CN1360059A - 通过同时测量至少2种不同分子标记物而特异性检测子宫颈涂片中肿瘤细胞及其前体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种获得子宫颈涂片中癌症及其癌前期的改进诊断的自动化方法,所述的方法使用抗体或核酸探针、通过同时染色和检测细胞中至少两种不同的分子标记物来进行,所述的分子标记物在基因表达中表现出与疾病相关的变化。

Description

通过同时测量至少2种不同分子标记物而特异性 检测子宫颈涂片中肿瘤细胞及其前体的方法
背景技术
癌性疾病仍然是全球最常见的致死原因之一。临床上需要癌症和癌前期的早期识别和特定检测方法，以便通过早期治疗性干预预防肿瘤恶化。因此，自二十世纪五十年代开始业已为多种癌症(特别是子宫颈、乳腺和肠)提供了预防程序，许多国家利用这些程序已经使死亡率降低。
在妇女宫颈癌的情况中，医疗检查主要是基于取自子宫颈的细胞涂片的形态/细胞学检查，即它被称作PAP试验。然而，这种试验只具有有限的灵敏度(最高达40％错误阴性诊断，Duggan等；1998，EurJ Gynaecol Oncol；19：209-214；Bishop等，1996，Buss Pan AmHealth Organ，30，378-86)。而且，最多达10％的涂片被划分为ASCUS(未确定意义的非典型鳞状细胞)，也就是无法明确地将其归类为正常、中等或严重的损伤或肿瘤。但是，经验显示至多10％的这种ASCUS群会由真性损伤构成，由此也被忽视(Manos等，1999，JAMA，281，1605-1610)。如果发现了异常细胞，会进行附加诊断程序，例如阴道窥器检查或取活组织检查，这样可以利用这些方法的结果达到更加准确的诊断并在治疗上作出决定，例如手术摘除病变区域或激光疗法。
近年来业已鉴定了大量的基因，作为突变的结果，它们导致其蛋白的表达发生改变，并由此在癌症的恶化中发挥作用。在血清和细胞水平均可以检测出作为诊断标记物的相应蛋白质。所述的蛋白质参与细胞的生理调节过程，例如生长调控(增殖基因，例如Ki67和mcm-5；致癌基因和肿瘤抑制基因，例如p16、EGF受体、her2/neu和mdm-2)、细胞凋亡(自然细胞死亡，例如p53和bcl-2)、DNA修复(msh-1)和细胞粘着(E-钙粘着蛋白、β-连环蛋白和APC)。检测标记物的适宜方法的实例为免疫组织化学和免疫细胞化学检测法，其利用了对抗上述蛋白的特异性抗体(van Noorden，1986，Immunocytochemistry，Modern Methods and Applications，2ndedition，Wright，Bristol，26-53)。
此外，在某些癌症类型中，病毒的出现明显与癌症的恶化有关。病毒DNA可以通过杂交方法检测，而且也可以充当诊断标记物，譬如当检测子宫颈涂片中的人乳头状瘤病毒(检测试剂盒可以得自多个供应商，例如Digene、DAKO、BioGenex和ENZO)时。
在许多场合下已经显露出，单一标记物不足以特异性地识别病变细胞，因为它也部分存在于健康细胞中。这是基于标记物也是参与健康细胞生理调节过程的蛋白质的事实。因此，例如，虽然例如事实上可以在所有宫颈肿瘤中检测到HPV，但在许多正常宫颈上皮中也可以检测到HPV；也就是，虽然检测HPV的试验非常敏感，但它只具有低的特异性(例如Cuzick，2000，JAMA.283，108-109)。Williams等(1998，PNAS，95，14932-14937)描述了DNA复制标记物mcm-5，其检测出子宫颈的28种试验损伤/肿瘤(n＝58)，但在这28种正常涂片中也提供2种错误的阳性染色。Sano等(Pathology Intl.，1998，48，580-585)报导了标记物p16在15种正常宫颈活组织中的3种非特异染色。
