性具有高质量证据，推荐在以下四种情况中使用p16INK4a：HSIL和类似非肿瘤性病变需要鉴别诊断时，如不成熟鳞化、萎缩、修复性上皮增生及人工操作所致假象；有疑问的CIN2；不同阅片人诊断意见不同；HPV检测、细胞学阴道镜提示有高级别病变可能，但组织学诊断为阴性。
大量研究数据还证实，CIN1/p16INK4a阳性进展为CIN2+的可能性远高于CIN1/p16INK4a阴性病变。因此，p16INK4a有助于判断低级别宫颈病变患者预后，为临床医生随访和治疗提供有力依据。
p16INK4a在病理活检上的应用价值甚大，如在细胞学筛查的基础上加染p16INK4a和Ki-67（细胞增殖指数）可以解决以上细胞学检查的诸多问题。然而，现有的文献现示，p16INK4a和Ki-67在组织学中对CIN病变具有高度特异性，在液基细胞学涂片中这种特异性却消失了，绝大部分研究发现涂片中的底层细胞、化生细胞和萎缩细胞都可阳性，当把液基细胞标本做成细胞蜡块切片以后，其特异性又回到组织学检查的水平。如果能在细胞涂片标本中就回复其特异性，就可以显著降低病理医生的工作量和误诊漏诊风险，也可以完全自动化和标准化，降低筛查成本，具有明显的经济和社会效益，为病人和临床医生带来福音。通过生物标志物p16INK4a和Ki-67，不仅有助于病理科医生对CIN进行准确分级，并且可以帮助临床医生更全面的认识癌前病变和宫颈癌的特点，有助于对患者选择更合理的方式，有效管理宫颈癌前病变，才能真正降低宫颈癌发病率和死亡率。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种免疫细胞化学染色方法，该方法步骤简单，操作控制方便，灵敏度高，特异性好。
本发明的另一目的在于提供一种免疫细胞化学染色方法在宫颈肿瘤性病变筛查中的应用，该应用可以为病理医师提供一种有效的客观指标，解决肿瘤性病变细胞学筛查的假阴性及假阳性问题，明显减轻病理医师的工作量及负担，解决细胞涂片中免疫化学及原位杂交染色的背景及非特异性上色问题，明显降低肿瘤筛查的人均费用。
本发明的另一目的在于提供一种应用免疫细胞化学染色方法进行肿瘤筛查的方法，该方法可以应用不同的标靶可对人体所有细胞学标本进行筛查检测，为病理医师提供一种有效的客观指标，解决肿瘤性病变细胞学筛查的假阴性及假阳性问题，明显减轻病理医师的工作量及负担，解决细胞涂片中免疫化学及原位杂交染色的背景及非特异性上色问题，明显降低肿瘤筛查的人均费用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种免疫细胞化学染色方法，包括如下步骤：
A、当检测单个样本的单个目标物时：
A1、取样本细胞的保存液加入添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到含有样本细胞的沉淀物；
A2、将步骤A1制得的含有样本细胞的沉淀物加入基液后混匀，得到含有样本细胞的悬浮液；
A3、取载玻片，将步骤A2制得的含有样本细胞的悬浮液加入载玻片的工作区域，烘干，得到细胞涂片；
A4、取步骤A3制得的细胞涂片，用固定液进行固定，将细胞涂片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，再加入封闭液封闭背景后进行免疫细胞化学染色；
B、当检测多个样本的单个目标物时：
B1、取至少两份含有不同样本细胞的保存液分别加入相应的添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到至少两份含有不同样本细胞的沉淀物；
B2、将步骤B1制得的至少两份含有不同样本细胞的沉淀物分别加入基液后混匀，得到至少两份含有不同样本细胞的悬浮液；
B3、取载玻片，在载玻片的工作区域画至少两个分隔区域并编号，将步骤B2制得的至少两份含有不同样本细胞的悬浮液分别加入相应的分隔区域，烘干，得到细胞芯片；
B4、取步骤B3制得的细胞芯片，用固定液进行固定，将细胞芯片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，再加入封闭液封闭背景后进行免疫细胞化学染色；
C、当检测单个样本的多个目标物时：
C1、取样本细胞的保存液加入添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到含有样本细胞的沉淀物；
C2、将步骤C1制得的含有样本细胞的沉淀物加入基液后混匀，得到含有样本细胞的悬浮液；
C3、取载玻片，在载玻片的工作区域画至少两个分隔区域并编号，将步骤C2制得的含有样本细胞的悬浮液分别加入每个分隔区域，烘干，得到细胞芯片；
C4、取步骤C3制得的细胞芯片，用固定液进行固定，将细胞芯片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，加入抗体或探针，再加入封闭液封闭背景后进行免疫细胞化学染色；
D、当检测多个样本的多个目标物时：
D1、取至少两份含有不同样本细胞的保存液分别加入相应的添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到至少两份含有不同样本细胞的沉淀物；
D2、将步骤D1制得的至少两份含有不同样本细胞的沉淀物分别加入基液后混匀，得到至少两份含有不同样本细胞的悬浮液；
D3、取载玻片，在载玻片的工作区域画至少两个分隔区域并编号，将步骤D2制得的至少两份含有不同样本细胞的悬浮液分别加入相应的分隔区域，烘干，得到细胞芯片；
