CN112666357A - 一种抗血小板抗体检测信号制剂的制备方法、抗血小板抗体检测信号制剂及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药制剂技术领域，尤其是涉及一种抗血小板抗体检测信号制剂的制备方法、抗血小板抗体检测信号制剂及应用，所述制备方法包括，取配方量的均匀包被了单克隆抗人IgG抗体的肉眼可辨颜色的微球或微粒和复合稳定剂，用PBS溶液均匀溶解得到检测信号制剂。本发明提供的抗血小板抗体检测信号制剂的制备方法，采用肉眼可辨颜色的微球代替红细胞，在复合稳定剂的作用下，能够大大地延长保存时间，实现了与检测产品的其他组分同步购买、储藏和使用，其稳定保存周期可达一年以上，为抗血小板抗体检测产品的生产和运输过程都提供了极大的方便。

Description

一种抗血小板抗体检测信号制剂的制备方法、抗血小板抗体 检测信号制剂及应用

技术领域

本发明涉及医药制剂技术领域，尤其是涉及一种抗血小板抗体检测信号制剂的制备方法、抗血小板抗体检测信号制剂及应用。

背景技术

血小板输注可用于预防和治疗血小板数量减少或功能缺失患者的出血症状，恢复和维持人体的正常止血和凝血功能。然而，长期的血小板输注可能带来血小板输注无效的严重后果，即连续两次输注足量血小板，患者临床出血症状未见改善，血小板计数未见明显增高。血小板抗原经输血、妊娠及骨髓移植等可刺激机体产生抗血小板抗体致敏血小板并使其破坏，引起血小板减少，导致患者出现瘀点、瘀斑、出血甚至死亡等严重后果。HLA致敏是最常见的血小板输注无效的免疫因素。因此，检测患者是否有抗血小板抗体，可辅助临床采取恰当的预防和治疗措施，特别是能为抗血小板抗体阳性患者进行交叉配型，以筛选血小板相容性供者，可显著减少血小板输注无效症的发生。

抗血小板抗体检测试剂盒为各大医院、血站输血科提供了一个简易、快捷的方法来检测患者血清中是否有抗血小板抗体，可辅助临床采取恰当的预防和治疗措施，特别是能为抗血小板抗体阳性患者进行交叉配型以筛选血小板相容性供者，从而预防血小板输注无效。目前国内外抗血小板抗体检测注要有免疫细胞化学法、微柱凝胶法及固相凝集法三种。免疫细胞化学法由于需要专用仪器、繁琐、耗时，不适于基层开展，微柱凝胶法容易造成结果误差，而固相凝集法因灵敏度，特异性高而前景较好。

检测抗血小板抗体现在商品化的试剂有ELISA类如GTI公司的MACE(筛查并区分HLA+HPA)，PAKAUTO(检测自身抗体)，PAK12(鉴定HPA特异性)；固相红细胞吸附类试剂如Immucor公司的capture P(筛查血小板抗体)，荷兰Sanquin试剂MASPAT(筛查抗体)；免疫荧光技术如Onelambda公司的流式磁珠试剂FlowPRA(可鉴定HLA抗体特异性)。

Capture P检测原理：Capture P是一种固相微孔板系统，通过血小板与其抗体之间的免疫反应来检测血清或血浆中的抗血小板抗体。微孔板上预先包被有抗血小板单克隆抗体，加入血小板悬液后，通过离心将血小板固定在微孔上，再将低离子强度的缓冲液和患者血清加入到孔内，让血清中的抗体与固定的血小板层充分结合，孵育后洗去未结合的血清，再加入鼠抗人IgG单克隆抗体致敏的红细胞来检测与血小板结合的抗体。当患者血清中抗血小板抗体为阳性时，指示红细胞结合到血小板单层上的IgG抗体上，则显示阳性反应。因此，阳性反应的特点是指示红细胞平铺在反应孔底部表面，而阴性反应是指示红细胞聚集在孔底部中央形成细胞扣。

