JP2017009571A - マイコプラズマ・ニューモニエ検出用免疫クロマト分析装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む、マイコプラズマ・ニューモニエ(Mycoplasma pneumoniae)を検出するための免疫クロマト分析装置であって、
前記標識物質保持部及び検出部が、配列番号2のアミノ酸配列からなるマイコプラズマ・ニューモニエのP30タンパク質のドメインIIIを強く認識する抗体を含有する、免疫クロマト分析装置。
【選択図】図1
Description
また、特許文献2には、マイコプラズマ・ニューモニエのリボソームタンパク質Ribosomal Protein L7/L12に特異的な抗体を用いた免疫クロマト分析装置が開示されている。
また、マイコプラズマ・ニューモニエのP30タンパク質の特定の部位に結合する抗体を用いた免疫クロマト分析装置によれば、迅速かつ簡易にマイコプラズマ・ニューモニエ感染を高感度で検出できることを見出し、本発明に至った。
1.試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む、マイコプラズマ・ニューモニエ(Mycoplasma pneumoniae)を検出するための免疫クロマト分析装置であって、
前記標識物質保持部及び検出部が、配列番号2のアミノ酸配列からなるマイコプラズマ・ニューモニエのP30タンパク質のドメインIIIを強く認識する抗体を含有する、免疫クロマト分析装置。
2.前記抗体が、前記ドメインIIIのうち配列番号3のアミノ酸配列を認識する、前記1に記載の免疫クロマト分析装置。
3.前記標識物質保持部が含有する標識物質が金コロイド粒子であり、前記標識物質保持部が前記金コロイド粒子を、0.25〜0.7μg/cm2含有する、前記1または2に記載の免疫クロマト分析装置。
4.前記1〜3のいずれか1に記載の免疫クロマト分析装置と、検体を希釈して展開するための検体希釈液とを含む、免疫クロマト分析キット。
5.前記検体希釈液が少なくとも1種の非イオン性界面活性剤を含有する、前記4に記載の免疫クロマト分析キット。
6.前記検体希釈液が含有する非イオン性界面活性剤の50%以上が、HLB値が13〜18の非イオン性界面活性剤である、前記5に記載の免疫クロマト分析キット。
7.試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置を用いて、検体中のマイコプラズマ・ニューモニエを検出する方法であって、以下の工程(1)〜(4)を含む免疫クロマト分析方法。
(1)検体希釈液により検体を希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
(2)標識物質保持部に保持されている、配列番号2のアミノ酸配列からなるマイコプラズマ・ニューモニエのP30タンパク質のドメインIIIを強く認識する抗体(以下、抗体P30(A)と表記する)によりマイコプラズマ・ニューモニエを認識させる工程
(3)前記検体及び抗体P30(A)を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
(4)展開された移動相中のマイコプラズマ・ニューモニエを検出部に含まれる抗体P30(A)により検出する工程
マイコプラズマ・ニューモニエのP30タンパク質とは、配列番号1に示される274のアミノ酸からなり、プロリンに富み(20.7%)、分子量29,743の接着タンパク質である。
本発明に使用する抗体P30(A)は、好ましくは、上記ドメインIIIのアミノ酸の繰り返し配列のうち、少なくとも配列番号3(PGMAPR)のアミノ酸配列を認識するものであることが好ましい。下記実施例の結果にも示されているように、上記配列を認識する抗体は、より強くマイコプラズマ・ニューモニエのP30タンパク質のドメインIIIを認識するため、高感度にマイコプラズマ・ニューモニエを検出できる。
Tween20 in PBS)にて3回ウォッシュする。ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除く。
マイクロプレートリーダー(BIORAD社製)で450nmの吸光度を測定する。
ウェルに発色基質として、Sure Blue Reserve TMB Microwell Peroxidase Substrate(1−Component)(KPL社製、コード53−00−01)を100μL加え、15分反応させ、2N硫酸を100μL加えて反応を停止させる。
マイクロプレートリーダー(BIORAD社製)で450nmの吸光度を測定する。