在细胞学/病理学中，人们对检测生物样本中多种标记物日益感兴趣。一方面，这能够获得更多可利用的信息；另一方面，用各种标记物获得的非特异染色可以更加容易地识别出它们是什么。传统上，出于这种目的制备了可用活组织的连续切片或机体样本的重复标本(例如宫颈涂片在固定剂中)，随后其分别用特定标记物染色。这种方法存在若干缺点：事实上它消耗大量的患者样本材料和染色试剂，而样本材料通常是有限的，染色试剂需要大量的时间并且昂贵，事实上也不可能在细胞中同时清晰地探测出两种或多种标记物。虽然文献中业已报导了在生物样本中两种或多种不同生物标记物的同时检测(DAKO，免疫酶双染色法实际指南；Gomez等，Eur J.Histochem.，1997.41，255-259)，但该途径至今无法应用到常规诊断中。Terhavauta等人(Cytopathology，1994，5.282-293)采用p53和Ki67在取自子宫颈损伤的活组织上的双重染色，并且在一个细胞的某些情况中可以由HPV阳性和HPV阴性损伤衍生的基细胞和副基细胞中检测出这两种标记物。上述双重染色是在子宫颈活组织上进行，但无法转移到宫颈涂片上。以同样的方式，含有很少基和副基细胞的涂片的细胞组成不同于活组织的细胞组成。根据我们的发现，当对子宫颈涂片应用上述标记物联合物时，无法获得任何诊断上可利用的结果。此外，作者没有利用有上述双重染色所获得的信息，通过结合所得的结果来达到更加准确的有关这个样本中肿瘤细胞存在的结论。
Rao等(1998，Cancer Epidemiology，Biomarkers andEvolution.7，1027-1033)描述了不同肿瘤相关性标记物(DNA含量、G肌动蛋白和p53)在得自乳腺组织的针穿刺材料(FNA，细针针吸活检)中的多重染色。他们解释了其使用多种标记物得到比由单独标记物的观察更加高的临床特异性的结果，并由此在乳腺癌的早期识别中发挥重要作用。作者所引用的多重染色仅限于由乳腺组织获得的针穿刺材料。他们不曾尝试从肿瘤区域的检测自动化的立场上利用这些染色信息。此外，所述的染色法无法适用于其他生物材料(即活组织和子宫颈涂片)，因为物质的性质不同。
自动化：
现有临床肿瘤诊断的进一步改进在于两个方面，一方面是样本制备和染色的自动化，另一方面是自动图形分析，自动图形分析中包括诊断的确立。除了节省时间和人力以外，这样也可以更加客观，并由此使诊断更加统一。使用荧光或生色染料在肿瘤细胞或其前体中的生物标记物的染色能够做到定量，并且由此自动读取信号。尽管没有通过图象分析的方式自动诊断，但能够自动实施染色方案的体系业已存在(LeNeel等，1998.Clin Chim Acta，278，185-192)。最先进的体系是利用形态学图象信息自动化检测子宫颈涂片中的肿瘤细胞及其前体(Saways等，1999，Clinical Obstetrics and Gynaecology，42，922-928：Stoler，2000 Mod.Pathol，13，275-284)。
除了利用PAPNET体系自动化形态检测子宫颈涂片中的异常细胞以外，Boon等(1995，Diagn.Cytopathol，13，423-428)也用Ki67抗体对增殖细胞进行免疫组织化学染色。然而，这种单一分子标记物的使用无法明确地区分良性增殖细胞和癌细胞。
Boon等的专利(US-5544650)报告了用免疫化学标记物的染色有利于样本中增殖(癌性和非癌性)细胞的自动化检测，并且在半自动过程中，监控病理学家/细胞学家随后可以判断被染色细胞实际上是否为癌细胞。
专利US-6005256(其作者为McGlynn和Akkapeddi)详细描述了同时检测机体样本中多种荧光标记的标记物的装置和方法，以及用于鉴定癌细胞的装置和方法，但并没有实施到癌症诊断的具体应用中或指出适当的标记物联合物可以产生较高的特异性。
已知Ampersand Medical SystemsGroup(www.ampersandmedical.com)正在开发一种新的用于宫颈涂片的筛选体系(InPath)，除了公司内部样品标本以外，其也包括非特异生物标记物的荧光检测。
发明内容
发明目的
本发明包含可以用于早期诊断在制备的子宫颈涂片中的癌细胞或其前体并比以往方法更加可靠的方法。
根据本发明，这可以通过本专利权利要求书中所包含的主题方式来获得。