MASPAT检测原理：抗血小板抗体检测试剂盒(固相凝集法)的检测原理是基于抗原/抗体反应的固相凝集技术。供者血小板通过离心固定在包被有血小板特异性鼠单克隆抗体的微孔内表面，加入1×PBST清洗液洗去未结合的血小板形成血小板单细胞层。将患者血清和LISS(低离子强度溶液)加入相应的微孔中孵育，使患者血清中的抗体与固定的血小板单细胞层结合。孵育结束后，再加入清洗液洗去未结合或非特异性结合的抗体。加入抗人IgG(桥接抗体)和人IgG致敏红细胞后，通过离心微孔板的方法检测样本中与血小板结合的抗体。通过抗血小板抗体检测用指示红细胞(固相凝集法)在微孔中的状态可直接肉眼观察得出抗血小板抗体检测的结果。阳性反应的特点是指示红细胞平铺在反应孔底部表面，而阴性反应是指示红细胞聚集在孔底部中央。

以上固相红细胞吸附类方法均需要抗体致敏的红细胞作为检测系统的指示信号。其优点是利用了红细胞肉眼可辨的颜色，信号显示简单、直观；同时作为早期建立起来的免疫分析方法的一个重要组成，这样的信号系统简便易得。但其缺陷也同样明显：①首先是效期短，不同于目前常见的信号分子或微粒，红细胞本身是生命单元，保存条件要求高(既不能低温冻存也不能常温保存)，且不能长时间保存，因此以指示红细胞作为检测信号的免疫分析产品如前述的Capture P和MASPAT产品，指示红细胞只能作为独立的组分保存，效期(仅2个月)显著短于检测试剂盒的其他组分(其他组分的效期通常至少为1年)，这就给实际使用甚至是生产、运输过程造成极大的不便；②其次，红细胞本身不能与检测系统中的抗血小板抗体(样本中的目标IgG)结合，因此还需要额外的抗体分子进行桥接——即多效价的抗人IgG(IgM)，增加了检测系统的复杂性；③最后，红细胞是生物源材料，在大规模生产时，需要解决稳定的来源及保证来源的生物安全性，这无疑增加了生产的风险和成本。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗血小板抗体检测信号制剂的制备方法，及该方法得到的检测信号制剂，用来代替现有血小板抗体检测技术中使用的红细胞制剂，以缓解了现有技术中存在的效期短、反应体系复杂和存在安全风险的技术问题。

本发明的另一个目的在于，提供上述抗血小板抗体检测信号制剂的制备方法以及该方法得到的检测信号制剂在制备抗血小板抗体检测产品中的应用，以提高现有抗血小板抗体检测的效率及安全性能。

为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明特提出以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种抗血小板抗体检测信号制剂的制备方法，所述制备方法包括，取配方量的均匀包被了单克隆抗人IgG抗体的肉眼可辨颜色的微球或微粒和复合稳定剂，用PBS溶液均匀溶解得到检测信号制剂。

在可选的实施方式中，所述均匀包被了单克隆抗人IgG抗体的肉眼可辨颜色的微球或微粒的制备方法包括，肉眼可辨颜色的微球或微粒表面羧酸基团活化处理后与单克隆抗人IgG抗体的Fc段偶联，而后封闭肉眼可辨颜色的微球或微粒表面多余活化羧酸基团位点，再经过至少两步离心得到包被了单克隆抗人IgG抗体的肉眼可辨颜色的微球或微粒。

所述肉眼可辨颜色的微球或微粒与单克隆抗人IgG抗体偶联后，至少经过两次离心的目的在于，保证包被了单克隆抗人IgG抗体的微球或微粒与游离的单克隆抗人IgG抗体能够充分分离。

所述肉眼可辨颜色包括能够将微球或微粒与反应体系或反应容器区分的各种颜色，包括但不限于红色、黑色、蓝色、黄色等，甚至可以为荧光微球或微粒。

在可选的实施方式中，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒与单克隆抗人IgG抗体的质量比为1～10：1，包括但不限于1：1、1.5：1、2：1、2.5：1、3：1、3.5：1、4：1、4.5：1、5：1、5.5：1、6：1、6.5：1、7：1、7.5：1、8：1、8.5：1、9：1、9.5：1或10：1，优选为5.2：1。

在可选的实施方式中，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒表面羧酸基团活化处理的方法包括，向肉眼可辨颜色的微球或微粒悬液中依次加入脂肪酸甲酯磺酸盐、N-羟基丁二酰亚胺溶液和碳二亚胺溶液，反应结束后离心得到表面羧酸基团活化后的肉眼可辨颜色的微球或微粒。