(1)検体希釈液により検体を希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
(2)標識物質保持部に保持されている、配列番号2のアミノ酸配列からなるマイコプラズマ・ニューモニエのP30タンパク質のドメインIIIを強く認識する抗体(以下、抗体P30(A)と表記する)によりマイコプラズマ・ニューモニエを認識させる工程
(3)前記検体及び抗体P30(A)を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
(4)展開された移動相中のマイコプラズマ・ニューモニエを検出部に含まれる抗体P30(A)により検出する工程
各工程について以下に説明する。
工程(1)では、第1に、検体を、測定精度を低下させることなく、免疫クロマトグラフ媒体中をスムーズに移動する程度の濃度に、検体希釈液で調整または希釈して検体含有液とするのが好ましい。検体希釈液は上述したものを使用できる。第2に、検体含有液を試料添加部(1)上に、所定量(通常、0.1〜2ml)滴下する。検体含有液が滴下されると、検体含有液は試料添加部(1)中で移動を開始する。
工程(2)は、工程(1)において試料添加部に添加された検体含有液を、標識物質保持部(2)へと移動させ、標識物質保持部に保持されている標識物質が結合した抗体P30(A)により検体中の被検出物質であるマイコプラズマ・ニューモニエにおける、P30タンパク質のドメインIIIを認識させる工程である。
工程(3)は、工程(2)において被検出物質であるマイコプラズマ・ニューモニエが標識物質保持部において標識物質が結合した抗体P30(A)(第1抗体)に認識された後、検体および抗体P30(A)(第1抗体)を、クロマトグラフ媒体部上を移動相として通過させる工程である。
工程(4)は、クロマトグラフ媒体部上を移動相として通過した検体中のマイコプラズマ・ニューモニエが、抗原・抗体の特異的結合反応により、検出部に保持、即ち、固定されている抗体P30(A)(第2抗体)と、前記工程(2)において標識物質が結合した抗体P30(A)(第1抗体)とによってサンドイッチ状に挟まれるように特異的に反応結合して、検出部が着色する工程である。
本試験では、マイコプラズマ・ニューモニエのP30タンパク質のドメインIIIを認識する種類の異なる2つの抗体を用意し、それぞれ抗体がP30タンパク質のドメインIIIのどの部位を認識するかを調べた。使用した抗体は、Fucal Research社、商品名:Mp−P30−3−AB(以下、抗体P30(A)と表記する)と、Fucal Research社、商品名:Mp−P30−9−AB(以下、抗体P30(B)と表記する)の2種類である。この抗体P30(A)および抗体P30(B)が、マイコプラズマ・ニューモニエのP30タンパク質のドメインIIIのどの箇所に結合するのかを、下記の免疫クロマト分析法により検証した。
まず、上記ドメインIIIにおける3種類のアミノ酸の繰り返し配列(配列番号3〜5)のいずれかを含むような以下の2種類のペプチドをペプチドの化学合成法の常法であるペプチド固相合成法により作製した。
ペプチド1:PGMAPRPGMPPHPGMAPR(配列番号6)
ペプチド2:PGMAPRPGFPPQPGMAPR(配列番号7)
(1)試料添加部の作製
試料添加部としてグラスファイバーからなる不織布(ミリポア社製:300mm×30mm)を用いた。
(2)標識物質保持部の作製
金コロイド懸濁液(田中貴金属工業社製:LC40nm)0.5mlに、リン酸緩衝液(pH7.4)で0.05mg/mlの濃度になるように希釈した抗体P30(A)(Fucal Research社、商品名:Mp−P30−3−AB)を0.1ml加え、室温で10分間静置した。
次いで、1質量%の牛血清アルブミン(BSA)を含むリン酸緩衝液(pH7.4)を0.1ml加え、更に室温で10分間静置した。その後、十分撹拌した後、8000×gで15分間遠心分離を行い、上清を除去した後、1質量%のBSAを含むリン酸緩衝液(pH7.4)を0.1ml加えた。以上の手順で標識物質溶液を作製した。
上記作製した標識物質溶液300μLに300μLの10質量%トレハロース水溶液と1.8mLの蒸留水を加えたものを12mm×300mmのグラスファイバーパッド(ミリポア社製)に均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、標識物質保持部を作製した。
メンブレンとしてニトロセルロースからなるシート(ミリポア社製、商品名:HF120、300mm×25mm)を用いた。