D4、取步骤D3制得的细胞芯片，用固定液进行固定，将细胞芯片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，加入抗体或探针，再加入封闭液封闭背景后进行免疫细胞化学染色。
本发明的一种免疫细胞化学染色方法，该方法步骤简单，操作控制方便，灵敏度高，特异性好。
优选的，所述步骤A1、B1、C1和D1中，每升保存液由如下重量百分比的原料组成：醛类0.04%-2%、醇类10%-40%、酰胺类1%-20%、抗凝剂0.01%-1%，蒸馏水余量。所述醛类可以为丙二醛、丁二醛或多聚甲醛等，所述醇类可以为甲醇、乙醇或丙醇等，所述酰胺类可以为甲酰胺、乙酰胺或丙酰胺等，本发明的保存液通过采用上述原料，并严格控制各原料的配比，对细胞的保存效果好，还可以降低免疫细胞化学染色的背景。
优选的，所述步骤A1、B1、C1和D1中，每升分离液由如下重量百分比的原料组成：多元醇类3%-30%，蒸馏水余量。所述多元醇类为丙二醇、丁二醇或丙三醇等，本发明的分离液通过采用多元醇类，可以将病变细胞与细胞碎片、炎症细胞及粘液分离。
离心的转速为500-1500r/min，离心时间为5-10min。所述多元醇类为丙二醇等。本发明通过将离心的转速控制在500-1500r/min，离心时间控制在5-10min，可以将病变细胞与细胞碎片、炎症细胞及粘液分离。
优选的，所述步骤A2、B2、C2和D2中，基液由如下重量百分比的原料组成：多元醇类0.1%-10%、氯化钠0.2%-1%，蒸馏水余量。所述多元醇类为丙二醇、丁二醇或丙三醇等，所述多元醇类可以用海藻多糖等取代，多元醇类和海藻多糖可以保护生物分子的结构，低浓度的氯化钠有协同作用，本发明的基液通过采用上述原料，并严格控制各原料的配比，可以更好地保护生物分子的结构，制得的细胞芯片效果好。
所述步骤A3、B3、C3和D3中，烘干的温度为45-100℃，烘干时间为5-30min。本发明通过将烘干的温度控制在45-100℃，烘干时间控制在5-30min，可以防止细胞掉落，减少污染。
优选的，所述步骤A4、B4、C4和D4中，固定液是由丙酮、甲醇和氯仿以重量比1.5-2.5:1.5-2.5:1组成的混合物。本发明的固定液通过采用上述原料，并严格控制各原料的配比，对细胞的固定效果好。
优选的，所述步骤A4、B4、C4和D4中，采用梯度酒精水洗的具体步骤为：将细胞芯片先依次用无水酒精、质量分数为95%的酒精和质量分数为70%的酒精分别清洗50-70s，再用水冲洗3-5min，置于去离子水中备用。本发明采用梯度酒精水洗，可以逐步洗去固定液，清洗效果好。
优选的，所述步骤A4、B4、C4和D4中，修复液由如下原料组成：三羟甲基氨基甲烷28.27-32.27g、乙二胺四乙酸1.26-1.66g、蒸馏水500mL。本发明的修复液通过采用上述原料，并严格控制各原料的配比，可以提高抗原的检出率，降低背景染色，提高准确率。
优选的，所述步骤A4、B4、C4和D4中，封闭液由如下原料组成：脱脂奶粉45-55g、磷酸二氢钾0.25-0.29g、磷酸氢二钠1.32-1.52g、氯化钠7-9g、氯化钾0.15-0.25g、蒸馏水1L。本发明的封闭液通过采用上述原料，并严格控制各原料的配比，可以封闭免疫细胞化学染色的背景。
一种免疫细胞化学染色方法在肿瘤筛查领域的应用。
本发明的一种免疫细胞化学染色方法在宫颈肿瘤性病变筛查中的应用，该应用可以为病理医师提供一种有效的客观指标，解决肿瘤性病变细胞学筛查的假阴性及假阳性问题，明显减轻病理医师的工作量及负担，解决细胞涂片中免疫化学及原位杂交染色的背景及非特异性上色问题，明显降低肿瘤筛查的人均费用。
一种应用权利要求1-8任一项所述的免疫细胞化学染色方法进行肿瘤筛查的方法，其特征在于：包括如下步骤：
A、当检测单个样本的单个目标物时：
A1、取样本细胞的保存液加入添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到含有样本细胞的沉淀物；
A2、将步骤A1制得的含有样本细胞的沉淀物加入基液后混匀，得到含有样本细胞的悬浮液；
A3、取载玻片，将步骤A2制得的含有样本细胞的悬浮液加入载玻片的工作区域，烘干，得到细胞涂片；
A4、取至少两张步骤A3制得的细胞涂片，分别用固定液进行固定，将其中一张细胞涂片进行巴氏染色或HE染色；将其余细胞涂片进行原位杂交染色；或者，将其余细胞涂片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，再加入封闭液封闭背景后进行免疫细胞化学染色；
A5、将步骤A4中进行巴氏染色或HE染色后的细胞涂片和进行原位杂交染色或免疫细胞化学染色后的细胞涂片分别用显微镜进行观察比对，判断样本细胞为阳性或阴性；
B、当检测多个样本的单个目标物时：
B1、取至少两份含有不同样本细胞的保存液分别加入相应的添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到至少两份含有不同样本细胞的沉淀物；
B2、将步骤B1制得的至少两份含有不同样本细胞的沉淀物分别加入基液后混匀，得到至少两份含有不同样本细胞的悬浮液；
B3、取载玻片，在载玻片的工作区域画至少两个分隔区域并编号，将步骤B2制得的至少两份含有不同样本细胞的悬浮液分别加入相应的分隔区域，烘干，得到细胞芯片；
B4、取至少两张步骤B3制得的细胞芯片，分别用固定液进行固定，将其中一张细胞芯片进行巴氏染色或HE染色；将其余细胞芯片进行原位杂交染色；或者，将其余细胞芯片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，再加入封闭液封闭背景后进行免疫细胞化学染色；