概述/目的实现
本发明基于申请人发现至少两种分子标记物(也就是基因表达或病毒核酸中与疾病有关的变化)的同时检测可以提高对子宫颈涂片中病变细胞(如癌细胞及其前体)检测的特异性，并且由于联合标记物染色的信息价值使检测更加特异性，而且除此之外也可以自动化。
发明详述：
本发明涉及分子标记物，其在各自检测时无法获得有关识别病变细胞或组织的足够特异性，因为它们也以相似或不同的量部分地存在于未病变的生物材料中。这是基于这些标记物可以是参与健康细胞中生理调节过程的蛋白质的事实。此外，由于抗体的非特异性交叉反应，分子标记物的检测可能不清晰，这表现在未含有分子标记物的生物材料的颗粒被染色。本发明人已经观察到，通过同时检测细胞内的至少两种标记物可以弥补与单一标记物的检测有关的特异性不足，从而在检测异常细胞或组织切片时确保较高的特异性。所以，通过联合多种细胞内的标记物而不是使用单一标记物可以在生物材料的诊断中获得更大的信息价值。
标记物联合物包括属于至少一种下列基因类型的基因的表达的显色：致癌基因、肿瘤抑制基因、细胞凋亡基因、增殖基因、修复基因和病毒基因；或至少一种源自上述基因类型的基因的变更表达的显色，与病毒核酸类化合物的显色联合。优选的联合物含有下列分子标记物：her2/neu、p16、p53、MN、mdm-2、bcl-2和EGF受体以及源自HPV亚型6、11、16、18、30、31、33、35、45、51和52的DNA。特别优选下列联合物：her2/neu与p16或EGF-R与p16或p53与her2/neu或her2/neu与mdm-2或bcl-2与p16或bcl-2与her2/neu或p16与p53。
根据本发明，申请人的发现应用在疾病相关性细胞或组织切片的早期诊断的方法中，其包含检测上述分子标记物的联合物，目标在于利用自动化来检测癌及其前体。通过下列方法可以确保肿瘤细胞的自动和特异性检测：首先，细胞中必须存在至少两种信号，其次，两种标记物各自的信号必须在各种情况中大于独自定义的强度或独自定义的阈值。利用这两个标准，可以把那些例如表达一种标记物高于设定阈的细胞，或对两种标记物表现出染色但其分别低于规定信号强度的细胞，视作健康细胞。
术语“分子标记物”包含细胞中的分子变化，特别是基因表达的变化，已经观察到其与改变或病理性的细胞构造有关。检测分子标记物的方法包含任何可以在核酸水平或蛋白质水平上测定标记物的量或存在的方法。对于蛋白质水平上的检测，可以利用抗体或其他特异性结合蛋白(例如抗cullin)，它们允许使用生色和/或荧光检测的后续细胞化学或组织化学鉴定。对于核酸水平上的检测，可以利用杂交技术，其有时是在附加的扩增步骤之后(例如在结合靶向序列之后标记探针的免疫细胞化学扩增)，同样可以利用细胞化学或组织化学染色反应鉴定。
术语“至少两种分子标记物的同时检测”包括使机体样本中至少两种基因的表达显色的方法，特别是机体样本的单一标本中，优选在单一细胞中，由此可以观察到彼此有关的基因表达。
术语“联合标记物染色的信息价值”包括至少两个量的信息的联合，其是在检测机体样本中的至少两种标记物的基础上获得的，优选在单一细胞中。此外，通过定义标记物强度的阈值可以明确地从疾病细胞中区分出健康细胞。
术语“病变子宫颈涂片细胞”包括由妇女的子宫阴道衍化的且通过常规妇科取样方法涂敷在显微镜载玻片或在流通式荧光计(FACS)中检测的癌及其前体。
术语“自动化检测”包括其中全部或只在组成步骤中代替人工的手工操作的方法，以及特别适用于检测过程的步骤中或相关后继文件或信息处理中的方法。这包括样本制备、样本染色、样本读取和信息处理的步骤。通过吸收测量、反射测量或荧光测量的方式可以实现检测。
术语“诊断专家系统”包括将图象信息转化为建议性诊断的计算机软件。这种专家系统能够将全部或部分的可利用信息合并为基于参数的建议性诊断，其存储于软件或软件可以存取的外部信息中。如果需要其它参数来确立建议性诊断，软件可以提出这些参数的集合或通过链接到适当分析设备上、在反射性算法的检测中自动访问。
