CN112513638A

CN112513638A - 免疫学检测肺炎支原体的方法

Info

Publication number: CN112513638A
Application number: CN201980051975.8A
Authority: CN
Inventors: 落合泰史; 中村知史
Original assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Priority date: 2018-08-06
Filing date: 2019-08-05
Publication date: 2021-03-16
Also published as: WO2020031931A1; EP3835788A1; EP3835788A4; US20210302426A1; JP2020024093A; JP6426873B1

Abstract

本发明解决以下问题，提供以免疫学检测方法的用于检测肺炎支原体的具有高灵敏度的方法，在免疫学检测方法中使用针对肺炎支原体P30蛋白的抗体进行免疫反应。提供使用针对肺炎支原体P30蛋白的抗体用于免疫学检测肺炎支原体的方法，其中，在聚氧乙烯烷基胺的存在下进行免疫反应。附加地，作为免疫学检测方法提供了使用免疫层析的检测方法。

Description

免疫学检测肺炎支原体的方法

技术领域

本发明涉及免疫学检测肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)的方法。具体地，本发明涉及使用针对肺炎支原体蛋白P30的抗体免疫学检测肺炎支原体的方法。

背景技术

支原体肺炎为由致病性菌肺炎支原体引起的呼吸系统传染病。儿童的患病率较高，4岁以下儿童占患者的30％，9岁以下儿童占60％以上。

很多支原体肺炎患者仅仅是承受支气管炎等，但部分患者严重程度提高而伴有肺炎或其他并发症。因此，快速确诊和选择合适的抗菌药十分重要，因此，操作简单、能够快速检测的免疫层析是适用的。

例如，专利文献1公开了使用肺炎支原体蛋白P30特异性单克隆抗体的免疫层析装置。

此外，专利文献2公开了使用肺炎支原体核糖体蛋白L7/L12特异性抗体的免疫层析装置。

附带说明，当使用抗体进行检测时，有时在检测前用表面活性剂等等预处理待检测的细菌细胞或蛋白质，以暴露由抗体检测的位点。

专利文献1公开了试剂盒，在试剂盒中，含有具有13至17的HLB值的非离子表面活性剂的样本稀释剂与免疫层析装置一起使用。然而，虽然有数量巨大的具有13至17的HLB值的非离子表面活性剂，但聚氧乙烯辛基苯基醚(曲拉通X-100)和聚氧乙烯山梨醇酐月桂酸酯(吐温20)的1∶1混合物，和聚氧乙烯辛基苯基醚(Nonidet p-40)和聚氧乙烯/聚氧丙烯烷基醚(Nonion MN-811)的1∶1混合物这两个实例是仅有的在实施例中实际描述的非离子表面活性剂，而数量巨大的具有13至17的HLB值的其他非离子表面活性剂是否能使用，并没有描述。

此外，根据本发明人的试验，在使用肺炎支原体P30单克隆抗体的检测中，以上所述的聚氧乙烯辛基苯基醚(曲拉通X-100)，聚氧乙烯山梨醇酐月桂酸酯(吐温20)，和聚氧乙烯辛基苯基醚(Nonidet p-40)均未提供足够的灵敏度。

专利文献2公开了试剂盒，在试剂盒中，含有聚氧乙烯烷基醚或具有12至15的HLB值的非离子表面活性剂的样本稀释剂与免疫层析装置一起使用。然而，聚氧乙烯十六烷基醚(Brij 58)和合成醇EO加合物(LEOCOL TD90，120)是仅有的在实施例中实际描述的非离子表面活性剂，而具有12至15的HLB值的数量巨大的其他非离子表面活性剂并没有公开。此外，针对肺炎支原体核糖体蛋白L7/L12的抗体是仅有的进行试验的抗体，而没有公开或暗示非离子表面活性剂对于P30蛋白的抗体的任何影响。

此外，根据本发明人的试验，在使用肺炎支原体P30单克隆抗体的检测中，在向样本稀释剂中添加聚氧乙烯十六烷基醚(Brij 58)或合成醇EO加合物(LEOCOL TD90，120)的任一情况下，均没有提供足够的灵敏度。

因此，在使用针对肺炎支原体蛋白P30的抗体的免疫学检测肺炎支原体的方法中仍然待建立一种用于高灵敏/敏感性检测的技术。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：JP 2017-009571 A