B5、将步骤B4中进行巴氏染色或HE染色后的细胞芯片和进行原位杂交染色或免疫细胞化学染色后的细胞芯片分别用显微镜进行观察比对，判断样本细胞为阳性或阴性；
C、当检测单个样本的多个目标物时：
C1、取样本细胞的保存液加入添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到含有样本细胞的沉淀物；
C2、将步骤C1制得的含有样本细胞的沉淀物加入基液后混匀，得到含有样本细胞的悬浮液；
C3、取载玻片，在载玻片的工作区域画至少两个分隔区域并编号，将步骤C2制得的含有样本细胞的悬浮液分别加入每个分隔区域，烘干，得到细胞芯片；
C4、取至少两张步骤C3制得的细胞芯片，分别用固定液进行固定，将其中一张细胞芯片进行巴氏染色或HE染色；将其余细胞芯片进行原位杂交染色；或者，将其余细胞芯片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，加入抗体或探针，再加入封闭液封闭背景后进行免疫细胞化学染色；
C5、将步骤C4中进行巴氏染色或HE染色后的细胞芯片和进行原位杂交染色或免疫细胞化学染色后的细胞芯片分别用显微镜进行观察比对，判断样本细胞为阳性或阴性；
D、当检测多个样本的多个目标物时：
D1、取至少两份含有不同样本细胞的保存液分别加入相应的添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到至少两份含有不同样本细胞的沉淀物；
D2、将步骤D1制得的至少两份含有不同样本细胞的沉淀物分别加入基液后混匀，得到至少两份含有不同样本细胞的悬浮液；
D3、取载玻片，在载玻片的工作区域画至少两个分隔区域并编号，将步骤D2制得的至少两份含有不同样本细胞的悬浮液分别加入相应的分隔区域，烘干，得到细胞芯片；
D4、取至少两张步骤D3制得的细胞芯片，分别用固定液进行固定，将其中一张细胞芯片进行巴氏染色或HE染色；将其余细胞芯片进行原位杂交染色；或者，将其余细胞芯片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，加入抗体或探针，再加入封闭液封闭背景后进行免疫细胞化学染色；
D5、将步骤D4中进行巴氏染色或HE染色后的细胞芯片和进行原位杂交染色或免疫细胞化学染色后的细胞芯片分别用显微镜进行观察比对，判断样本细胞为阳性或阴性。
本发明的目标物是指样本细胞中的蛋白、核酸、肽类或多糖，如p53、p21、p27、p16和Ki-67等，当步骤1中的目标物为核酸时，步骤3中加入核酸探针；当步骤1中的目标物为蛋白、肽类或多糖时，步骤3中加入相应的蛋白抗体、肽类抗体或多糖抗体。具体地，当目标物为p16和Ki-67时，相应的抗体为鼠抗人p16单克隆抗体和鼠抗人Ki-67单克隆抗体，即进行p16和Ki-67双抗体免疫细胞化学染色。本发明所采用的抗体或探针均来自市售的试剂盒。
所述步骤A1、B1、C1和D1中，每升保存液由如下重量百分比的原料组成：醛类0.04%-2%、醇类10%-40%、酰胺类1%-20%、抗凝剂0.01%-1%，蒸馏水余量。
所述步骤A1、B1、C1和D1中，每升分离液由如下重量百分比的原料组成：多元醇类3%-30%，蒸馏水余量；离心的转速为500-1500r/min，离心时间为5-10min。
所述步骤A2、B2、C2和D2中，基液由如下重量百分比的原料组成：多元醇类0.1%-10%、氯化钠0.2%-1%，蒸馏水余量；所述步骤A3、B3、C3和D3中，烘干的温度为45-100℃，烘干时间为5-30min。
所述步骤A4、B4、C4和D4中，固定液是由丙酮、甲醇和氯仿以重量比1.5-2.5:1.5-2.5:1组成的混合物。
所述步骤A4、B4、C4和D4中，采用梯度酒精水洗的具体步骤为：将细胞芯片先依次用无水酒精、质量分数为95%的酒精和质量分数为70%的酒精分别清洗50-70s，再用水冲洗3-5min，置于去离子水中备用。
所述步骤A4、B4、C4和D4中，修复液由如下原料组成：三羟甲基氨基甲烷28.27-32.27g、乙二胺四乙酸1.26-1.66g、蒸馏水500mL。
所述步骤A4、B4、C4和D4中，封闭液由如下原料组成：脱脂奶粉45-55g、磷酸二氢钾0.25-0.29g、磷酸氢二钠1.32-1.52g、氯化钠7-9g、氯化钾0.15-0.25g、蒸馏水1L。
本发明的每个样本最少会在两张或以上细胞芯片上有待检测细胞，其中一张芯片进行巴氏或HE染色，其余细胞芯片分别根据所筛查标的选择是否进行免疫细胞化学染色或原位杂交染色，比如在宫颈癌筛查中进行免疫细胞化学染色，而在鼻咽癌筛查中则行EB病毒原位杂交染色，其他一些肿瘤筛查则可能进行两项免疫细胞化学染色，或者同时行原位杂交染色。
巴氏染色后的细胞芯片在显微镜下观察的结果：细胞核大小正常，核膜光滑，染色质较细，染色较淡，淡蓝色，核仁小，红色，核浆比例大小正常，胞浆随细胞分化成熟染成蓝绿色或红色，可判断样本细胞为正常细胞；细胞核增大，核膜皱缩不平，染色质粗颗粒状或成块，染色深，深蓝或深紫色，核浆比例增大，可见核分裂像，细胞形态变化多端，出现巨大或怪异细胞，可判断样本细胞为病变细胞。
HE染色后的细胞芯片在显微镜下观察的结果：细胞核大小正常，核膜光滑，染色质较细，染色较淡，淡蓝色，核仁小，红色，核浆比例大小正常，胞浆除含粘液外，都染成红色，可判断样本细胞为正常细胞；细胞核增大，核膜皱缩不平，染色质粗颗粒状或成块，染色深，深蓝或深紫色，核浆比例增大，可见核分裂像，细胞形态变化多端，出现巨大或怪异细胞，可判断样本细胞为病变细胞。
原位杂交染色后的细胞芯片在显微镜下观察的结果：仅有淡染的显示细胞轮廓淡蓝色，可判断样本细胞为正常细胞；根据所选择的酶和底物不同，染成红色或棕黄色，可判断样本细胞为病变细胞。