术语“扩增系统”包括生物化学方法，其能够增强信号强度从而产生更适合特异性检测一种分子标记物的信号/噪音比。这通常是利用附加抗体和/或酶检测反应来获得。
可以利用本发明特异性地检测子宫颈中的病变细胞，例如癌及其前体。本发明还涉及实施本发明方法的试剂盒，并且这种试剂盒含有下列组成：
(a)检测至少两种分子标记物的试剂，也就是标记和/或未标记的抗her2/neu、p16、p53、MN、mdm-2、bcl-2、EGF受体和HPV L1的抗体，和其他含有HPV病毒基因组的区域的标记DNA探针。
(b)常规辅助物质，例如缓冲剂、载体、信号扩增物质、染色剂等。
(c)样本制备和染色以及信号检测的自动化方法。
(d)用于作为对照反应的染色细胞系的方案和试剂。
上述评述适于所述试剂盒的各个组分。所述试剂盒的单一组分或多种组分还可以以改变了的形式使用。
可以利用本发明或手动或采用部分或全部自动化的方法来检测子宫颈涂片中的癌及其前体。由于按照本发明、从同时检测的至少两种分子标记物获得的结果不经过任何主观评估，而相反却促进了生物材料中病理性变化的客观性自动化检测，所以形态学发现如PAP试验中所产生的发现可以用客观参数补充，例如以反射性试验的形式。因为所述的方法可以快速实施，同时这种实施可以自动化，所以其适合大规模的筛选方法，其在成本和人力上均很经济。
因此，本发明代表了与涂片诊断中子宫颈癌症的早期识别有关的肿瘤细胞及其前体的特异性检测的重要贡献。
具体实施方式
实施例
下文将通过举例的方式提供实施本发明的方案。虽然在这些实施例中指出了对于各种抗体或DNA探针的精确反应条件，但许多参数如培育温度和洗涤温度、培育时间和洗涤时间、以及抗体和其他试剂的浓度可以根据各自的抗体或DNA探针而变化。同样地，此处所述的扩增系统可以被忽略或加入。
使用特异性抗体同时检测宫颈涂片中两种分子标记物的试验的描述
应用制备技术如Thin-Prep(得自Cytyc)将保存在Preservcyt(得自Cytyc)中的细胞涂布于显微镜载玻片(MS)。用冷的乙醇将细胞固定3分钟，随后该显微镜载玻片在PBS(137mM NaCl、3mM KCl、4mM Na2HPO4、2mM KH2PO4)中洗涤。室温(RT)下用存在于PBS缓冲液中的5％胎牛血清封阻非特异结合位点30分钟之后，令MS与两种特异性单克隆抗体(得自Oncogene Science/BAYER的her2/neu(克隆3B5，20μg/ml)和p16(克隆DCS 50.1，10μg/ml))在加湿箱中同时培育60分钟。一种抗体与荧光素偶联而另一种抗体与生物素偶联。经过各个下列培育步骤之后，MS在各种情况中用PBS洗涤5分钟共3次。依次使用两种不同的染色体系以检测各自的抗原-抗体结合。对于第一种染色体系，MS用抗生蛋白链菌素-Cy3(MobiTec，5μg/ml，存在于含5％牛血清的PBS中)培育30分钟，并且随后与抗生蛋白链菌素-生物素(载体；2μg/ml，存在于含5％牛血清的PBS中)进一步培育30分钟以便扩增信号。最后，MS再次用抗生蛋白链菌素-Cy3培育。第二种染色体系由Alexa Fluor 488信号扩增试剂盒TM(Molecular Probes，定购号A-11053)组成。最后，MS用MowiolTM(Hoechst)覆盖。
使用特异性抗体同时检测宫颈涂片中三种分子标记物的试验的描述
采用制备技术如Thin-Prep(得自Cytyc)或Cyto-Spin(得自Shandon)将保存在例如Preservcyt(得自Cytyc)中的细胞涂布于显微镜载玻片(MS)。用冷的乙醇将细胞固定3分钟，随后该显微镜载玻片在PBS(137mM NaCl、3mM KCl、4mM Na2HPO4、2mM KH2PO4 pH7.4)中洗涤。室温(RT)下用在PBS缓冲液中含4mmol/L左旋咪唑(得自Sigma)的5％胎牛血清封阻非特异结合位点30分钟之后，令MS与三种特异性单克隆抗体(得自Oncogene Science/BAYER的her2/neu(克隆3B5，20μg/ml)、bcl-2(克隆100，2μg/ml)和p16(克隆DCS 50.1，10μg/ml))在加湿箱中在室温同时培育60分钟。