在可选的实施方式中，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒悬液中含有的肉眼可辨颜色的微球或微粒的质量体积比为(1～5)g：100ml，所述N-羟基丁二酰亚胺溶液浓度为30～80g/L，所述碳二亚胺溶液浓度为30～80g/L，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒悬液、脂肪酸甲酯磺酸盐、N-羟基丁二酰亚胺溶液和碳二亚胺溶液的体积比为1：(15～30)：(1～5)：(0.1～0.5)。

所述肉眼可辨颜色的微球或微粒悬液中含有的肉眼可辨颜色的微球或微粒的质量体积比包括但不限于1g：100ml、1.5g：100ml、2g：100ml、2.5g：100ml、3g：100ml、3.5g：100ml、4g：100ml、4.5g：100ml或5g：100ml。

所述N-羟基丁二酰亚胺溶液浓度包括但不限于30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L或80g/L。

所述碳二亚胺溶液浓度包括但不限于30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L或80g/L。

所述肉眼可辨颜色的微球或微粒悬液、脂肪酸甲酯磺酸盐、N-羟基丁二酰亚胺溶液和碳二亚胺溶液的体积比包括但不限于1：15：1：0.1、1：19：2：0.2、1：23：3：0.3、1：27：4：0.4或1：30：5：0.5。

优选地，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒悬液中含有的肉眼可辨颜色的微球或微粒的质量体积比为2.67g：100ml，所述N-羟基丁二酰亚胺溶液浓度为50g/L，所述碳二亚胺溶液浓度为50g/L，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒悬液、脂肪酸甲酯磺酸盐、N-羟基丁二酰亚胺和碳二亚胺的体积比为1:21:2:0.1。

在可选的实施方式中，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒的制备材料包括聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或氧化硅中的至少一种。

优选地，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒的粒径为10nm～10μm，包括但不限于10nm、50nm、70nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm、3μm、5μm、7μm、9μm或10μm，优选为6μm。

优选地，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒的密度为1～1.2g/cm³，包括但不限于1g/cm³、1.05g/cm³、1.1g/cm³、1.15g/cm³或1.2g/cm³，优选为1.05g/cm³；

优选地，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒为粒径为6μm、密度为1.05g/cm³的聚苯乙烯红色微球。

在可选的实施方式中，所述复合稳定剂包括非离子型去污剂或表面活性剂、惰性蛋白、渗透性保护剂或防腐剂中的至少一种；

优选地，所述非离子型去污剂或表面活性剂包括多元醇类表面活性剂；

优选地，所述非离子型去污剂或表面活性剂在检测信号制剂中的质量体积比为(0.1～0.5)g：100ml，包括但不限于0.1g：100ml、0.2g：100ml、0.3g：100ml、0.4g：100ml或0.5g：100ml，优选为0.1g：100ml。

优选地，所述非离子型去污剂或表面活性剂为Tween20，非离子表面活性剂Tween20能够降低均匀包被了单克隆抗人IgG抗体的肉眼可辨颜色的微球或微粒的非特异性吸附。

优选地，所述惰性蛋白在检测信号制剂的质量体积比为(0.1～0.5)g：100ml，包括但不限于0.1g：100ml、0.2g：100ml、0.3g：100ml、0.4g：100ml或0.5g：100ml，优选为0.1g：100ml。

优选地，所述惰性蛋白包括牛血清蛋白或酪蛋白，进一步优选为牛血清蛋白，与其他惰性蛋白相比，牛血清蛋白能够显著降低均匀包被了单克隆抗人IgG抗体的肉眼可辨颜色的微球或微粒的非特异性吸附，尤其是，当牛血清蛋白在检测信号制剂的质量体积比为0.1g：100ml时，能够避免假阳性结果的出现。

优选地，所述渗透性保护剂包括氨基酸、四分子胺化合物、多羟基化合物或多糖化合物中的至少一种。

优选地，所述渗透性保护剂在检测信号制剂的质量体积比为(0.5～5)g：100ml，包括但不限于0.5g：100ml、1g：100ml、1.5g：100ml、2g：100ml、2.5g：100ml、3g：100ml、3.5g：100ml、4g：100ml、4.5g：100ml或5g：100ml，优选为1g：100ml。