次に、5質量%のイソプロピルアルコールを含むリン酸緩衝液(pH7.4)で1.0mg/mlの濃度になるように、上記抗体P30(A)を希釈した溶液150μLを、乾燥されたメンブレン上の検出部位(検出ライン)に1mmの幅でイムノクロマト用ディスペンサー「XYZ3050」(BIODOT社製)を用いて1μL/mmの量(1シートあたり25μL)でライン状に塗布した。
また、金ナノ粒子標識試薬の展開の有無や展開速度を確認するために検出部位の下流に、金ナノ粒子標識物質と広く親和性を有するヤギ由来抗血清をリン酸緩衝液(pH7.4)で希釈した液をコントロール部位(コントロールライン)に塗布した。その後、50℃で30分間乾燥させ、室温で一晩乾燥させ、クロマトグラフ媒体部および検出部を作製した。
(4)免疫クロマト分析装置の作製
次に、バッキングシートから成る基材に、試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収部としてグラスファイバー製の不織布を順次貼り合わせた。そして、裁断機で幅が5mmとなるように裁断し、免疫クロマト分析装置とした。なお、標識物質保持部の試料展開方向の長さを12mmとした。
1質量%の非イオン性界面活性剤ナカライテスク社製NP−40(商品名:ノニデットP−40、HLB値17.7)、日油社製商品名ノニデットMN−811(HLB値 9.3)の1:1混合物を含む50mMのHEPES緩衝液(pH7.5)、を調製し、検体を希釈処理するための検体希釈液とした。
(6)測定
マイコプラズマ・ニューモニエ、及びペプチド1またはペプチド2を含有する検体試料を使用して、上記作製した免疫クロマト分析装置を用いた場合の、検出部における発色強度を測定した。マイコプラズマ・ニューモニエを含有する検体試料には、Mycoplasma pneumonia P30((アミノ酸96−274)を、大腸菌を利用した常法で発現、精製したタンパク質P30Ag)を使用した。このP30Agを上記抽出液で目的濃度10pg/mLに調整し、さらにペプチド1またはペプチド2が400ng展開されるように、ペプチド1またはペプチド2を調製し、検体試料とした。
上記の検体試料150μLを免疫クロマト分析装置の試料添加部上に載せて展開させ、検出部の着色の度合い(発色強度)をデンシトメーターにより測定した(表中の単位はmAbs)。
ペプチド1で阻害されペプチド2で阻害されない場合:抗体は、配列番号4に示すアミノ酸配列(PGMPPH)に結合する。
ペプチド1で阻害されずペプチド2で阻害される場合:抗体は、配列番号5に示すアミノ酸配列(PGFPPQ)に結合する。
ペプチド1で阻害されペプチド2でも阻害される場合:抗体は、配列番号3に示すアミノ酸配列(PGMAPR)に結合する。
また、抗体P30(A)を抗体P30(B)に変更して同様の試験を行った結果を表2に示す。
本試験では、下記試験例3で作製する本願発明の免疫クロマト装置に使用する、マイコプラズマ・ニューモニエのP30タンパク質のドメインIIIを認識する抗体(抗体P30(A))が、該ドメインIIIを「強く」認識する抗体であるかを確認するため、段落[0017]〜[0022]に記載のELISA法による試験及び段落[0024]〜[0029]に記載の競合阻害ELISA試験を行った。
PBS)にて3回ウォッシュした。
二次抗体として、Anti Mouse IgG(H+L),Rabbit,IgG Whole,Peroxidase Cojugated(和光純薬社製、コード014−17611)1mg/mLを100μL、ウェルに加え、37℃1.5時間インキュベートした。その後BSA溶液を取り除き、ウェルを300μL PBST(0.05% Tween20 in PBS)にて3回ウォッシュし、ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。
ウェルに発色基質としてSure Blue Reserve TMB Microwell Peroxidase Substrate(1−Component)(KPL社製、コード53−00−01)を100μL加え、15分反応させ、2N硫酸を100μL加えて反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー(BIORAD社製)で450nmの吸光度を測定した。
ウェルに発色基質として、Sure Blue Reserve TMB Microwell Peroxidase Substrate(1−Component)(KPL社製、コード53−00−01)を100μL加え、15分反応させ、2N硫酸を100μL加えて反応を停止させた。
