CN110554200A - 一种猪伪狂犬病毒gE/gB抗体快速检测装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪伪狂犬病毒gE/gB抗体快速检测装置，属于生物检测技术领域。本发明猪伪狂犬病毒gE/gB抗体快速检测装置，包括反应装置和样品处理液两部分；本发明猪伪狂犬病毒gE/gB抗体快速检测装置可用于猪伪狂犬病毒感染及疫苗免疫的鉴别诊断和评估疫苗免疫效果，检测灵敏度高、特异性强，重复性和稳定性佳，使用快捷方便，具有良好的应用前景。

Description

一种猪伪狂犬病毒gE/gB抗体快速检测装置
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种猪伪狂犬病毒gE/gB抗体快速检测装置。
背景技术
伪狂犬病毒(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)感染引起的多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。猪是伪狂犬病最主要贮存宿主和传染源，该病在猪呈爆发性流行，可引起妊娠母猪流产、死胎，公猪不育，新生仔猪腹泻、神经症状、大量死亡，育肥猪呼吸困难、生长停滞等，是危害全球养猪业的重大传染病之一。英国、丹麦、荷兰、比利时及美国等欧美国家相继实现PRV净化。中国自2011年以来PRVgE阳性率逐年增高，防控力度越来越大。我国已启动PRV净化计划，要求2020年国家核心育种场必须PRV净化。
在PRV与宿主的相互作用中，结构蛋白gB非常保守，具有良好的免疫原性且抗原表位非常清晰可作为理想的血清学检测用抗原。gE蛋白是PRV的一种非常重要的糖蛋白，在决定PRV毒力及神经嗜性等方面起着重要作用，但是gE不是PRV增值所必需的蛋白，常作为缺失的候选基因。检测PRV抗体时要同时监测gE、gB两种抗体，PRV gE抗体检测能有效的区分野毒感染，结合gB抗体检测，能在区分野毒感染的同时监测疫苗抗体水平。因为野毒感染时gB、gE同时阳性，如果没有感染野毒，免疫gE基因缺失疫苗后，gE阴性，gB阳性。若只检测gB抗体，检测结果gB抗体水平很高有可能是野毒感染所致；若只检测gE呈阳性说明野毒感染，为了保护易感猪群还需检测gB抗体水平确定免疫方案。
PRV鉴别诊断方法包括PCR、ELISA、IPMA、胶体金等，PCR和IPMA由于操作复杂，需要专业知识和特殊设备，所以难以广泛推广和现地检测。目前，单克隆抗体已成为研究各种疾病的良好工具。单克隆抗体由于具有特异性强、均质性高、易于标准化以及可批量生产等优点，已被广泛应用于免疫学、肿瘤学、遗传学和其他学科中各种复杂现象的研究中，也广泛应用于诊断、治疗、生物材料的纯化等技术实践中，并以诊断应用居多。胶体金免疫层析技术具有快速简便优点，但也存在灵敏度低、准确性重复性较差、难以进行定量等缺点。本发明克服了胶体金和ELISA技术的不足，保留了胶体金的快速简便优势和ELISA高灵敏高特异优点，使其在现地有了很好的应用。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种猪伪狂犬病毒gE/gB抗体快速检测装置，该装置可用于猪伪狂犬病毒感染及疫苗免疫的鉴别诊断和评估疫苗免疫效果，检测灵敏度高、特异性强，重复性和稳定性佳，使用快捷方便，具有良好的应用前景。