第一种抗体与荧光素偶联，同时第二种抗体与异羟洋地黄毒甙元偶联且第三种抗体与生物素偶联。经过各个下列培育步骤之后，MS在各种情况中用PBS洗涤5分钟共3次。依次使用三种不同的染色体系检测各自的抗原-抗体结合。对于第一种染色体系，MS与抗生蛋白链霉素-Cy3(Mobi Tec，5μg/ml，存在于含4mmol左旋咪唑/L和5％牛血清的PBS中)培育30分钟，随后与生物素化抗-抗生蛋白链霉素抗体(载体；2μg/ml，存在于含4mmol左旋咪唑/L和5％牛血清的PBS中)进一步培育30分钟以扩增信号。最后，MS再次用抗生蛋白链霉素-Cy3培育。第二种染色体系由Alexa Fluor 488信号扩增试剂盒TM(Molecular Probes，定购号A-11053)组成。对于第三种染色体系，MS用由羊抗异羟洋地黄毒甙元抗体和碱性磷酸酶组成的偶联物(DAKO，在含4mmol左旋咪唑/L和5％牛血清的PBS中1∶150稀释)培养30分钟。用得自Molecular Probes的ELF97 Cytological标记试剂盒(定购号E 6602)按照生产商的说明书进行荧光读取。最后，MS用MowiolTM(Hoechst)覆盖。
使用特异性抗体和HPV DNA探针同时检测宫颈涂片中两种分子标记物的试验的描述
当将免疫细胞化学抗体染色与就地DNA杂交联合时，按照上述抗体染色方案进行样本的制备和固定，封阻并用初级抗体培育。初级抗体是对抗蛋白p16(克隆DCS 50.1)的荧光素偶联抗体(由OncogeneScience/BAYER提供)且所用浓度为10μg/ml。为了检测抗原-抗体结合，MS首先在室温(RT)下用浓度为15μg/ml的次级抗体，即兔抗FITC(MoBiTec)培养30分钟，随后用在PBS中1∶100稀释的碱性磷酸酶偶联的山羊抗兔抗体(Dianova提供)培养。对于染色体系，室温下MS与显色碱性磷酸酶底物品红(DAKO提供)按照制造商的说明培养5分钟。为了固定染了固定染色，MS随后用存在于PBS中的5％多聚甲醛固定5分钟。此后就地染色。为此，MS首先用2×SSC(0.3M NaCl，30mM Na柠檬酸盐)洗涤2次，随后在37℃下用40μg的核糖核酸酶/ml 2×SSC消化60分钟。用PBS进行2分钟的洗涤步骤之后，在37℃下用2μg蛋白酶K/ml消化10分钟。用蒸馏水洗涤3×2分钟之后，向MS中加入20μl存在于杂交缓冲液(Kreatech)中的即用异羟洋地黄毒甙元标记的HPV16 DNA探针(Kreatech)，其随后用盖片覆盖，密封，在94℃下加热8分钟变性，进而在37℃下培养过夜。除去杂交溶液之后，MS再次用存在于Boehringer封闭缓冲液(0.05g的封阻剂(Boehringer 1201107)存在于5ml封阻缓冲液(150mM NaCl，100mM tris-HCl，pH7.5))中的3％兔血清封阻30分钟。对于显色的读取，MS在各种情况中于RT下连续用DAKO过氧化物酶偶联的兔抗异羟洋地黄毒甙元抗体(用封阻缓冲液1∶150稀释)、存在于PBS/0.1M咪唑，pH7.6/0.001％H2O2中的Dig-Tyramide(5.71μg/ml)(按照Hopman等1998，J Histochem Cytochem，46(6)，771-777所述制备)培养15分钟，并且再次用过氧化物酶偶联的兔抗异羟洋地黄毒甙元抗体(DAKO，在含3％兔血清的TBST(50mM tris/HCl，0.3NaCl，1％Tween 20，pH7.6)中1∶150稀释)培养。期间，MS在各种情况中用PBST洗涤3×5分钟。对于显色偶联反应，MS用DAB底物(得自DAKO)按照制造商的说明染色10分钟。最后，MS在MowiolTM中覆盖。
已经通过至少两种分子标记物的同时检测染色的异常细胞的自动化检测试验的描述