优选地，所述渗透性保护剂为蔗糖。

优选地，所述防腐剂在检测信号制剂的质量体积比为(0.02～0.1)g：100ml，包括但不限于0.02g：100ml、0.03g：100ml、0.04g：100ml、0.05g：100ml、0.06g：100ml、0.07g：100ml、0.08g：100ml、0.09g：100ml或0.1g：100ml，优选为0.03g：100ml。

优选地，所述防腐剂为ProClin300。

在可选的实施方式中，所述均匀包被了单克隆抗人IgG抗体的肉眼可辨颜色的微球或微粒在检测信号制剂中的质量体积比为0.05～0.4g：100ml，包括但不限于0.05g：100ml、0.1g：100ml、0.15g：100ml、0.2g：100ml、0.25g：100ml、0.3g：100ml、0.35g：100ml或0.4g：100ml，优选为0.125g：100ml。

第二方面，本发明提供采用前述实施方式任一项所述制备方法得到的检测信号制剂。

第三方面，本发明提供采用前述实施方式任一项所述制备方法得到检测信号制剂或前述实施方式所述检测信号制剂在制备抗血小板抗体检测产品中的应用。

优选地，所述抗血小板抗体检测产品包括抗血小板抗体检测试剂盒。

本发明提供的抗血小板抗体检测信号制剂的制备方法，采用肉眼可辨颜色的微球代替红细胞，在复合稳定剂的作用下，能够大大地延长保存时间，实现了与检测产品中其他组分同步购买、储藏和使用，使血小板抗体检测试剂盒成为一个完整的试剂盒，其稳定保存周期可达一年以上，为抗血小板抗体检测产品的生产和运输过程都提供了极大的方便。同时本发明提供的肉眼可辨颜色的微球或微粒可以直接用单克隆抗人IgG抗体对其进行均匀包被，与指示红细胞检测体系构建相比，简化了免疫复合物的组成，即简化了检测步骤。此外，本发明提供的肉眼可辨的微球或微粒非生物源材料，不存在生物安全风险，便于大规模生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1纯化得到的人IgG抗体的电泳结果；

图2为本发明实施例2得到的单克隆抗人IgG抗体的电泳结果；

图3为本发明实施例5对抗体阴性血小板的检测结果；

图4为本发明实施例6对抗体阴性血小板的检测结果；

图5为本发明对比例1中与质控检测对比结果；

图6为本发明实施例7、对比例2和3检测结果对比；

图7为对比例4和对比例5的检测结果；

图8为实施例8和对比例6的检测结果对比。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。

下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

本实施例提供了从人血浆中纯化人IgG抗体的方法，包括将ACD保存液保存的冰冻人血浆1L于37℃快速解冻后在8000g、4℃的条件下离心20min，而后弃上清，得到组分A。将组分A用等体积的PBS稀释后用0.45μm微孔滤膜过滤，得到组分B。组分B上样至抗体亲和层析柱(HiTrap^TMMabSelect^TM)。用PBS平衡层析柱后，待流穿峰平衡至基线后，改用亲和层析洗脱液(200mM Gly-HCl，pH2.7)洗脱。收集洗脱峰，洗脱峰加1/10体积的中和液(1M Tris-HCl pH9.0)中和pH，超滤浓缩后用分子筛去除内毒素后测定其蛋白浓度。经BCA法检测，收集的人IgG浓度为5.8mg/mL。用SDS-PAGE电泳法测定其分子量重链约为50千道尔顿，轻链约为20千道尔顿，如图1所示。

实施例2

本实施例提供了采用实施例1得到的人IgG抗原免疫小鼠制备鼠抗人IgG单克隆抗体的方法，包括如下步骤：

取Balb/C小鼠5只，第1天首次免疫，使用实施例1得到的人IgG抗体和等量完全弗氏佐剂混合，充分乳化后，按照100μg/只的注射量，对5至小鼠进行皮下注射，注射总量200μl。