マイクロプレートリーダー(BIORAD社製)で450nmの吸光度を測定した。
<本願発明の免疫クロマト分析装置の作製>
[実施例1]
(1)試料添加部の作製
試料添加部としてグラスファイバーからなる不織布(ミリポア社製:300mm×30mm)を用いた。
金コロイド懸濁液(田中貴金属工業社製:LC40nm)0.5mlに、リン酸緩衝液(pH7.4)で0.05mg/mlの濃度になるように希釈した抗体P30(A)(Fucal Research社、商品名:Mp−P30−3−AB)を0.1ml加え、室温で10分間静置した。
上記作製した標識物質溶液300μLに300μLの10質量%トレハロース水溶液と1.8mLの蒸留水を加えたものを12mm×300mmのグラスファイバーパッド(ミリポア社製)に均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、標識物質保持部を作製した。
メンブレンとしてニトロセルロースからなるシート(ミリポア社製、商品名:HF120、300mm×25mm)を用いた。
次に、5質量%のイソプロピルアルコールを含むリン酸緩衝液(pH7.4)で1.0mg/mlの濃度になるように、上記抗体P30(A)を希釈した溶液150μLを、乾燥されたメンブレン上の検出部位(検出ライン)に1mmの幅でイムノクロマト用ディスペンサー「XYZ3050」(BIODOT社製)を用いて1μL/mmの量(1シートあたり25μL)でライン状に塗布した。
また、金ナノ粒子標識試薬の展開の有無や展開速度を確認するために検出部位の下流に、金ナノ粒子標識物質と広く親和性を有するヤギ由来抗血清をリン酸緩衝液(pH7.4)で希釈した液をコントロール部位(コントロールライン)に塗布した。その後、50℃で30分間乾燥させ、室温で一晩乾燥させ、クロマトグラフ媒体部および検出部を作製した。
次に、バッキングシートから成る基材に、試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収部としてグラスファイバー製の不織布を順次貼り合わせた。そして、裁断機で幅が5mmとなるように裁断し、免疫クロマト分析装置とした。なお、標識物質保持部の試料展開方向の長さを12mmとした。
1質量%の非イオン性界面活性剤ナカライテスク社製NP−40(商品名:ノニデットP−40、HLB値17.7)、日油社製商品名ノニデットMN−811(HLB値 9.3)の1:1混合物を含む50mMのHEPES緩衝液(pH7.5)、を調製し、検体を希釈処理するための検体希釈液とした。
マイコプラズマ・ニューモニエを含有する検体試料を使用して、上記作製した免疫クロマト分析装置を用いた場合の、検出部における発色強度を測定した。マイコプラズマ・ニューモニエを含有する検体試料には、市販の不活化マイコプラズマ・ニューモニエ(Meridian社製、商品名Mycoplasma pneumoniae Antigen(FH))、または肺炎マイコプラズマ感染者の咽頭拭い液を用いた。咽頭拭い液は、市販の綿棒を用いて咽頭を拭うことで被験者2名の肺炎マイコプラズマ感染者からそれぞれ採取した。
市販の不活化マイコプラズマ・ニューモニエは、上記抽出液で目的濃度に調整し、検体試料とした(表3中、市販検体と記載)。
また、採取した咽頭拭い液は、上記検体希釈液で20倍に希釈し、検体試料とした(表3中、被験者1及び被験者2と記載)。
検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体P30(A)を、試験例1で使用した抗体P30(B)(Fucal Research社、商品名:Mp−P30−9−AB)に変更したこと以外は、実施例1を繰り返した。結果を表3及び図2に示す。
なお、この抗体P30(B)が、「マイコプラズマ・ニューモニエのP30タンパク質のドメインIIIを強く認識する」か否か確認するため、段落[0017]〜[0022]に記載のELISA法による試験及び段落[0024]〜[0029]に記載の競合阻害ELISA試験を行った。
まず、抗体P30(B)がマイコプラズマ・ニューモニエのP30タンパク質のドメインIIIを強く認識する抗体であるか否か確認するため、段落[0017]〜[0022]に記載のプロトコールに従ってELISA法による試験を行った。具体的には、抗体P30(B)が、ブランクを引いた450nmの吸光度が0.2Abs以上となる抗体であるか否か、以下のように実験した。
in PBS)にて3回ウォッシュし、ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。