宫颈涂片用荧光显微镜解译，该宫颈涂片中至少两种分子标记物业已用抗体通过上述方法检测，所述的荧光显微镜带有一个可驱动的交叉载物台，载物台至多可载8个显微镜载玻片(Olympus AX70，带有Multicontrol-Box 2000-3和analySIS“Modul StageTM”驱动软件)，和Soft Imaging Systems GmbH(SIS)提供的analySIS3.0软件的改进版，其作为“Grabbit Dual Pro”SIS软件包含有附加模块，特别是FFT(＝“快速付里叶变换”)模块、MIA(＝“多重图象校准(Multiple Image Alignment)”)模块和C模块。用高分辨黑白(MV2Slow Scan Camera，12位，得自SIS)和彩色(DXC-950P 3CCD芯片，得自Sony)照相机记录图象。联用后，这些体系适于16位Grauton图象分析并且适于RGB中彩色图象分析和HSI彩色空间，最高可达24位图象深度。
校准可驱动交叉载物台(analySIS“Module Stage”)后，通过规定“自动”菜单(analySIS“Module Grains”)中8个连续载物台路径(stage path)可以相对于“逻辑零点”记录最多8个显微镜载玻片的全部位置。生物样本的总区域以综合方式分解为独立区域，自动化Thin-Prep(Cytyc)方法确保该总区域始终位于显微镜载玻片的规定区域内，所述的独立区域大小为571.2μm×457.96μm，同时对应于用显微镜部件放大的放大率为20倍的相片的图象扇形区。每个生物样本用一个路径分析。各个载物台路径由750个独立载物台路径位置(30线，25列)组成，显微镜水平方向上以曲折方式描绘出一系列的载物台路径位置，由此规定显微镜玻片位置上的生物样本的各个区域是以邻接方式而不是重叠方式、通过载物台路径位置的方式进行检测。所以，相同的载物台路径在各种情况中被定义为工作台中的各个标本。在“自动”菜单中输入8个载物台路径，使其能够以自动化方式分析位于工作台上的所有标本。
通常，在用3种不同的荧光波长激发后，各载物台路径位置在各种情况中用高分辨B/W照相机和适当的荧光滤色器成像1x。随后测量各个相片的荧光强度。这由“自动”菜单中的“测量”记录卡来完成。通过将分开的蓝色、红色和绿色图象重叠可以产生与相同载物台路径位置上各个图象的荧光强度相关的混合色。随后经过“相分析”后，测定出指定混合色的区域并定量再现为面积。因此，指定混合色是病变细胞的特征，其意味着可以进行诊断预测。
具体地说，对于使用多种分子标记物的荧光测量，每种载物台路径位置可以从各个荧光滤光通道得到黑白相片。随后将色彩指派给属于一个载物台路径位置的独立图象，并且所得的不准确彩色图象用“FIP模块”重叠，由此根据荧光强度，通过“添加”不同的荧光色，得到混合色。譬如，当红色和绿色通道中同时存在等强度的荧光显色时可以在相应图象位置得到黄色二级色彩。依赖于荧光强度的浓度，二级色彩还可以趋向于红色或绿色。类似地，当叠加等强度的蓝色、绿色和红色荧光时可以形成白色二级色彩。这些重叠图象通过设定阈值来测定且随后进行“相分析”，这是直接通过设定色彩阈以RGB模式(图象菜单)进行的。所有这些步骤可以手动完成，但它们也可以以自动方式、通过在“附加设备”菜单中“绘图宏”下创建宏来完成，并且此后在“自动”菜单中检索它们。最后，特定混合色的定量评估以面积值的形式(＝生物样本上的面积，其具有因用至少两种特定强度的分子标记物染色的精确规定的二级色彩)获得。被分析的图象和各个载物台路径位置的面积值都可以用“协议列表实用程序(protocol)”记录卡自动保存在“自动”菜单中。因此，各个载物台路径位置可以获得这个区域中有关的荧光强度或被测混合色的定量评估。各个载物台路径位置的混合色的数值(＝三个独立相片的重叠)在各种情况中相对于各个载物台路径(＝各个标本)显示在有关Excel数据文件中。Excel表格因此由750行和8列组成，其中的行相应于各载物台路径的750个独立载物台路径位置，其中的列相应于8种不同的混合色。由于具体的混合色(例如当显示出红色和绿色的两种标记物时为黄色混合色)可以归属于多种同时高水平表达的疾病相关性标记物，这些载物台路径位置被标记(＝“标志”)为“病理性”，随后出于对照的目的，相应的荧光相片可以作为独立图象进行目测检测。Excel表格中所示的8种混合色的面积用Excel中的宏确认，即合计列中的全部值(＝一种具体的混合色)。因此，对于指定生物标本(＝载物台路径)来说可以得到8种二级色彩中各个色彩的一个数值。如果其为病变细胞特征的具体混合色之和(例如上述提及的黄色混合色)超出临界最低值，通过相应载物台路径分析的生物样本或所指定的子宫颈涂片被划分为病理性的。因此，通过定量分析经确认的各个荧光强度，可以自动获取有关生物样本的诊断预测。
