CN111198273B - 抗磷脂酶a2受体自身抗体的免疫检测试剂盒、其制备方法及使用方法 - Google Patents

抗磷脂酶a2受体自身抗体的免疫检测试剂盒、其制备方法及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了抗磷脂酶A2受体自身抗体免疫检测试剂盒、其制备方法及使用方法，其包括，PLA2R‑IgG荧光免疫层析试纸条、微球溶液；所述微球溶液中，其微球为偶联有抗人IgG抗体的荧光微球；所述PLA2R‑IgG荧光免疫层析试纸条，包括吸水纸、层析膜、样品垫、支持底板，层析膜上设置检测线和质控线，检测线上涂有PLA2R抗原，质控线上涂有能捕获微球表面抗体的二抗。本发明在现有试纸条基础上改变了试纸条的构造，去除结合垫；并采用了不同的检测步骤，即：两步法反应，第一步加入样本孵育，第二步加入示踪物。本发明研究发现，采用本发明方法显著提高了特异性的荧光信号强度。

Description

抗磷脂酶A2受体自身抗体的免疫检测试剂盒、其制备方法及 使用方法
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及抗磷脂酶A2受体自身抗体免疫检测试剂盒、其制备方法及使用方法。
背景技术
位于肾小球足上皮细胞表面的磷脂酶A2受体(Phospholipase A2 receptor，PLA2R)是特发性膜性肾病的靶抗原，其自身抗体免疫球蛋白G(Immunoglobulin，IgG)为特发性膜性肾病的血清学标志物，在70％的患者中呈高滴度，浓度可达到ppm。因此，为了实现准确检测，常采用异相免疫方法进行分析，如酶联免疫分析法、时间分辨荧光免疫分析法。为提高免疫检测的效率，可定量的荧光免疫层析方法及试剂已经成为研究开发的热点，我们发现已有的试纸条构造是将微球-抗体示踪物固定于结合垫，特异性抗原喷涂在硝酸纤维素膜中间，检测时将血清样本滴在样品垫，通过层析作用，样品中的特异性IgG和结合垫上的抗体一起移动，并在硝酸纤维素膜上聚集形成可观测的抗原-抗体-抗体复合物，但该试剂和方法存在荧光信号低、可测范围窄，不能实现灵敏、准确的定量分析，与酶免试剂盒测定结果的一致性差，不能很好的用于临床监测。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
作为本发明其中一个方面，本发明提供一种抗磷脂酶A2受体自身抗体的免疫检测试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种抗磷脂酶A2受体自身抗体的免疫检测试剂盒，其包括，PLA2R-IgG荧光免疫层析试纸条、微球溶液；
所述微球溶液中，其微球为偶联有抗人IgG抗体的荧光微球；
所述PLA2R-IgG荧光免疫层析试纸条，包括吸水纸、层析膜、样品垫、支持底板，所述层析膜上设置检测线和质控线，所述检测线上涂有PLA2R抗原，所述质控线上涂有能捕获微球表面抗体的二抗；
所述微球溶液，其微球的浓度为10～50μg/mL；所述抗体与微球偶联反应的质量比为1：10～100。
作为本发明所述的抗磷脂酶A2受体自身抗体的免疫检测试剂盒的一种优选方案：所述微球溶液为含有蛋白和表面活性剂的缓冲液，所述荧光微球为塑料材质；所述微球，其直径为100～500nm。
作为本发明所述的抗磷脂酶A2受体自身抗体的免疫检测试剂盒的一种优选方案：所述荧光微球，其荧光物质包括异硫氰酸荧光素或镧系元素；所述层析膜包括醋酸纤维素膜。
作为本发明所述的磷脂酶A2受体自身抗体的免疫检测试剂盒的优选方案：所述荧光物质为铕；所述检测线，其涂有的PLA2R抗原含量为5～50ng/mm2。
作为本发明的另一个方面，本发明提供制备如所述的磷脂酶A2受体自身抗体的免疫检测试剂盒的方法，其包括制备微球溶液，所述制备微球溶液的制备方法为：
活化微球：将微球加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行活化；
偶联：加入2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)溶液清洗后，再加入抗人IgG抗体，按抗体与微球的质量比为1：10～100进行偶联；
封闭：加入封闭液进行封闭；
洗涤：去除未反应物，获得偶联微球；
稀释：将偶联得到的微球稀释至10～50μg/mL。
作为本发明所述的方法的一种优选方案：所述MES溶液，其pH为4.5；所述活化液，为10mg/ml EDC和10mg/ml NHS；所述封闭液，含有10％牛血清白蛋白；清洗液为含有1‰Tween-20的Tris-HCl缓冲液。
作为本发明的另一个方面，本发明提供所述的免疫检测试剂盒的使用方法，其包括，
将样品滴加在样品垫中孵育10～30min；
向样品垫加入微球溶液，孵育10～30min；
进行荧光检测。