第14天进行二次免疫，使用实施例1得到的人IgG抗体和等量不完全弗氏佐剂混合，充分乳化，按照100μg/只的注射量，对5至小鼠进行皮下注射，注射总量200μl。

一周后ELISA法测效价，如效价达不到融合要求，则每14天按二次免疫方法免疫一次，并于一周后测效价。最后一次加强免疫3天后，摘眼球放血处死，血液贮存备用。无菌取脾脏，培养液洗一次。以无菌5ml注射器内芯研磨，过不锈钢滤网，收集细胞补充不完全1640培养液至40ml，1000g条件下离心5min。用2mL 1M氯化铵溶液裂解红细胞后补充不完全1640培养液至40ml，1000g条件下离心5min。取对数生长期骨髓瘤细胞，补充不完全1640培养液至40ml，1000g条件下离心5min。以1：10或1：5混合骨髓瘤细胞与免疫脾细胞，补充不完全1640培养液至40ml，1000g条件下离心5min清洗一次。倾出上清液，吸净残留液体，轻弹管壁，使细胞疏松呈糊状。置含混合细胞的离心管于37℃水浴，吸取37℃预温的PEG0.8ml，缓慢滴入管内，边加边旋转，60s内滴完后37℃静置1.5min。5min内加入37℃预温的不完全培养基5ml，静置5min，补充不完全培养基至30mL，800g条件下离心6min。弃上清后，缓慢加入完全培养液50m1，分到1-2个250ml培养瓶中，培养12-24h。

饲养细胞的准备：取BALB/C小鼠，拉颈处死，浸泡在75％酒精内3～5min。用无菌剪刀剪开皮肤暴露腹膜，更换剪刀剪开腹膜，注入5～10ml的培养液，反复冲洗，吸出冲洗液配制为2×10⁵/ml细胞悬液。将融合细胞与饲养细胞混合，同时加入50×HAT 2m1/100ml培养物、0.2m1/100ml培养物的HAT培养液分细胞于4×96孔培养板100μl/孔，置细胞培养箱培养，未加融合细胞的孔为阴性对照，5天时补充100μl HAT培养液/孔。至克隆出现铺满1/4孔底时，不需换液，开始检测抗体分泌。抗体分泌阳性的克隆转种入24孔板，进一步转种入培养瓶中扩大培养，冻存部分克隆细胞。制备饲养细胞层100μl/孔(2×10⁴/孔)，吸管吹打培养板中的克隆，悬浮于完全培养液，调整细胞浓度至100、50、10/ml，分别加入三种密度的细胞悬液于含饲养细胞的培养板中，100μl/孔，使每孔分别含有10、5、1个细胞。在培养箱中培养10～14天，取上清检测，阳性孔再进行克隆化培养至100％克隆分泌特异性抗体为止，大量培养，冻存。接种杂交瘤细胞1～2周前，小鼠腹腔注射0.5ml液体石蜡(经该处理后的小鼠可保持1～2个月)，重悬细胞于无血清培养液，制成1×10⁶～2×10⁶/ml悬液，每只小鼠注射0.5m。收集腹水用Protein A抗体亲和纯化介质(GE healthcare，17-1279-01)纯化，即得到用于偶联的特异性单克隆抗体。经BCA法检测，收集的人IgG浓度为3.4mg/mL。用SDS-PAGE电泳法测定其分子量重链约为50千道尔顿，轻链约为20千道尔顿，如图2所示。

实施例3

本实施例提供了实施例2得到的鼠抗人IgG单克隆抗体与微球偶联的方法，包括以下步骤：

本实施例选择粒径为6μm、密度为1.05g/cm³的聚苯乙烯红色微球，向40μL质量体积比(g/ml)为2.67％的微球悬液中依次加入840μLpH为6.0的MES、80μL浓度为50mg/mL的NHS、4μL浓度为50mg/mL的EDC，混匀后于室温条件下静置15分钟，得到组分C，该步骤可以使微球表面的羧酸基基团活化带上NHS酯。组分C在10000g、4℃条件下，离心5min后，弃上清，得到组分D。将组分D用1mL PBS重悬，水浴超声3min得到组分E。往组分E中加入60μL实施例2得到的单克隆抗人IgG抗体，混匀，室温轻柔震荡4h后获得组分F，该步骤为偶联步骤。往组分F中加入10μL质量体积比(g/ml)为10％的BSA后室温轻柔震荡过夜后获得组分G，该步骤封闭微球上多余的位点。组分G在10000g、4℃条件下离心5min后，弃上清，加入1mL洗液(PBS、0.1％BSA)洗涤后，再于10000g、4℃条件下离心5min，弃上清，得到组分H，组分H即为均匀包被了单克隆抗人IgG抗体的聚苯乙烯红色微球。