使用特异性抗体在流通式血细胞计数器中同时检测两种分子标记物的试验的描述
保存在Preservcyt(Cytyc)中的涂片细胞首先加压通过100μm孔径的尼龙布以使细胞凝块破碎为单个细胞。通过离心沉降细胞之后，它们用1×PBS洗涤且随后利用下列方法中的一种方法透化：a)OPF方法(ORTHOPermeaFixTM)，b)F&P(FIX & PERM Cell Permeablization试剂盒，Imtec)和c)MWH(微波加热)。所有这些方法均按照制造商的说明或按照Millard等所述方法(Clin Chem.1998，44，2320-2330)进行。透化的细胞与两种小鼠抗体(得自Oncogene Science/BAYER的her2/neu(克隆3B5，20μg/ml)和p16(克隆DCS 50.1，10μg/ml))一起培养60分钟。第一种抗体与荧光素偶联，同时第二种抗体与生物素偶联。经过每个后继培养步骤之后，使细胞沉降并用PBS总共洗涤2次。连续使用两种不同染色体系来检测各自的抗原-抗体结合。在第一种染色体系的情况中，细胞用抗生蛋白链菌素-Cy3(Mobi Tec，5μg/ml)培育30分钟。第二种染色体系由Alexa Fluor 488信号-扩增试剂盒TM(Molecular Probes，定购号A-11053)组成。此后将细胞置于ISOTON II(Coulter)中且在流通式血细胞计数器(FACScan，Becton Dickinson)内测量，其安装了绿色和红色荧光的激光激发。荧光强度可以被绘制为图形。在规定信号强度的阈值之后，可以检测出阴性细胞的相对和绝对数目，以及单项阳性或双项阳性细胞的相对和绝对数目。诊断专家系统将这些信息转化为建议性诊断。

Claims (11)

1 检测子宫颈涂片中的肿瘤细胞及其前体的方法，该方法通过同时检测细胞中至少两种分子标记物来进行。
2.按照权利要求1的方法，其特征在于，所述的标记物选自下列组的至少一种：肿瘤抑制基因、细胞凋亡基因、增殖基因、修复基因和病毒基因。
3.按照权利要求1和2的方法，其特征在于下列标记物的至少一种是以联合形式存在的：her2/neu、p16、p53、MN、mdm-2、bcl-2、EGF受体，和来自HPV亚型6、11、16、18、30、31、33、35、45、51和52的特异性DNA。
4.按照权利要求1-3之一的方法，其特征在于，存在所述的标记物联合her2/neu与p16或EGF-R与p16或p53与her2/neu或her2/neu与mdm-2或bcl-2与p16或bcl-2与her2/neu或p16与p53。
5.按照权利要求1-4之一的方法，其特征在于检测3种标记物。
6.实施权利要求1-5之一的方法的试剂盒。
7.按照权利要求6的试剂盒，其特征在于，所述的试剂是抗体或核酸。
8.按照权利要求6和7的试剂盒，其特征在于，直接或间接用荧光或显色染料物质读取所述的抗体或核酸探针。
9.按照权利要求1-8之一的方法，其特征在于，它能够以自动方式检测异常细胞，其特征在于检测至少两种标记物、合并信号强度并且合计。
10.按照权利要求9的方法，其特征在于，所述的自动信息处理与诊断专家系统联合，该系统能够使图形信息合并为建议性诊断，并且如果适宜允许进行反射性试验。
11.按照权利要求1-10的全部方法，其特征在于，所述的方法由全自动样本制备、样本染色、样本读取和信息处理或包含至少两个指定子处理的子处理组成。
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