免疫细胞化学染色后的细胞芯片在显微镜下观察的结果：仅有淡染的显示细胞轮廓淡蓝色可判断样本细胞为正常细胞；根据所选择的酶和底物不同，染成棕黄色，可判断样本细胞为病变细胞。
本发明的一种应用免疫细胞化学染色方法进行肿瘤筛查的方法，该方法可以应用不同的标靶可对人体所有细胞学标本进行筛查检测，为病理医师提供一种有效的客观指标，解决肿瘤性病变细胞学筛查的假阴性及假阳性问题，明显减轻病理医师的工作量及负担，解决细胞涂片中免疫化学及原位杂交染色的背景及非特异性上色问题，明显降低肿瘤筛查的人均费用。
本发明的有益效果在于：本发明的一种免疫细胞化学染色方法，该方法步骤简单，操作控制方便，灵敏度高，特异性好。
本发明的一种免疫细胞化学染色方法在宫颈肿瘤性病变筛查中的应用，该应用可以为病理医师提供一种有效的客观指标，解决肿瘤性病变细胞学筛查的假阴性及假阳性问题，明显减轻病理医师的工作量及负担，解决细胞涂片中免疫化学及原位杂交染色的背景及非特异性上色问题，明显降低肿瘤筛查的人均费用。
本发明的一种应用免疫细胞化学染色方法进行肿瘤筛查的方法，该方法可以应用不同的标靶可对人体所有细胞学标本进行筛查检测，为病理医师提供一种有效的客观指标，解决肿瘤性病变细胞学筛查的假阴性及假阳性问题，明显减轻病理医师的工作量及负担，解决细胞涂片中免疫化学及原位杂交染色的背景及非特异性上色问题，明显降低肿瘤筛查的人均费用。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
实施例1
一种免疫细胞化学染色方法，包括如下步骤：
A、当检测单个样本的单个目标物时：
A1、取样本细胞的保存液加入添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到含有样本细胞的沉淀物；
A2、将步骤A1制得的含有样本细胞的沉淀物加入基液后混匀，得到含有样本细胞的悬浮液；
A3、取载玻片，将步骤A2制得的含有样本细胞的悬浮液加入载玻片的工作区域，烘干，得到细胞涂片；
A4、取步骤A3制得的细胞涂片，用固定液进行固定，将细胞涂片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，再加入封闭液封闭背景后进行免疫细胞化学染色。
所述步骤A1、B1、C1和D1中，每升保存液由如下重量百分比的原料组成：丙二醛0.04%、甲醇10%、甲酰胺1%、抗凝剂0.01%，蒸馏水余量。
所述步骤A1、B1、C1和D1中，每升分离液由如下重量百分比的原料组成：丙二醇3%，蒸馏水余量；离心的转速为500r/min，离心时间为10min。
所述步骤A2、B2、C2和D2中，基液由如下重量百分比的原料组成：丙二醇0.1%、氯化钠0.2%，蒸馏水余量；所述步骤A3、B3、C3和D3中，烘干的温度为45℃，烘干时间为30min。
所述步骤A4、B4、C4和D4中，固定液是由丙酮、甲醇和氯仿以重量比1.5:1.5:1组成的混合物。
所述步骤A4、B4、C4和D4中，采用梯度酒精水洗的具体步骤为：将细胞芯片先依次用无水酒精、质量分数为95%的酒精和质量分数为70%的酒精分别清洗50s，再用水冲洗3min，置于去离子水中备用。
所述步骤A4、B4、C4和D4中，修复液由如下原料组成：三羟甲基氨基甲烷28.27g、乙二胺四乙酸1.26g、蒸馏水500mL。
所述步骤A4、B4、C4和D4中，封闭液由如下原料组成：脱脂奶粉45g、磷酸二氢钾0.25g、磷酸氢二钠1.32g、氯化钠7g、氯化钾0.15g、蒸馏水1L。
一种免疫细胞化学染色方法在肿瘤筛查领域的应用。
一种应用免疫细胞化学染色方法进行肿瘤筛查的方法，包括如下步骤：
A、当检测单个样本的单个目标物时：
A1、取样本细胞的保存液加入添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到含有样本细胞的沉淀物；
A2、将步骤A1制得的含有样本细胞的沉淀物加入基液后混匀，得到含有样本细胞的悬浮液；
A3、取载玻片，将步骤A2制得的含有样本细胞的悬浮液加入载玻片的工作区域，烘干，得到细胞涂片；
A4、取至少两张步骤A3制得的细胞涂片，分别用固定液进行固定，将其中一张细胞涂片进行巴氏染色或HE染色；将其余细胞涂片进行原位杂交染色；或者，将其余细胞涂片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，再加入封闭液封闭背景后进行免疫细胞化学染色；
A5、将步骤A4中进行巴氏染色或HE染色后的细胞涂片和进行原位杂交染色或免疫细胞化学染色后的细胞涂片分别用显微镜进行观察比对，判断样本细胞为阳性或阴性。
实施例2
一种免疫细胞化学染色方法，包括如下步骤：
B、当检测多个样本的单个目标物时：
B1、取至少两份含有不同样本细胞的保存液分别加入相应的添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到至少两份含有不同样本细胞的沉淀物；
B2、将步骤B1制得的至少两份含有不同样本细胞的沉淀物分别加入基液后混匀，得到至少两份含有不同样本细胞的悬浮液；
B3、取载玻片，在载玻片的工作区域画至少两个分隔区域并编号，将步骤2制得的至少两份含有不同样本细胞的悬浮液分别加入相应的分隔区域，烘干，得到细胞芯片；
B4、取步骤B3制得的细胞芯片，用固定液进行固定，将细胞芯片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，再加入封闭液封闭背景后进行免疫细胞化学染色。