实施例4

本实施例提供了一种包含复合稳定剂的检测信号制剂，组成如表1所示。

表1实施例4中检测信号制剂组成表

其中的百分比均为质量体积百分比，单位为g/ml。

实施例5

本实施例提供了采用实施例4提供的检测信号制剂对抗血小板抗体进行检测的方法，包括以下步骤：

(1)制备混合血小板制剂：取三个不同O型个体的已知抗体阴性的富血小板血浆(枸橼酸钠抗凝全血经200g、10min离心获得)按等体积混合作为检测的血小板试剂，本实施例用到的O型抗凝全血来源于吉林大学第一医院。

(2)取出微孔板条。

(3)按10×PBST洗液与纯水的体积比为1:9的比例稀释10×PBST洗液为1×PBST洗液。

(4)用移液器在阳性质控孔，阴性质控孔中加入1滴(50μL)步骤(1)得到的混合血小板试剂。

(5)在50g条件下离心5min，使血小板固定到微孔板表面。

(6)用150μL的1×PBST洗液手工洗板三次，去除未结合的血小板，每次清洗后，慢慢倾倒并将板轻扣到吸水纸上以去掉残留的1×PBST。

(7)每个孔中加入2滴(100μL)LISS。

(8)在适当的孔中加入1滴(50μL)阳性或阴性质控。

(9)将微孔板在37℃孵育30分钟(孵育过程中密封微孔板)。

(10)按步骤(6)方法，用150μL的1×PBST洗液手工洗板5次。

(11)步骤(10)清洗后立即向微孔板各孔中加入1滴(50μL)实施例4提供的检测信号制剂。

(12)将微孔板在200g条件下离心5min后肉眼观察结果，结果如图3所示，两次重复结果表明，实施例4提供的检测信号制剂中的聚苯乙烯红色微球表现出良好的聚集性，边界清晰，未发生弥散，结果明确。

实施例6

本实施例提供了一种检测信号制剂对抗血小板抗体进行检测的方法，所述检测信号制剂的组分与实施例4提供的检测信号制剂的组分区别仅在于不含有BSA，对抗血小板抗体进行检测的方法与实施例5的区别仅在于步骤(12)的离心条件为2250g，离心时间为30min。检测结果如图4所示，本实施例与实施例5相比，检测信号制剂中缺少BSA，但离心条件从200g提高到了2250g，离心时间从5min延长至30min，两次重复结果也都显示出了清晰的边界，证明该检测信号制剂与检测方法的组合能够用于阴性样品的检测。

实施例7

本实施例直接在实施例3提供的聚苯乙烯红色微球的基础上添加质量体积百分比(g/ml)为0.5％的BSA，而后采用实施例5的检测方法对抗体阴性样品进行检测。

实施例8

本实施例采用实施例4提供的检测信号制剂，对来源于吉林大学第一医院的14份临床血液样本按照实施例5提供的检测方法进行抗血小板抗体检测。

实施例9～12

本组实施例各自提供了一种检测信号制剂，与实施例4提供的检测信号制剂的区别仅在于，实施例9～12提供的检测信号制剂的聚苯乙烯红色微球中聚苯乙烯红色微球与包被的单克隆抗人IgG抗体的质量比分别为1：1、4：1、7：1和10：1。

实施例13～16

本组实施例各自提供了一种检测信号制剂，与实施例4提供的检测信号制剂的区别仅在于，实施例13～16提供的检测信号制剂的聚苯乙烯红色微球在进行表面羧酸基团活化处理时，肉眼可辨颜色的微球或微粒悬液、脂肪酸甲酯磺酸盐、N-羟基丁二酰亚胺溶液和碳二亚胺溶液的体积比分别为1：15：1：0.1、1：19：2：0.2、1：27：4：0.4和1：30：5：0.5。

实施例17～21

本组实施例各自提供了一种检测信号制剂，与实施例4提供的检测信号制剂的区别仅在于，实施例17～21提供的检测信号制剂选用的为聚苯乙烯红色微粒，其粒径分别为10nm、70nm、200nm、3μm和10μm。

实施例22～24

本组实施例各自提供了一种检测信号制剂，与实施例4提供的检测信号制剂的区别仅在于，实施例22～24提供的检测信号制剂中聚苯乙烯红色微球的密度分别为1g/cm³、1.15g/cm³和1.2g/cm³。