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种猪伪狂犬病毒gE/gB抗体快速检测装置，包括反应装置和样品处理液两部分；所述反应装置为顶部敞口的盒体，盒体的敞口上扣装有扣罩，扣罩内安装反应条且扣罩倾斜设置，扣罩的低端通过弹片连接在盒体上、扣罩的高端设置按压键，扣罩上在靠近按压键的位置上开设加样孔；所述反应条包括PVC底衬板、硝酸纤维素膜、吸水滤纸和样品处理垫，硝酸纤维素膜、吸水滤纸和样品处理垫均粘贴在PVC底衬板上且硝酸纤维素膜位于中部，样品处理垫和吸水滤纸分别搭接在硝酸纤维素膜的高端和低端；硝酸纤维素膜的中部间隔设置一个包被有猪伪狂犬gE重组蛋白的检测点1、一个包被有猪伪狂犬gB重组蛋白的检测点2和一个包被有鼠抗羊IgG二抗的质控点，检测点1、检测点2和质控点呈三角排列，在靠近吸水滤纸的位置处设置包被有亚甲基蓝的反应指示线，扣罩上开设有正对硝酸纤维素膜的观察窗；盒体的内部设置有试剂槽，试剂槽位于PVC底衬板贴有样品处理垫一端的正下方，试剂槽的开口上封装有密封薄膜，PVC底衬板的底面上连接有可在按压键按下时将密封薄膜刺破的钩刺。
在上述方案的基础上，所述试剂槽中装有试剂，所述试剂包含洗涤液和酶底物液。
在上述方案的基础上，所述酶底物液包括0.3mg/mL 3-二氨基联苯胺、0.3％CoCl2、0.05-0.1％防腐剂的20mM、pH7.0-8.0的Tris-Cl溶液100uL。
在上述方案的基础上，所述洗涤液包括0.5-1％Tween-20、0.05-0.1％防腐剂、pH7.0-7.4的0.02M PBS溶液100uL。
在上述方案的基础上，所述样品垫包括经处理液处理后的玻璃纤维膜，所述玻璃纤维膜于室温相对湿度不高于30％的条件下密封干燥处理。
在上述方案的基础上，所述处理液为含有0.2-1％％Tween-20和0.5-1％阻断剂的0.02M、pH7.0-7.4的PBS缓冲液。
在上述方案的基础上，所述检测点1、检测点2和质控点以5uL/点的量在硝酸纤维素膜上喷点形成，喷点用的三种溶液分别为将猪伪狂犬gE重组蛋白、猪伪狂犬gB重组蛋白和鼠抗羊IgG二抗用0.02M、pH7.0的Tri-Cl缓冲液配制成3-5mg/mL的溶液，所述硝酸纤维素膜于室温相对湿度不高于30％的条件下干燥、密封保存。
在上述方案的基础上，所述样品处理液包括0.5-1％的Triton100、0.1-0.2％的Casein、0.05-0.1％的防腐剂、0.1-0.5％的酶稳定剂及一定浓度HRP标记羊抗-猪IgG二抗的0.02M PBS缓冲液1mL。
本发明试剂盒的使用过程为：首先，将待检测样品(如血清、血浆等)经样品处理液10倍稀释，37℃预处理10min后吸取150uL样品液从加样孔中逐滴加入，样品液被试纸板的样品垫吸收并在毛细作用下沿硝酸纤维素膜向前层析，待反应指示线出现后按下反应键，钩刺刺穿试剂槽的密封薄膜，样品垫浸入试剂槽内，洗涤液和酶底物液试剂依次沿试纸板向前层析并参与反应。鉴别检测时，若猪伪狂犬强度感染则在反应窗处将出现三个蓝色点，若猪伪狂犬病毒gE基因缺陷疫苗免疫则出现两个蓝色点，无猪伪狂犬病毒则只出现一个蓝色点。
本发明的有益效果是：将待检样本于反应前经样品处理液特殊预处理，降低了特殊样本对检测结果的干扰，提高了检测结果的准确性。同时样品处理液的独特设计极大增强了试剂稳定性。本发明的检测试剂盒可快速、准确的鉴别诊断猪伪狂犬强毒感染与疫苗免疫，检测灵敏度高、特异性强，重复性和稳定性佳，使用快捷方便，具有良好的应用前景。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
图1为本发明装置的结构示意图；
图2为本发明中试纸板的结构示意图。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