作为本发明所述的免疫检测试剂盒的使用方法的一种优选方案：所述样品，其在滴加到样品垫之前先进行稀释，稀释倍数为50～200。
本发明的有益效果：本发明通过在现有试纸条基础上改变了试纸条的构造，去除结合垫；并采用了不同的检测步骤，即：两步法反应，第一步加入样本孵育，第二步加入示踪物(微球抗体偶联物)，从而显著提高了特异的荧光信号强度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为PLA2R-IgG免疫层析试纸条剖面图(a.样品垫b.检测(T)线c.质控(C)线d.吸水纸e.层析(NC)膜f.底板)。
图2为本发明测定人血液PLA2R-IgG荧光免疫层析试剂的标准曲线。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1：
检测PLA2R-IgG的试纸条，包括底板，以及沿所述底板长度方向顺次粘覆于所述底板上的吸水纸、NC膜以及样品垫；其中，NC膜e粘覆于所述底板f的中间部位；吸水纸d、NC膜e以及所述样品垫a之间，依次与且仅与相邻部位相接触且部分重叠；NC膜上设有相间隔的喷涂有PLA2R抗原的T线b，以及喷涂有二抗的C线c；其中，T线b靠近所述样品垫a设置，C线c靠近吸水纸d设置。
高分子纳米微球涂层含有铕离子，含有铕离子的高分子纳米微球涂层的设置减少了稀土离子在样品溶液的猝灭，提高了稀土离子发出的荧光强度，因此不仅提高了检测的精确度，而且便于检测结果的显示和操作者的观察。高分子纳米微球的直径为200nm。
试纸条的制备方法为：
(1)PLA2R抗原的预处理：将商品化抗原PLA2R用0.05mol/L，pH 7.4的磷酸盐缓冲液在4℃下透析过夜。
(2)硝酸纤维素膜的制备：使用含1％蔗糖的pH 7.4的磷酸盐缓冲液，分别将透析过的PLA2R抗原和抗鼠抗体稀释到1μg/mL的浓度，使用定量喷膜仪以10μl/mm2的量将两者喷于硝酸纤维素膜上，37℃烘干1h。
(3)试纸条的组装：在底板中间先铺设NC膜，然后在与C线相临近的一端铺吸水纸，使吸水纸与NC膜部分重叠；在与T线相临近的一端铺样品垫。用斩切机切按0.4cm宽度斩切后，装入塑料卡壳中。
PLA2R-IgG检测微球溶液的制备：
材料：
①进口微球(phosphorex公司)、抗人IgG的抗体(本实施例以鼠抗人IgG的抗体为例，抗体购自Abcam公司，ab200699)；
②溶液：
MES溶液pH4.5
活化液EDC、NHS：用MES溶液稀释至10mg/ml
封闭液：10％BSA+pH7.4 PB
清洗液：0.05M Tris-HCl pH7.4+Tween-20
PLA2R-IgG检测微球溶液制备步骤：
A.取50μl微球加入700μl MES中离心15min，去上清，清洗三次。
B.活化：清洗后，加入50μl活化液。25℃混匀活化0.5h。
C.偶联：活化后离心，500μl MES继续清洗三次，最后一次加入抗人IgG抗体，使抗体：微球质量比＝1：50。25℃烘箱内，混匀偶联2h。
D.封闭：加入50μl封闭液，25℃烘箱内，混匀封闭0.5h。
E.封闭结束后离心，加入500μl清洗液清洗三次，最后一次加入微球缓冲液复溶至20μg/mL待用；微球缓冲液为含有1％BSA、0.1％Tween-20、0.4％S9、5％蔗糖、0.1％Proclin-300、0.05M pH7.4的磷酸盐缓冲液。
使用本发明试纸条对PLA2R-IgG定量检测的方法：以PLA2R-IgG标准品作为样品，取6个不同的浓度，分别为0、5、20、100、500、1500RU/mL，每个浓度做2个平行样，进行检测。
准备：打开仪器电源开关，预热；试纸条、微球溶液、样品稀释液、样品等室温平衡；
检测：取50μl已稀释的样品(按照1：100稀释)滴加在所述的试纸条的样品垫中，孵育20min；向样品垫加入已稀释的微球溶液，孵育10min；荧光扫描所述T线和C线。若所述C线区域出现荧光发射峰，则表明该试纸条有效，反之则无效。
数值分析与整理：检测结果(见表1)以荧光信号值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，建立双对数方程并拟合标准曲线(图2)。
本发明方法检测PLA2R-IgG特异性达到97％。
表1 PLA2R-IgG标准品的检测结果
标准品浓度 C线荧光 T线荧光 T/C比值 偏差
0 630533 16246 0.026 4.63％
10 573734 150525 0.262 3.74％
20 516748 271433 0.525 7.79％
100 243690 464574 1.906 8.84％
500 106349 605227 5.691 3.64％
1500 64546 657277 10.183 3.11％