实施例25～28

本组实施例各自提供了一种检测信号制剂，与实施例4提供的检测信号制剂的区别仅在于，实施例25～28提供的检测信号制剂中Tween20的质量体积比分别为0.2g：100ml、0.3g：100ml、0.4g：100ml和0.5g：100ml。

实施例29～32

本组实施例各自提供了一种检测信号制剂，与实施例4提供的检测信号制剂的区别仅在于，实施例29～32提供的检测信号制剂中BSA的质量体积比分别为0.2g：100ml、0.3g：100ml、0.4g：100ml和0.5g：100ml。

实施例33～36

本组实施例各自提供了一种检测信号制剂，与实施例4提供的检测信号制剂的区别仅在于，实施例33～36提供的检测信号制剂中蔗糖的质量体积比分别为0.5g：100ml、1.5g：100ml、3.5g：100ml和5g：100ml。

实施例37～40

本组实施例各自提供了一种检测信号制剂，与实施例4提供的检测信号制剂的区别仅在于，实施例37～40提供的检测信号制剂中ProClin300的质量体积比分别为0.02g：100ml、0.06g：100ml、0.08g：100ml和0.1g：100ml。

实施例41～44

本组实施例各自提供了一种检测信号制剂，与实施例4提供的检测信号制剂的区别仅在于，实施例41～44提供的检测信号制剂中聚苯乙烯红色微粒的质量体积比分别为0.05g：100ml、0.2g：100ml、0.3g：100ml和0.4g：100ml。

对比例1

本对比例直接采用实施例3获得的均匀包被了单克隆抗人IgG抗体的聚苯乙烯红色微球，按照实施例5提供的方法对抗血小板抗体进行检测的方法，检测结果如图5所示，图中B1为阴性质控检测结果，B2为阳性质控检测结果，A1为本对比例直接采用实施例3获得的均匀包被了单克隆抗人IgG抗体的聚苯乙烯红色微球对阴性样品的检测结果，A2为本对比例直接采用实施例3获得的均匀包被了单克隆抗人IgG抗体的聚苯乙烯红色微球对阳性样品的检测结果，由图中可以看出，直接采用实施例3获得的均匀包被了单克隆抗人IgG抗体的聚苯乙烯红色微球对阴性样品进行检测时，结果出现了假阳性。

对比例2和3

本对比例2和3与实施例7的检测方法相同，区别仅在于BSA的质量体积百分比(g/ml)分别为0.05％和0.2％，实施例7、对比例2和3的检测结果如图6所示，由对比例1可知，直接采用实施例3提供的聚苯乙烯红色微球对阴性样品进行检测时，会表现出假阳性，在对比例1的基础上，添加不同浓度的BSA，由图6可以看出，随着BSA浓度的增加，对比例1原本表现假阳性的结果逐渐转为阴性结果，直到BSA浓度添加至质量体积百分比(g/ml)为0.5％(即实施例7所用浓度)时，阴性检测结果的边界才清晰完整，证明了BSA的加入能够减少聚苯乙烯红色微球的非特异性吸附，使得阴性样品的假阳性结果消失。

对比例4和5

对比例4和5直接采用实施例3获得的均匀包被了单克隆抗人IgG抗体的聚苯乙烯红色微球，按照实施例5提供的方法对抗血小板抗体进行检测的方法，与实施例5的区别在于，步骤(12)的离心条件不同，分别为：对比例4在2300g条件下离心5min，对比例5在2250g条件下离心30min，检测结果如图7所示，如上实施例6证明了，提高离心转速和延长离心时间能够保证阴性样品检测准确率，但是图7给出的结果显示，直接采用实施例3提供的聚苯乙烯红色微球进行检测，尽管提高了离心转速和延长了离心时间，聚苯乙烯红色微球仍然表现出显著的弥散，结果不准确，与其他实施例相比，证明了仅仅提高离心条件无法避免假阳性结果的出现，添加吐温或BSA具有明显的必要性。