所述步骤A1、B1、C1和D1中，每升保存液由如下重量百分比的原料组成：丁二醛0.5%、乙醇20%、乙酰胺5%、抗凝剂0.05%，蒸馏水余量。
所述步骤A1、B1、C1和D1中，每升分离液由如下重量百分比的原料组成：丁二醇10%，蒸馏水余量；离心的转速为800r/min，离心时间为8min。
所述步骤A2、B2、C2和D2中，基液由如下重量百分比的原料组成：丁二醇0.5%、氯化钠0.4%，蒸馏水余量；所述步骤A3、B3、C3和D3中，烘干的温度为60℃，烘干时间为20min。
所述步骤A4、B4、C4和D4中，固定液是由丙酮、甲醇和氯仿以重量比1.8:1.8:1组成的混合物。
所述步骤A4、B4、C4和D4中，采用梯度酒精水洗的具体步骤为：将细胞芯片先依次用无水酒精、质量分数为95%的酒精和质量分数为70%的酒精分别清洗55s，再用水冲洗3.5min，置于去离子水中备用。
所述步骤A4、B4、C4和D4中，修复液由如下原料组成：三羟甲基氨基甲烷29.27g、乙二胺四乙酸1.36g、蒸馏水500mL。
所述步骤A4、B4、C4和D4中，封闭液由如下原料组成：脱脂奶粉48g、磷酸二氢钾0.26g、磷酸氢二钠1.37g、氯化钠7.5g、氯化钾0.18g、蒸馏水1L。
一种免疫细胞化学染色方法在肿瘤筛查领域的应用。
一种应用免疫细胞化学染色方法进行肿瘤筛查的方法，包括如下步骤：
B、当检测多个样本的单个目标物时：
B1、取至少两份含有不同样本细胞的保存液分别加入相应的添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到至少两份含有不同样本细胞的沉淀物；
B2、将步骤B1制得的至少两份含有不同样本细胞的沉淀物分别加入基液后混匀，得到至少两份含有不同样本细胞的悬浮液；
B3、取载玻片，在载玻片的工作区域画至少两个分隔区域并编号，将步骤B2制得的至少两份含有不同样本细胞的悬浮液分别加入相应的分隔区域，烘干，得到细胞芯片；
B4、取至少两张步骤B3制得的细胞芯片，分别用固定液进行固定，将其中一张细胞芯片进行巴氏染色或HE染色；将其余细胞芯片进行原位杂交染色；或者，将其余细胞芯片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，再加入封闭液封闭背景后进行免疫细胞化学染色；
B5、将步骤B4中进行巴氏染色或HE染色后的细胞芯片和进行原位杂交染色或免疫细胞化学染色后的细胞芯片分别用显微镜进行观察比对，判断样本细胞为阳性或阴性。
实施例3
一种免疫细胞化学染色方法，包括如下步骤：
C、当检测单个样本的多个目标物时：
C1、取样本细胞的保存液加入添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到含有样本细胞的沉淀物；
C2、将步骤C1制得的含有样本细胞的沉淀物加入基液后混匀，得到含有样本细胞的悬浮液；
C3、取载玻片，在载玻片的工作区域画至少两个分隔区域并编号，将步骤C2制得的含有样本细胞的悬浮液分别加入每个分隔区域，烘干，得到细胞芯片；
C4、取步骤C3制得的细胞芯片，用固定液进行固定，将细胞芯片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，加入抗体或探针，再加入封闭液封闭背景后进行免疫细胞化学染色。
所述步骤A1、B1、C1和D1中，每升保存液由如下重量百分比的原料组成：多聚甲醛1%、丙醇25%、丙酰胺10%、抗凝剂0.1%，蒸馏水余量。
所述步骤A1、B1、C1和D1中，每升分离液由如下重量百分比的原料组成：丙三醇15%，蒸馏水余量；离心的转速为1000r/min，离心时间为7min。
所述步骤A2、B2、C2和D2中，基液由如下重量百分比的原料组成：丙三醇1%、氯化钠0.6%，蒸馏水余量；所述步骤A3、B3、C3和D3中，烘干的温度为80℃，烘干时间为15min。
所述步骤A4、B4、C4和D4中，固定液是由丙酮、甲醇和氯仿以重量比2:2:1组成的混合物。
所述步骤A4、B4、C4和D4中，采用梯度酒精水洗的具体步骤为：将细胞芯片先依次用无水酒精、质量分数为95%的酒精和质量分数为70%的酒精分别清洗60s，再用水冲洗4min，置于去离子水中备用。
所述步骤A4、B4、C4和D4中，修复液由如下原料组成：三羟甲基氨基甲烷30.27g、乙二胺四乙酸1.46g、蒸馏水500mL。
所述步骤A4、B4、C4和D4中，封闭液由如下原料组成：脱脂奶粉50g、磷酸二氢钾0.27g、磷酸氢二钠1.42g、氯化钠8g、氯化钾0.2g、蒸馏水1L。
一种免疫细胞化学染色方法在肿瘤筛查领域的应用。
一种应用免疫细胞化学染色方法进行肿瘤筛查的方法，包括如下步骤：
C、当检测单个样本的多个目标物时：
C1、取样本细胞的保存液加入添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到含有样本细胞的沉淀物；
C2、将步骤C1制得的含有样本细胞的沉淀物加入基液后混匀，得到含有样本细胞的悬浮液；
C3、取载玻片，在载玻片的工作区域画至少两个分隔区域并编号，将步骤C2制得的含有样本细胞的悬浮液分别加入每个分隔区域，烘干，得到细胞芯片；
C4、取至少两张步骤C3制得的细胞芯片，分别用固定液进行固定，将其中一张细胞芯片进行巴氏染色或HE染色；将其余细胞芯片进行原位杂交染色；或者，将其余细胞芯片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，加入抗体或探针，再加入封闭液封闭背景后进行免疫细胞化学染色；