二次抗体として、Anti Mouse IgG(H+L),Rabbit,IgG Whole,Peroxidase Cojugated(和光純薬社製、コード014−17611)1mg/mLを100μL、ウェルに加え、37℃1.5時間インキュベートした。その後BSA溶液を取り除き、ウェルを300μL PBST(0.05% Tween20 in PBS)にて3回ウォッシュし、ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。
ウェルに発色基質としてSure Blue Reserve TMB Microwell Peroxidase Substrate(1−Component)(KPL社製、コード53−00−01)を100μL加え、15分反応させ、2N硫酸を100μL加えて反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー(BIORAD社製)で450nmの吸光度を測定した。
ウェルに発色基質として、Sure Blue Reserve TMB Microwell Peroxidase Substrate(1−Component)(KPL社製、コード53−00−01)を100μL加え、15分反応させ、2N硫酸を100μL加えて反応を停止させた。
マイクロプレートリーダー(BIORAD社製)で450nmの吸光度を測定した。
標識物質保持部に添加した標識物質溶液中の抗体P30(A)及び検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体P30(A)の両方を、上記抗体P30(B)に変更したこと以外は、実施例1を繰り返した。結果を表3及び図2に示す。
検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体P30(A)を、マイコプラズマ・ニューモニエのP1タンパク質に対する抗体(Meridian社製、商品名MAb to Mycoplasma pneumonia P1(clone B1947M):以下、抗体P1(B)と表記する)に変更したこと以外は、実施例1を繰り返した。結果を表3及び図2に示す。
標識物質保持部に添加した標識物質溶液中の抗体P30(A)を、マイコプラズマ・ニューモニエのP1タンパク質に対する抗体(Meridian社製、商品名MAb to
Mycoplasma pneumonia P1(clone B1948M):以下、抗体P1(A)と表記する)に変更したこと以外は、実施例1を繰り返した。結果を表3及び図2に示す。
標識物質保持部に添加した標識物質溶液中の抗体P30(A)を、抗体P1(A)に、検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体P30(A)を、抗体P1(B)に変更したこと以外は、実施例1を繰り返した。結果を表3及び図2に示す。
検体希釈液の組成を、Triton X−100(和光純薬社製、商品名、ポリエチレングリコールモノ−p−イソオクチルフェニルエーテル、HLB値:13.7)、Tween20(和光純薬社製、商品名、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、HLB値:16.7)に変更したこと以外は、実施例1を繰り返した。結果を表4及び図3に示す。
[比較例6]
検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体P30(A)を、抗体P30(B)に変更したこと以外は、実施例2を繰り返した。結果を表4及び図3に示す。
標識物質保持部に添加した標識物質溶液中の抗体P30(A)及び検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体P30(A)の両方を、抗体P30(B)に変更したこと以外は、実施例1を繰り返した。結果を表4及び図3に示す。
検出検体を、P30タンパク質((アミノ酸96−274)を、大腸菌を利用した常法で発現、精製したタンパク質P30Ag)に変更し、検体希釈液の組成を、Triton
X−100(和光純薬社製、商品名、ポリエチレングリコールモノ−p−イソオクチルフェニルエーテル、HLB値:13.7)、Tween20(和光純薬社製、商品名、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、HLB値:16.7)1:1混合物に変更したこと以外は、実施例1を繰り返した。結果を表5及び図4に示す。
[比較例8]