对比例6

本对比例使用MASPAT kit试剂盒对实施例8中来源于吉林大学第一医院的14份临床血液样本进行抗血小板抗体，图8给出了实施例8和本对比例检测结果的对比情况，其中NC为阴性质控结果，PC为阳性质控结果，由图中可以看出：实施例8给出的检测信号制剂能够取得与现有商用的MASPAT kit试剂盒相同的检测结果，证明采用聚苯乙烯红色微球替代指示红细胞的方案可行，能够满足实际检测需求。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种抗血小板抗体检测信号制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括，取均匀包被了单克隆抗人IgG抗体的肉眼可辨颜色的微球或微粒和复合稳定剂，用PBS溶液均匀溶解得到检测信号制剂。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述均匀包被了单克隆抗人IgG抗体的肉眼可辨颜色的微球或微粒的制备方法包括，肉眼可辨颜色的微球或微粒表面羧酸基团活化处理后与单克隆抗人IgG抗体的Fc段偶联，而后封闭肉眼可辨颜色的微球或微粒表面多余活化羧酸基团位点，再经过至少两步离心得到包被了单克隆抗人IgG抗体的肉眼可辨颜色的微球或微粒。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒与单克隆抗人IgG抗体的质量比为1～10：1，优选为5.2：1。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒表面羧酸基团活化处理的方法包括，向肉眼可辨颜色的微球或微粒悬液中依次加入脂肪酸甲酯磺酸盐、N-羟基丁二酰亚胺溶液和碳二亚胺溶液，反应结束后离心得到表面羧酸基团活化后的肉眼可辨颜色的微球或微粒。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒悬液中含有的肉眼可辨颜色的微球或微粒的质量体积比为(1～5)g：100ml，所述N-羟基丁二酰亚胺溶液浓度为30～80g/L，所述碳二亚胺溶液浓度为30～80g/L，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒悬液、脂肪酸甲酯磺酸盐、N-羟基丁二酰亚胺溶液和碳二亚胺溶液的体积比为1：(15～30)：(1～5)：(0.1～0.5)；

优选地，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒悬液中含有的肉眼可辨颜色的微球或微粒的质量体积比为2.67g：100ml，所述N-羟基丁二酰亚胺溶液浓度为50g/L，所述碳二亚胺溶液浓度为50g/L，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒悬液、脂肪酸甲酯磺酸盐、N-羟基丁二酰亚胺和碳二亚胺的体积比为1:21:2:0.1。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒的制备材料包括聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或氧化硅中的至少一种；

优选地，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒的粒径为10nm～10μm，优选为6μm；

优选地，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒的密度为1～1.2g/cm³，优选为1.05g/cm³；

优选地，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒为粒径为6μm、密度为1.05g/cm³的聚苯乙烯红色微球。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述复合稳定剂包括非离子型去污剂或表面活性剂、惰性蛋白、渗透性保护剂或防腐剂中的至少一种；

优选地，所述非离子型去污剂或表面活性剂包括多元醇类表面活性剂；

优选地，所述非离子型去污剂或表面活性剂在检测信号制剂中的质量体积比为(0.1～0.5)g：100ml，优选为0.1g：100ml；

优选地，所述非离子型去污剂或表面活性剂为Tween20；

优选地，所述惰性蛋白在检测信号制剂的质量体积比为(0.1～0.5)g：100ml，优选为0.1g：100ml；

优选地，所述惰性蛋白包括牛血清蛋白或酪蛋白，进一步优选为牛血清蛋白；

优选地，所述牛血清蛋白在检测信号制剂的质量体积比为0.1g：100ml；

优选地，所述渗透性保护剂包括氨基酸、四分子胺化合物、多羟基化合物或多糖化合物中的至少一种；

优选地，所述渗透性保护剂在检测信号制剂的质量体积比为(0.5～5)g：100ml，优选为1g：100ml；

优选地，所述渗透性保护剂为蔗糖；

优选地，所述防腐剂在检测信号制剂的质量体积比为(0.02～0.1)g：100ml，优选为0.03g：100ml；

优选地，所述防腐剂为ProClin300。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述均匀包被了单克隆抗人IgG抗体的肉眼可辨颜色的微球或微粒在检测信号制剂中的质量体积比为0.05～0.4g：100ml，优选为0.125g：100ml。

9.采用权利要求1～8任一项所述制备方法得到的检测信号制剂。

10.采用权利要求1～8任一项所述制备方法得到的检测信号制剂或权利要求9所述检测信号制剂在制备抗血小板抗体检测产品中的应用；

优选地，所述抗血小板抗体检测产品包括抗血小板抗体检测试剂盒。

Images