C5、将步骤C4中进行巴氏染色或HE染色后的细胞芯片和进行原位杂交染色或免疫细胞化学染色后的细胞芯片分别用显微镜进行观察比对，判断样本细胞为阳性或阴性。
实施例4
一种免疫细胞化学染色方法，包括如下步骤：
D、当检测多个样本的多个目标物时：
D1、取至少两份含有不同样本细胞的保存液分别加入相应的添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到至少两份含有不同样本细胞的沉淀物；
D2、将步骤D1制得的至少两份含有不同样本细胞的沉淀物分别加入基液后混匀，得到至少两份含有不同样本细胞的悬浮液；
D3、取载玻片，在载玻片的工作区域画至少两个分隔区域并编号，将步骤D2制得的至少两份含有不同样本细胞的悬浮液分别加入相应的分隔区域，烘干，得到细胞芯片；
D4、取步骤D3制得的细胞芯片，用固定液进行固定，将细胞芯片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，加入抗体或探针，再加入封闭液封闭背景后进行免疫细胞化学染色。
所述步骤A1、B1、C1和D1中，每升保存液由如下重量百分比的原料组成：丙二醛1.5%、乙醇30%、乙酰胺15%、抗凝剂0.5%，蒸馏水余量。
所述步骤A1、B1、C1和D1中，每升分离液由如下重量百分比的原料组成：丙二醇20%，蒸馏水余量；离心的转速为1200r/min，离心时间为6min。
所述步骤A2、B2、C2和D2中，基液由如下重量百分比的原料组成：丙二醇5%、氯化钠0.8%，蒸馏水余量；所述步骤A3、B3、C3和D3中，烘干的温度为90℃，烘干时间为10min。
所述步骤A4、B4、C4和D4中，固定液是由丙酮、甲醇和氯仿以重量比2.2:2.2:1组成的混合物。
所述步骤A4、B4、C4和D4中，采用梯度酒精水洗的具体步骤为：将细胞芯片先依次用无水酒精、质量分数为95%的酒精和质量分数为70%的酒精分别清洗65s，再用水冲洗4.5min，置于去离子水中备用。
所述步骤A4、B4、C4和D4中，修复液由如下原料组成：三羟甲基氨基甲烷31.27g、乙二胺四乙酸1.56g、蒸馏水500mL。
所述步骤A4、B4、C4和D4中，封闭液由如下原料组成：脱脂奶粉52g、磷酸二氢钾0.28g、磷酸氢二钠1.47g、氯化钠8.5g、氯化钾0.22g、蒸馏水1L。
一种免疫细胞化学染色方法在肿瘤筛查领域的应用。
一种应用免疫细胞化学染色方法进行肿瘤筛查的方法，包括如下步骤：
D、当检测多个样本的多个目标物时：
D1、取至少两份含有不同样本细胞的保存液分别加入相应的添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到至少两份含有不同样本细胞的沉淀物；
D2、将步骤D1制得的至少两份含有不同样本细胞的沉淀物分别加入基液后混匀，得到至少两份含有不同样本细胞的悬浮液；
D3、取载玻片，在载玻片的工作区域画至少两个分隔区域并编号，将步骤D2制得的至少两份含有不同样本细胞的悬浮液分别加入相应的分隔区域，烘干，得到细胞芯片；
D4、取至少两张步骤D3制得的细胞芯片，分别用固定液进行固定，将其中一张细胞芯片进行巴氏染色或HE染色；将其余细胞芯片进行原位杂交染色；或者，将其余细胞芯片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，加入抗体或探针，再加入封闭液封闭背景后进行免疫细胞化学染色；
D5、将步骤D4中进行巴氏染色或HE染色后的细胞芯片和进行原位杂交染色或免疫细胞化学染色后的细胞芯片分别用显微镜进行观察比对，判断样本细胞为阳性或阴性。
实施例5
一种免疫细胞化学染色方法，包括如下步骤：
C、当检测单个样本的多个目标物（p16和Ki-67）时；
C1、取样本细胞的保存液加入添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到含有样本细胞的沉淀物；
C2、将步骤C1制得的含有样本细胞的沉淀物加入基液后混匀，得到含有样本细胞的悬浮液；
C3、取载玻片，在载玻片的工作区域画至少两个分隔区域并编号，将步骤C2制得的含有样本细胞的悬浮液分别加入每个分隔区域，烘干，得到细胞芯片；
C4、取步骤C3制得的细胞芯片，用固定液进行固定，将细胞芯片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，加入抗体或探针，再加入封闭液封闭背景后进行p16和Ki-67双抗体免疫细胞化学染色。
所述步骤A1、B1、C1和D1中，每升保存液由如下重量百分比的原料组成：多聚甲醛2%、乙醇40%、丙酰胺20%、抗凝剂1%，蒸馏水余量。
所述步骤A1、B1、C1和D1中，每升分离液由如下重量百分比的原料组成：丙二醇30%，蒸馏水余量；离心的转速为1500r/min，离心时间为5min。
所述步骤A2、B2、C2和D2中，基液由如下重量百分比的原料组成：丙三醇10%、氯化钠1%，蒸馏水余量；所述步骤A3、B3、C3和D3中，烘干的温度为100℃，烘干时间为5min。
所述步骤A4、B4、C4和D4中，固定液是由丙酮、甲醇和氯仿以重量比2.5:2.5:1组成的混合物。
所述步骤A4、B4、C4和D4中，采用梯度酒精水洗的具体步骤为：将细胞芯片先依次用无水酒精、质量分数为95%的酒精和质量分数为70%的酒精分别清洗70s，再用水冲洗5min，置于去离子水中备用。
所述步骤A4、B4、C4和D4中，修复液由如下原料组成：三羟甲基氨基甲烷32.27g、乙二胺四乙酸1.66g、蒸馏水500mL。