图1为PLA2R-IgG免疫层析试纸条剖面图(a.样品垫b.T线c.C线d.吸＝098水纸e.NC膜f.底板)。图2为本发明测定人血液PLA2R-IgG的荧光免疫层析试剂的标准曲线。
对照例1：
采用传统一步法检测：
采用一步法同样检测实施例1中6个标准品，向试纸条样品垫中央加入50μl样品，孵育30min，检测结果见表2。
表2 PLA2R-IgG试纸条一步法检测结果
标准品浓度 C线荧光 T线荧光 T/C比值 偏差
0 295330 16246 0.055 12.09％
10 273734 15055 0.055 13.80％
20 216948 17433 0.080 5.22％
100 243190 20572 0.085 7.19％
500 186341 55220 0.296 16.10％
1500 164543 67227 0.409 18.16％
明显看出采用传统将微球抗体结合到结合垫上、采用一步检测的方法，在较低浓度区无法实现准确检测，检测荧光值区分不明显，T/C明显较低，并且偏差较大，检测灵敏度和特异性明显较差。
本发明在现有试纸条基础上改变了试纸条的构造，去除结合垫；并采用了不同的检测步骤，即：两步法反应，第一步加入样本孵育，第二步加入示踪物。本发明研究发现，采用本发明方法显著提高了PLA2R-IgG特异性荧光信号强度，显著降低了检测噪声。
对照例2：
将实施例1中抗体：微球质量比改为1：5，其余制备方法均与实施例相同。
表3对照例2的PLA2R-IgG标准品的检测结果
对照例3：
将实施例1中抗体：微球质量比改为1：150，其余制备方法均与实施例相同。
表4对照例3的PLA2R-IgG标准品的检测结果
标准品浓度 C线荧光 T线荧光 T/C比值 偏差
0 559910 6508 0.012 9.12％
10 450872 13908 0.031 5.29％
20 332281 26015 0.078 4.18％
100 289635 101873 0.352 6.64％
500 201109 266728 1.326 11.19％
1500 104654 358206 3.423 10.7％
通过对照例2、3明显看出抗体与微球偶联反应的质量比过低或过高都不合适，均影响特异性荧光信号强度，进而影响分析灵敏度和特异性结合效率。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (5)

1.一种免疫层析试纸条在制备抗磷脂酶A2受体自身抗体的免疫检测试剂盒中的应用，其特征在于：采用抗磷脂酶A2受体自身抗体的免疫检测试剂盒，所述免疫检测试剂盒包括PLA2R-IgG荧光免疫层析试纸条、微球溶液；
所述PLA2R-IgG荧光免疫层析试纸条，包括吸水纸、层析膜、样品垫、支持底板，所述层析膜上设置检测线和质控线，所述检测线上涂有PLA2R抗原，所述质控线上涂有能捕获微球表面抗体的二抗；
所述微球溶液中，其微球为偶联有抗人IgG抗体的荧光微球；其微球的浓度为10～50μg/mL；所述抗体与微球的质量比为1：10～100；
所述微球溶液为含有蛋白和表面活性剂的缓冲液，所述荧光微球为塑料材质；所述微球，其直径为100～500nm；
所述检测线，其涂有的PLA2R抗原含量为5～50ng/mm2；
将样品滴加在样品垫中孵育10～30min；之后向样品垫加入微球溶液，孵育10～30min；进行荧光检测；
所述层析膜为醋酸纤维素膜。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述荧光微球，其荧光物质包括异硫氰酸荧光素或镧系元素。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述抗磷脂酶A2受体自身抗体的免疫检测试剂盒，其制备方法包括制备微球溶液，所述制备微球溶液的制备方法为：
活化微球：将微球加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺进行活化；
偶联：加入2-(N-吗啉)乙磺酸溶液清洗后，再加入抗人IgG抗体，按抗体与微球的质量比为1：10～100进行偶联；
封闭：加入封闭液进行封闭；
洗涤：去除未反应物，获得偶联微球；
稀释：将偶联得到的微球稀释至10～50μg/mL待用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述2-(N-吗啉)乙磺酸溶液，其pH为4.0-6.5；所述封闭液，含有10％牛血清白蛋白；所述洗涤，其洗涤液为含有Tween-20的Tris-HCl缓冲液。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述样品，其在滴加到样品垫之前先进行稀释，稀释倍数为50～200倍。
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