参照附图，本发明的一种猪伪狂犬病毒gE/gB抗体快速检测装置，其反应装置为包括顶部敞口的盒体1，盒体的敞口上扣装有扣罩2，扣罩2内安装反应条3且扣罩2倾斜设置，扣罩2的低端通过弹片4连接在盒体1上、扣罩2的高端设置按压键5，扣罩2上在靠近按压键5的位置上开设加样孔6；所述反应条3包括PVC底衬板7、硝酸纤维素膜8、吸水滤纸9和样品处理垫14，硝酸纤维素膜8、吸水滤纸9和样品处理垫14均粘贴在PVC底衬板7上且硝酸纤维素膜8位于中部、样品处理垫14和吸水滤纸9分别搭接在硝酸纤维素膜8的高端和低端；硝酸纤维素膜8的中部间隔设置一个包被有猪伪狂犬gE重组蛋白的检测点D-T1、一个包被有猪伪狂犬gB重组蛋白的检测点D-T2和一个包被有鼠抗羊IgG二抗的质控点D-C，D-T1、D-T2和D-C呈等边三角排列，并在靠近吸水滤纸9的位置处设置包被有亚甲基蓝的反应指示线L-I，扣罩2上开设有正对硝酸纤维素膜8的观察窗13；盒体1的内部设置有试剂槽10，试剂槽10位于PVC底衬板7贴有样品处理垫14一端的正下方，试剂槽10的开口上封装有密封薄膜11，PVC底衬板7的底面上连接有可在按压键按下时将密封薄膜11刺破的钩刺12。
其中，样品垫包括经处理液处理后的玻璃纤维膜，所述玻璃纤维膜于室温相对湿度不高于30％的条件下密封干燥处理。处理液为含有0.2-1％％Tween-20和0.5-1％阻断剂的0.02M、pH7.0-7.4的PBS缓冲液。
检测点D-T1、D-T2和质控点D-C以5uL/点的量在硝酸纤维素膜上喷点形成，喷点用的溶液分别为将猪伪狂犬gE重组蛋白、猪伪狂犬gB重组蛋白和鼠抗羊IgG二抗用0.02M、pH7.0的Tri-Cl缓冲液配制成3-5mg/mL的溶液，喷点后的硝酸纤维素膜于室温相对湿度不高于30％的条件下干燥、密封保存。
试剂池内设有试剂，试剂包括洗涤液和酶底物液。其中，洗涤液包括0.5-1％Tween-20、0.05-0.1％防腐剂、pH7.0-7.4的0.02M PBS溶液100uL。酶底物液包括0.3mg/mL3-二氨基联苯胺、0.3％CoCl2、0.2％过氧化物、0.05％Proclin300的20mM、pH7.8的Tris-Cl溶液100uL。
待检测样品在滴入加样孔前要经样品处理液处理，样品处理液包括0.5-1％的Triton100、0.1-0.2％的Casein、0.05-0.1％的防腐剂、0.1-0.5％的酶稳定剂及一定浓度HRP标记羊抗-猪IgG二抗的0.02M PBS缓冲液1mL。
本发明试剂盒的使用过程为：首先，将待检测样品(如血清、血浆等)经样品处理液10倍稀释，37℃预处理10min后吸取150uL样品液从加样孔中逐滴加入，样品液被试纸板的样品垫吸收并在毛细作用下沿硝酸纤维素膜向前层析，待反应指示线出现后按下反应键，钩刺刺穿试剂槽的密封薄膜，样品垫浸入试剂槽内，洗涤液和酶底物液试剂依次沿试纸板向前层析并参与反应。鉴别检测时，若猪伪狂犬强度感染则在反应窗处将出现三个蓝色点，若猪伪狂犬病毒gE基因缺陷疫苗免疫则出现两个蓝色点，无猪伪狂犬病毒则只出现一个蓝色点。
可靠性分析
IDEXX PRVgB抗体ELISA试剂盒与PRVgE抗体ELISA试剂盒对50份临床标本进行平行检测，结果一致性100％。结果如下：
表1本发明试剂盒与IDEXX试剂盒检测结果比较
检测灵敏度分析
将表1中的1#标本按1:2、1:4、1:8、1:16...梯度稀释后测定，本发明试剂盒的检测结果与IDEXX试剂盒基本一致，且本发明试剂盒对样品的检测灵敏度高于对照试剂盒，结果如下：
表2本发明试剂盒检测灵敏度分析
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (8)

