CN103323448B

CN103323448B - 一种辣根过氧化物酶黑色显色剂及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN103323448B
Application number: CN201310036049.8A
Authority: CN
Inventors: 李湘麒; 谭毅; 张弛; 梁广
Original assignee: Wenzhou Medical University
Current assignee: Wenzhou Medical University
Priority date: 2013-01-20
Filing date: 2013-01-20
Publication date: 2018-01-16
Anticipated expiration: 2033-01-20
Also published as: CN103323448A

Abstract

本发明涉及一种辣根过氧化物酶黑色显色剂及其制备方法与应用，属于生物技术领域。制备辣根过氧化物酶黑色显色剂的原料包括4‑CN、DAB、硫酸镍铵、氯化钴、咪唑、聚乙二醇辛基苯基醚、硼酸、MgCl₂、MnCl₂、亚硝基铁氰化钠、甜菜碱、明胶、四氢呋喃、丙酮、硫酸葡聚糖、1×TBS、H₂O₂。将一定量的所述原料混匀即得到辣根过氧化物酶黑色显色剂，该辣根过氧化物酶黑色显色剂的用于辣根过氧化物酶显色，兼具了DAB的高灵敏和4‑CN色差视觉效果好的优点，显色产物为黑色沉淀，与背景对比强烈，方便结果判断。

Description

一种辣根过氧化物酶黑色显色剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种辣根过氧化物酶黑色显色剂及其制备方法与其在核酸/蛋白检测领域的应用。

背景技术

过氧化物酶标记和碱性磷酸酶(AP)标记显色技术是核酸和蛋白检测的两大基本技术。其中过氧化物酶标记是最为常用的标记，过氧化物酶一般是用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)，之所以叫这个名字是因为HRP是从一种称为辣根的植物根部分离纯化获得。HRP有以下几个方面的优点：(1)分子小(分子质量40kDa)，空间障碍小，穿透力强，易与细胞内抗原结合；(2)性质稳定且易获得高纯度酶制品；(3)活性高、特异性强；(4)酶反应产物易沉积，不扩散；(5)组织内源性酶活少，且抑制方法较多；(6)价格便宜；(7)特异性底物是过氧化氢(H₂O₂)，可选用不同电子供体(发色基团)，使终产物呈不同颜色。正因为如此，HRP标记显色成为了目前分子生物学化学显色中最为常用的一个技术。

HRP分子显色的原理是因为它含有活性基团高铁血红素(含铁血红素基团，在溶液中呈棕黄色)，HRP中的高铁血红素与H₂O₂形成一种复合物，然后脱水，氧原子形成。目前HRP的显色途径主要分为两类，一类是化学发光，X光片检测；另一类是化学显色，目标可视。化学发光是以鲁米诺为主要供氢体的ECL类显色剂，而化学显色目前常用的主要有四种基本底物：DAB，CN，AEC，TMB。DAB(3,3’-二氨基联苯胺)为棕褐色，AEC(3-氨基-9-乙基卡巴唑)为红色，4-CN(4-氯-1-萘酚)为蓝紫色，TMB(3′,3′,5′,5′,-四甲基联苯胺)为蓝色。AEC室温下较稳定，产物不溶于水，但溶于有机溶剂，所以不能进行脱水等处理；又因其需用水溶性封固剂，时间长易褪色，限制了其应用。DAB因为灵敏度高，产物既不溶于水，又不溶于有机溶液，可长期保存，其终产物具有嗜锇性，经锇酸处理后电子密度增加，适用于电镜下观察，成为了最广泛应用的电子供体。但DAB显色背景高。CN产物也不溶于水，背景低但灵敏度也较低。TMB产物溶于水，主要用在溶液状态上检测，如ELISA。为了兼顾灵敏度与最终显色效果，目前国外某著名公司开发有DAB和CN的混合显色剂(DAB/CN)，声称显色为黑色沉淀，显色极为灵敏，对比强烈，方便观察，但实际在膜上的应用发现，价格昂贵，且颜色虽然比传统的棕褐色偏黑，但仍然是强褐色。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种辣根过氧化物酶黑色显色剂的制备方法。

本发明的另一目的在于提供一种通过上述制备方法制备得到的辣根过氧化物酶黑色显色剂。

本发明的再一目的在于提供上述辣根过氧化物酶黑色显色剂的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种辣根过氧化物酶黑色显色剂的制备方法，包括如下步骤：

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种辣根过氧化物酶黑色显色剂，包括如下按质量百分比计的组分：