検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体P30(A)を、抗体P30(B)に変更したこと以外は、実施例3を繰り返した。結果を表5及び図4に示す。
標識物質保持部に添加した標識物質溶液中の抗体P30(A)及び検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体P30(A)の両方を、抗体P30(B)に変更したこと以外は、実施例3を繰り返した。結果を表5及び図4に示す。
検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体P30(A)を、抗体P1(B)に変更したこと以外は、実施例3を繰り返した。結果を表5及び図4に示す。
標識物質保持部に添加した標識物質溶液中の抗体P30(A)を、抗体P1(A)に変更したこと以外は、実施例3を繰り返した。結果を表5及び図4に示す。
標識物質保持部に添加した標識物質溶液中の抗体P30(A)を、抗体P1(A)に、検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体P30(A)を、抗体P1(B)に変更したこと以外は、実施例3を繰り返した。結果を表5及び図4に示す。
試験例2における抗体P30(A)および比較例1における抗体P30(B)が、「マイコプラズマ・ニューモニエのP30タンパク質のドメインIIIを強く認識する」抗体であるか確認するため、競合阻害ELISA試験(間接競合法)を行った。本試験では、競合させるドメインIIIの断片として、試験例1で使用した上記ペプチド1またはペプチド2のいずれかを使用し、さらに上記ペプチドの濃度を下記表6、7のように変更して(×1〜×640)、試験例2または比較例1に記載の方法と同様にして競合阻害ELISA試験(間接競合法)を行った。結果を表6、7に示す。表6は、抗体として抗体P30(A)を使用した結果であり、表7は、抗体として抗体P30(B)を使用した結果である。また表6の結果を図5、表7の結果を図6に示す。
2 標識物質保持部
3 クロマトグラフ媒体部
4 検出部
5 吸収部
6 バッキングシート
Claims (7)
- 試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む、マイコプラズマ・ニューモニエ(Mycoplasma pneumoniae)を検出するための免疫クロマト分析装置であって、
前記標識物質保持部及び検出部が、配列番号2のアミノ酸配列からなるマイコプラズマ・ニューモニエのP30タンパク質のドメインIIIを強く認識する抗体を含有する、免疫クロマト分析装置。 - 前記抗体が、前記ドメインIIIのうち配列番号3のアミノ酸配列を認識する、請求項1に記載の免疫クロマト分析装置。
- 前記標識物質保持部が含有する標識物質が金コロイド粒子であり、前記標識物質保持部が前記金コロイド粒子を、0.25〜0.7μg/cm2含有する、請求項1または2に記載の免疫クロマト分析装置。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の免疫クロマト分析装置と、検体を希釈して展開するための検体希釈液とを含む、免疫クロマト分析キット。
- 前記検体希釈液が少なくとも1種の非イオン性界面活性剤を含有する、請求項4に記載の免疫クロマト分析キット。
- 前記検体希釈液が含有する非イオン性界面活性剤の50%以上が、HLB値が13〜18の非イオン性界面活性剤である、請求項5に記載の免疫クロマト分析キット。
- 試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置を用いて、検体中のマイコプラズマ・ニューモニエを検出する方法であって、以下の工程(1)〜(4)を含む免疫クロマト分析方法。
(1)検体希釈液により検体を希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
(2)標識物質保持部に保持されている、配列番号2のアミノ酸配列からなるマイコプラズマ・ニューモニエのP30タンパク質のドメインIIIを強く認識する抗体(以下、抗体P30(A)と表記する)によりマイコプラズマ・ニューモニエを認識させる工程
(3)前記検体及び抗体P30(A)を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
(4)展開された移動相中のマイコプラズマ・ニューモニエを検出部に含まれる抗体P30(A)により検出する工程
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