所述步骤A4、B4、C4和D4中，封闭液由如下原料组成：脱脂奶粉55g、磷酸二氢钾0.29g、磷酸氢二钠1.52g、氯化钠9g、氯化钾0.25g、蒸馏水1L。
一种免疫细胞化学染色方法在肿瘤筛查领域的应用。
一种应用免疫细胞化学染色方法进行肿瘤筛查的方法，包括如下步骤：
C、当检测单个样本的p16和Ki-67时；
C1、取样本细胞的保存液加入添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到含有样本细胞的沉淀物；
C2、将步骤C1制得的含有样本细胞的沉淀物加入基液后混匀，得到含有样本细胞的悬浮液；
C3、取载玻片，在载玻片的工作区域画至少两个分隔区域并编号，将步骤C2制得的含有样本细胞的悬浮液分别加入每个分隔区域，烘干，得到细胞芯片；
C4、取至少两张步骤C3制得的细胞芯片，分别用固定液进行固定，将其中一张细胞芯片进行巴氏染色或HE染色；将其余细胞芯片进行原位杂交染色；或者，将其余细胞芯片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，加入鼠抗人p16单克隆抗体和鼠抗人Ki-67单克隆抗体，再加入封闭液封闭背景后进行p16和Ki-67双抗体免疫细胞化学染色；
C5、将步骤C4中进行巴氏染色或HE染色后的细胞芯片和进行原位杂交染色或免疫细胞化学染色后的细胞芯片分别用显微镜进行观察比对，判断样本细胞为阳性或阴性。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种免疫细胞化学染色方法，其特征在于：包括如下步骤：
A、当检测单个样本的单个目标物时：
A1、取样本细胞的保存液加入添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到含有样本细胞的沉淀物；
A2、将步骤A1制得的含有样本细胞的沉淀物加入基液后混匀，得到含有样本细胞的悬浮液；
A3、取载玻片，将步骤A2制得的含有样本细胞的悬浮液加入载玻片的工作区域，烘干，得到细胞涂片；
A4、取步骤A3制得的细胞涂片，用固定液进行固定，将细胞涂片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，再加入封闭液封闭背景后进行免疫细胞化学染色；
B、当检测多个样本的单个目标物时：
B1、取至少两份含有不同样本细胞的保存液分别加入相应的添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到至少两份含有不同样本细胞的沉淀物；
B2、将步骤B1制得的至少两份含有不同样本细胞的沉淀物分别加入基液后混匀，得到至少两份含有不同样本细胞的悬浮液；
B3、取载玻片，在载玻片的工作区域画至少两个分隔区域并编号，将步骤B2制得的至少两份含有不同样本细胞的悬浮液分别加入相应的分隔区域，烘干，得到细胞芯片；
B4、取步骤B3制得的细胞芯片，用固定液进行固定，将细胞芯片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，再加入封闭液封闭背景后进行免疫细胞化学染色；
C、当检测单个样本的多个目标物时：
C1、取样本细胞的保存液加入添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到含有样本细胞的沉淀物；
C2、将步骤C1制得的含有样本细胞的沉淀物加入基液后混匀，得到含有样本细胞的悬浮液；
C3、取载玻片，在载玻片的工作区域画至少两个分隔区域并编号，将步骤C2制得的含有样本细胞的悬浮液分别加入每个分隔区域，烘干，得到细胞芯片；
C4、取步骤C3制得的细胞芯片，用固定液进行固定，将细胞芯片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，加入抗体或探针，再加入封闭液封闭背景后进行免疫细胞化学染色；
D、当检测多个样本的多个目标物时：
D1、取至少两份含有不同样本细胞的保存液分别加入相应的添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到至少两份含有不同样本细胞的沉淀物；
D2、将步骤D1制得的至少两份含有不同样本细胞的沉淀物分别加入基液后混匀，得到至少两份含有不同样本细胞的悬浮液；
D3、取载玻片，在载玻片的工作区域画至少两个分隔区域并编号，将步骤D2制得的至少两份含有不同样本细胞的悬浮液分别加入相应的分隔区域，烘干，得到细胞芯片；
D4、取步骤D3制得的细胞芯片，用固定液进行固定，将细胞芯片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，加入抗体或探针，再加入封闭液封闭背景后进行免疫细胞化学染色。
2.根据权利要求1所述的一种免疫细胞化学染色方法，其特征在于：所述步骤A1、B1、C1和D1中，每升保存液由如下重量百分比的原料组成：醛类0.04%-2%、醇类10%-40%、酰胺类1%-20%、抗凝剂0.01%-1%，蒸馏水余量。
3.根据权利要求1所述的一种免疫细胞化学染色方法，其特征在于：所述步骤A1、B1、C1和D1中，每升分离液由如下重量百分比的原料组成：多元醇类3%-30%，蒸馏水余量；离心的转速为500-1500r/min，离心时间为5-10min。
4.根据权利要求1所述的一种免疫细胞化学染色方法，其特征在于：所述步骤A2、B2、C2和D2中，基液由如下重量百分比的原料组成：多元醇类0.1%-10%、氯化钠0.2%-1%，蒸馏水余量；所述步骤A3、B3、C3和D3中，烘干的温度为45-100℃，烘干时间为5-30min。