1.一种猪伪狂犬病毒gE/gB抗体快速检测装置，其特征在于：包括反应装置和样品处理液两部分；所述反应装置为顶部敞口的盒体(1)，盒体的敞口上扣装有扣罩(2)，扣罩(2)内安装反应条(3)且扣罩(2)倾斜设置，扣罩(2)的低端通过弹片(4)连接在盒体(1)上、扣罩(2)的高端设置按压键(5)，扣罩(2)上在靠近按压键(5)的位置上开设加样孔(6)；所述反应条(3)包括PVC底衬板(7)、硝酸纤维素膜(8)、吸水滤纸(9)和样品处理垫(14)，硝酸纤维素膜(8)、吸水滤纸(9)和样品处理垫(14)均粘贴在PVC底衬板(7)上且硝酸纤维素膜(8)位于中部，样品处理垫(14)和吸水滤纸(9)分别搭接在硝酸纤维素膜(8)的高端和低端；硝酸纤维素膜(8)的中部间隔设置一个包被有猪伪狂犬gE重组蛋白的检测点1(D-T1)、一个包被有猪伪狂犬gB重组蛋白的检测点2(D-T2)和一个包被有鼠抗羊IgG二抗的质控点(D-C)，检测点1(D-T1)、检测点2(D-T2)和质控点(D-C)呈三角排列，在靠近吸水滤纸(9)的位置处设置包被有亚甲基蓝的反应指示线(L-I)，扣罩(2)上开设有正对硝酸纤维素膜(8)的观察窗(13)；盒体(1)的内部设置有试剂槽(10)，试剂槽(10)位于PVC底衬板(7)贴有样品处理垫(14)一端的正下方，试剂槽(10)的开口上封装有密封薄膜(11)，PVC底衬板(7)的底面上连接有可在按压键按下时将密封薄膜(11)刺破的钩刺(12)。
2.根据权利要求1所述猪伪狂犬病毒gE/gB抗体快速检测装置，其特征在于：所述试剂槽(10)中装有试剂，所述试剂包含洗涤液和酶底物液。
3.根据权利要求2所述的猪伪狂犬病毒gE/gB抗体快速检测装置，其特征在于：所述酶底物液包括0.3mg/mL 3-二氨基联苯胺、0.3％CoCl2、0.05-0.1％防腐剂的20mM、pH7.0-8.0的Tris-Cl溶液100uL。
4.根据权利要求2所述的猪伪狂犬病毒gE/gB抗体快速检测装置，其特征在于：所述洗涤液包括0.5-1％Tween-20、0.05-0.1％防腐剂、pH7.0-7.4的0.02M PBS溶液100uL。
5.根据权利要求1～4任一项所述的猪伪狂犬病毒gE/gB抗体快速检测装置，其特征在于：所述样品垫包括经处理液处理后的玻璃纤维膜，所述玻璃纤维膜于室温相对湿度不高于30％的条件下密封干燥处理。
6.根据权利要求5所述的猪伪狂犬病毒gE/gB抗体快速检测装置，其特征在于：所述处理液为含有0.2-1％％Tween-20和0.5-1％阻断剂的0.02M、pH7.0-7.4的PBS缓冲液。
7.根据权利要求5所述的猪伪狂犬病毒gE/gB抗体快速检测装置，其特征在于：所述检测点1(D-T1)、检测点2(D-T2)和质控点(D-C)以5uL/点的量在硝酸纤维素膜上喷点形成，喷点用的三种溶液分别为将猪伪狂犬gE重组蛋白、猪伪狂犬gB重组蛋白和鼠抗羊IgG二抗用0.02M、pH7.0的Tri-Cl缓冲液配制成3-5mg/mL的溶液，所述硝酸纤维素膜于室温相对湿度不高于30％的条件下干燥、密封保存。
8.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒gE/gB抗体快速检测装置，其特征在于：所述样品处理液包括0.5-1％的Triton100、0.1-0.2％的Casein、0.05-0.1％的防腐剂、0.1-0.5％的酶稳定剂及一定浓度HRP标记羊抗-猪IgG二抗的0.02M PBS缓冲液1mL。
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