余量为1×TBS缓冲液(按《分子克隆》标准配制)，

优选的，一种辣根过氧化物酶黑色显色剂，包括如下按质量百分比计的组分：

余量为1×TBS缓冲液(按《分子克隆》标准配制)，

一种辣根过氧化物酶黑色显色剂通过上述制备方法制备得到。

所述的辣根过氧化物酶黑色显色剂的最终显色产物为黑色沉淀。

上述辣根过氧化物酶黑色显色剂在核酸/蛋白检测中的应用，所述的辣根过氧化物酶黑色显色剂用于辣根过氧化物酶显色。

本发明主要是辣根过氧化物酶催化DAB产生的褐色产物和4-CN的蓝紫色产物在所配制显色剂中各个成分复杂的物理化学反应下快速形成黑色的最终混合产物。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供的辣根过氧化物酶黑色显色剂兼具了DAB的高灵敏和4-CN色差视觉效果好的优点。

(2)本发明提供的辣根过氧化物酶黑色显色剂显色产物为黑色，与背景对比强烈，特别是用于免疫组织化学技术时，方便结果判断。

附图说明

图1是HRP标记核酸检测膜显色结果图。

图2是HRP标记蛋白检测膜显色结果图。

图3是内源RNA分子的检测膜显色结果图。

图4是内源蛋白分子的检测膜显色结果图。

图5是免疫组织化学显色效果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1黑色显色剂的制备

(1)以水为溶剂分别配制：25mg/mL 4-氯-1-萘酚(4-CN)(注：无水乙醇溶)，50mg/mL 3,3’-二氨基联苯胺(DAB)，50mg/mL硫酸镍铵(注：0.1M醋酸铵溶)，0.5g/mL氯化钴，0.5g/mL咪唑，1M硼酸，20mg/mL MgCl₂，20mg/mL MnCl₂，25mg/mL亚硝基铁氰化钠，12mg/mL甜菜碱，2mg/mL明胶，0.2g/mL硫酸葡聚糖，1％(V/V)四氢呋喃，1％(V/V)丙酮。

(2)取25mg/mL 4-CN 2.5μL，50mg/mL DAB 2.5μL，50mg/mL硫酸镍铵5μL，0.5g/mL氯化钴0.5μL，0.5g/mL咪唑0.5μL，1M硼酸1μL，20mg/mL MgCl₂ 1μL，20mg/mL MnCl₂ 1μL，25mg/mL亚硝基铁氰化钠1μL，12mg/mL甜菜碱1μL，2mg/mL明胶1μL，0.2g/mL硫酸葡聚糖1μL，1％(V/V)四氢呋喃1μL，1％(V/V)丙酮1μL，聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)1μL，30wt％H₂O₂ 1μL，1×TBS(按《分子克隆》配制)979μL混匀得到辣根过氧化物酶黑色显色剂。

实施例2合成核酸分子的膜检测

(1)由GenePharma(吉玛)公司合成RNA分子miR-29b；由上海博尚生物技术有限公司合成biotin标记的DNA探针(miR-29b的反义序列)。

(2)分别取上述合成的RNA与DNA探针10pmol按LHCD(液相杂交显色法)(X.Li,M.Ni,and Y.Zhang,Methods 85(2),151(2012))步骤进行操作，其中点样重复三张膜。

(3)分别使用不同显色液(DAB、DAB/CN和实施例1制备的黑色显色剂)进行显色20s，再用水终止显色。

结果如图1所示，A：DAB，B：DAB/CN(购自Thermo scientific)，C：实施例1制备的黑色显色剂；1：未加探针，2：未加RNA，3：加无关的RNA(吉玛公司合成通用对照)，4：加miR-29b。结果表明本发明所制黑色显色剂在膜上应用时，与DAB和DAB/CN显色液在核酸分子检测中效果相当。

实施例3合成蛋白分子的膜检测

(1)由吉尔生化有限公司合成FLAG TAG肽段。

(2)取步骤(1)的蛋白50ng点于尼龙膜上，重复点样三张，风干。

(3)用质量体积比10％BSA(牛血清白蛋白)室温下将膜封闭1小时。

(4)用biotin标记兔抗FLAG TAG抗体(购买于上海博耀生物试剂有限公司)室温杂交1小时。

(5)TBST(按《分子克隆》配制)洗3次，每次10分钟。

(6)用ABC(亲合素生物素复合物)信号放大及其后的洗膜均按LHCD(液相杂交显色法)(X.Li,M.Ni,and Y.Zhang,Methods 85(2),151(2012))进行。

(7)分别使用不同显色液(DAB、DAB/CN和实施例1制备的黑色显色剂)进行显色20s，再用水终止显色。

结果如图2所示，A：DAB，B：DAB/CN(Thermo scientific)，C：实施例1制备的黑色显色剂；1：未加FLAG TAG蛋白，2：加无关的蛋白(按文献Acta Biochim Biophys Sin(2008):855-863表达的肽段MacGAP-N)，3：未加兔抗FLAGTAG抗体，4：FLAG TAG蛋白和兔抗FLAG TAG抗体均加。结果表明本发明所制黑色显色剂在膜上应用时，与DAB和DAB/CN显色液在蛋白分子检测中效果相当。