5.根据权利要求1所述的一种免疫细胞化学染色方法，其特征在于：所述步骤A4、B4、C4和D4中，固定液是由丙酮、甲醇和氯仿以重量比1.5-2.5:1.5-2.5:1组成的混合物。
6.根据权利要求1所述的一种免疫细胞化学染色方法，其特征在于：所述步骤A4、B4、C4和D4中，采用梯度酒精水洗的具体步骤为：将细胞芯片先依次用无水酒精、质量分数为95%的酒精和质量分数为70%的酒精分别清洗50-70s，再用水冲洗3-5min，置于去离子水中备用。
7.根据权利要求1所述的一种免疫细胞化学染色方法，其特征在于：所述步骤A4、B4、C4和D4中，修复液由如下原料组成：三羟甲基氨基甲烷28.27-32.27g、乙二胺四乙酸1.26-1.66g、蒸馏水500mL。
8.根据权利要求1所述的一种免疫细胞化学染色方法，其特征在于：所述步骤A4、B4、C4和D4中，封闭液由如下原料组成：脱脂奶粉45-55g、磷酸二氢钾0.25-0.29g、磷酸氢二钠1.32-1.52g、氯化钠7-9g、氯化钾0.15-0.25g、蒸馏水1L。
9.如权利要求1-8任一项所述的一种免疫细胞化学染色方法在肿瘤筛查领域的应用。
10.一种应用权利要求1-8任一项所述的免疫细胞化学染色方法进行肿瘤筛查的方法，其特征在于：包括如下步骤：
A、当检测单个样本的单个目标物时：
A1、取样本细胞的保存液加入添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到含有样本细胞的沉淀物；
A2、将步骤A1制得的含有样本细胞的沉淀物加入基液后混匀，得到含有样本细胞的悬浮液；
A3、取载玻片，将步骤A2制得的含有样本细胞的悬浮液加入载玻片的工作区域，烘干，得到细胞涂片；
A4、取至少两张步骤A3制得的细胞涂片，分别用固定液进行固定，将其中一张细胞涂片进行巴氏染色或HE染色；将其余细胞涂片进行原位杂交染色；或者，将其余细胞涂片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，再加入封闭液封闭背景后进行免疫细胞化学染色；
A5、将步骤A4中进行巴氏染色或HE染色后的细胞涂片和进行原位杂交染色或免疫细胞化学染色后的细胞涂片分别用显微镜进行观察比对，判断样本细胞为阳性或阴性；
B、当检测多个样本的单个目标物时：
B1、取至少两份含有不同样本细胞的保存液分别加入相应的添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到至少两份含有不同样本细胞的沉淀物；
B2、将步骤B1制得的至少两份含有不同样本细胞的沉淀物分别加入基液后混匀，得到至少两份含有不同样本细胞的悬浮液；
B3、取载玻片，在载玻片的工作区域画至少两个分隔区域并编号，将步骤B2制得的至少两份含有不同样本细胞的悬浮液分别加入相应的分隔区域，烘干，得到细胞芯片；
B4、取至少两张步骤B3制得的细胞芯片，分别用固定液进行固定，将其中一张细胞芯片进行巴氏染色或HE染色；将其余细胞芯片进行原位杂交染色；或者，将其余细胞芯片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，再加入封闭液封闭背景后进行免疫细胞化学染色；
B5、将步骤B4中进行巴氏染色或HE染色后的细胞芯片和进行原位杂交染色或免疫细胞化学染色后的细胞芯片分别用显微镜进行观察比对，判断样本细胞为阳性或阴性；
C、当检测单个样本的多个目标物时：
C1、取样本细胞的保存液加入添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到含有样本细胞的沉淀物；
C2、将步骤C1制得的含有样本细胞的沉淀物加入基液后混匀，得到含有样本细胞的悬浮液；
C3、取载玻片，在载玻片的工作区域画至少两个分隔区域并编号，将步骤C2制得的含有样本细胞的悬浮液分别加入每个分隔区域，烘干，得到细胞芯片；
C4、取至少两张步骤C3制得的细胞芯片，分别用固定液进行固定，将其中一张细胞芯片进行巴氏染色或HE染色；将其余细胞芯片进行原位杂交染色；或者，将其余细胞芯片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，加入抗体或探针，再加入封闭液封闭背景后进行免疫细胞化学染色；
C5、将步骤C4中进行巴氏染色或HE染色后的细胞芯片和进行原位杂交染色或免疫细胞化学染色后的细胞芯片分别用显微镜进行观察比对，判断样本细胞为阳性或阴性；
D、当检测多个样本的多个目标物时：
D1、取至少两份含有不同样本细胞的保存液分别加入相应的添加有分离液的离心管中，离心，弃去上层废液，得到至少两份含有不同样本细胞的沉淀物；
D2、将步骤D1制得的至少两份含有不同样本细胞的沉淀物分别加入基液后混匀，得到至少两份含有不同样本细胞的悬浮液；
D3、取载玻片，在载玻片的工作区域画至少两个分隔区域并编号，将步骤D2制得的至少两份含有不同样本细胞的悬浮液分别加入相应的分隔区域，烘干，得到细胞芯片；
D4、取至少两张步骤D3制得的细胞芯片，分别用固定液进行固定，将其中一张细胞芯片进行巴氏染色或HE染色；将其余细胞芯片进行原位杂交染色；或者，将其余细胞芯片采用梯度酒精水洗，然后加入修复液进行抗原修复，加入抗体或探针，再加入封闭液封闭背景后进行免疫细胞化学染色；
D5、将步骤D4中进行巴氏染色或HE染色后的细胞芯片和进行原位杂交染色或免疫细胞化学染色后的细胞芯片分别用显微镜进行观察比对，判断样本细胞为阳性或阴性。
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