实施例4内源RNA分子的膜检测

(1)用CO₂气体法人道处死大鼠，用Trizol试剂提取大鼠肝脏RNA(提取方法按照INVITROGEN公司Trizol试剂盒说明书操作)。

(2)所提取的RNA用biotin标记的DNA探针(miR-122的反义序列)按LHCD(液相杂交显色法)(X.Li,M.Ni,and Y.Zhang,Methods 85(2),151(2012))步骤进行液相杂交。

(3)使用实施例1制备的黑色显色剂显色20秒，再用水终止显色。

结果如图3所示，1：未加探针，2：未加RNA，4：加与miR-122相同的DNA分子，4：大鼠肝脏RNA。所示结果表明，本发明所制黑色显色剂能用于blotting实验检测内源性RNA分子。

实施例5内源蛋白分子的膜检测

(1)用CO₂气体法人道处死大鼠，用SIGMA公司蛋白提取试剂RIPA提取脑总蛋白。

(2)取步骤(1)的蛋白5μg点于尼龙膜上，风干。

(4)用质量体积比10％BSA(牛血清白蛋白)室温下将膜封闭1小时。

(5)用兔抗大鼠GS(谷氨酰胺合成酶)一抗(购买于SIGMA公司)室温杂交1小时。

(6)TBST(按《分子克隆》配制)洗3次，每次10分钟。

(7)用羊抗兔二抗(HRP标记)(购买于ABCAM公司)室温杂交1小时。

(8)TBST洗3次，每次10分钟。

(9)用实施例1制备的黑色显色剂显色20秒。

结果如图4所示，1：未加一抗，2：未加二抗，3：一抗二抗都加，4：一抗二抗都加(重复3)。所示结果表明，本发明所制黑色显色剂能用于blotting实验检测内源性蛋白分子。

实施例6免疫组织化学检测

(1)用CO₂气体法人道处死大鼠，取睾丸组织，按文献操作(Acta Biochim BiophysSin 2012,44:876–885)进行免疫组织化学实验，其中用兔抗大鼠GS(谷氨酰胺合成酶)一抗(购买于SIGMA公司)室温杂交1小时。

(2)免疫组织化学实验操作完成后，用实施例1制备的黑色显色剂显色5秒。

结果如图5所示，1：未加GS一抗对照，2：GS一抗。所示结果表明，本发明所制黑色显色剂能用于免疫组织化学实验中检测内源性蛋白分子，且黑白对比明显，视觉效果好。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种辣根过氧化物酶黑色显色剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)以水为溶剂分别配制：无水乙醇溶解的25mg/mL 4-氯-1-萘酚(4-CN)，50mg/mL 3,3’-二氨基联苯胺(DAB)，0.1M醋酸铵溶解的50mg/mL硫酸镍铵，0.5g/mL氯化钴，0.5g/mL咪唑，1M硼酸，20mg/mL MgCl₂，20mg/mL MnCl₂，25mg/mL亚硝基铁氰化钠，12mg/mL甜菜碱，2mg/mL明胶，0.2g/mL硫酸葡聚糖，1％(V/V)四氢呋喃，1％(V/V)丙酮；

(2)取25mg/mL 4-CN 2.5μL，50mg/mL DAB 2.5μL，50mg/mL硫酸镍铵5μL，0.5g/mL氯化钴0.5μL，0.5g/mL咪唑0.5μL，1M硼酸1μL，20mg/mL MgCl₂ 1μL，20mg/mL MnCl₂ 1μL，25mg/mL亚硝基铁氰化钠1μL，12mg/mL甜菜碱1μL，2mg/mL明胶1μL，0.2g/mL硫酸葡聚糖1μL，1％(V/V)四氢呋喃1μL，1％(V/V)丙酮1μL，聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)1μL，30wt％H₂O₂ 1μL，1×TBS缓冲液979μL混匀得到辣根过氧化物酶黑色显色剂。

2.一种辣根过氧化物酶黑色显色剂，其特征在于：通过权利要求1所述的制备方法制备得到。

3.根据权利要求2所述的辣根过氧化物酶黑色显色剂，其特征在于：所述的辣根过氧化物酶黑色显色剂的最终显色产物为黑色沉淀。

4.权利要求2或3所述的辣根过氧化物酶黑色显色剂在核酸/蛋白检测中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的辣根过氧化物酶黑色显色剂用于辣根过氧化物酶显色。