专利文献2：JP 2014-167439 A

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供免疫学检测方法，所述方法包括使用针对肺炎支原体蛋白P30的抗体进行免疫反应，其中肺炎支原体以高灵敏度检测。

解决问题的方法

为实现上述目的，本发明人经过深入广泛的研究结果发现，当在许多表面活性剂中的聚氧乙烯烷基胺的存在下使用针对肺炎支原体蛋白P30的抗体实现免疫反应时，能以高灵敏度检测肺炎支原体，因此完成本发明。

具体地，本发明具有如下构成。

<1>

肺炎支原体的免疫学检测方法，其使用针对肺炎支原体蛋白P30的抗体，其中，在聚氧乙烯烷基胺的存在下进行免疫反应。

<2>

根据<1>的检测方法，其中，免疫学检测方法为免疫层析检测方法。

<3>

根据<1>或<2>的方法，其中，免疫层析检测方法包括以下步骤(A)至(C)：

(A)将含有肺炎支原体的样品与含有聚氧乙烯烷基胺的样品稀释剂混合的步骤；

(B)将在上述(A)中获得的混合物供应至下述定义的测试条的样品供应部分的步骤，

所述测试条包含：

多孔体的膜，其至少具有样品供应部分，展开部分和检测部分，

缀合物含有用标记物质标记的针对肺炎支原体蛋白P30的第一抗体，所述缀合物以可溶解状态保持在展开部分的一部分中，和

检测部分位于在缀合物保持部分的下游侧的展开部分的一部分，并具有固定其上的针对肺炎支原体蛋白P30的第二抗体；和

(C)在检测部分检测样品中的肺炎支原体与缀合物的复合物的步骤。

<4>

肺炎支原体检测试剂盒，其包含如下配置(1)和(2)：

(1)使用针对肺炎支原体蛋白P30的抗体的检测试剂；和

(2)含有聚氧乙烯烷基胺的样品稀释剂。

<5>

根据<4>所述的检测试剂盒，其中，上述(1)中的使用针对肺炎支原体蛋白P30的抗体的检测试剂为如下配置(1)′：

(1)′免疫层析测试条，其包含多孔体的膜，所述膜至少具有样品供应部分，展开部分和检测部分，

检测部分位于在缀合物保持部分的下游侧的展开部分的一部分，并具有固定其上的针对肺炎支原体蛋白P30的第二抗体。

<6>

用于免疫学检测方法的样品稀释剂，其含有聚氧乙烯烷基胺，所述免疫学检测方法使用针对肺炎支原体蛋白P30的抗体。

<7>

样品预处理方法，其用于免疫学检测肺炎支原体，包括使聚氧乙烯烷基胺与含有肺炎支原体的样品接触的步骤。

发明的有益效果

在本发明中，在聚氧乙烯烷基胺的存在下使用针对肺炎支原体蛋白P30的抗体进行免疫反应，据此能以高灵敏度检测肺炎支原体。

附图说明

[图1]为本发明的测试条的构成的示意图。

具体实施方式

(样品)

在本发明中，样品是指从患者采集的样本，所述样本可能含有待检测的肺炎支原体。

患者样本可以直接用作样品，或可以用样品稀释剂适当稀释然后用作样品。另外，患者样本可以适当稀释和过滤，然后用作样品。注意，样品稀释剂为有时称为样本稀释剂，样品提取液，样品展开液，样品悬浮液等，它们用作同义词。

(聚氧乙烯烷基胺)

本发明的免疫学检测方法，其特征在于包括在聚氧乙烯烷基胺的存在下进行免疫反应。聚氧乙烯烷基胺为如下通式表示的弱阳离子化合物，并具有这样的特性：随着氧乙烯基团的增加，非离子特性增加且对水的亲和力增加(HLB增加)。

鉴于在水中的溶解度，用于本发明的聚氧乙烯烷基胺优选具有约5.0至18.0，更优选6.0至16.0，仍然更优选7.0至12.0，和最优选9.0至11.0的HLB。其具体例子包括以商品名AMIET(注册商标，以下均同)102(HLB 6.3)、AMIET 105(HLB 9.8)、AMIET 105A(HLB 10.8)、AMIET 302(HLB 5.1)、AMIET 320(HLB 15.4)(花王株式会社)、LIPONOL(注册商标)系列(狮王特殊化学株式会社)、BLAUNON系列(青木油脂工业)、IONET(注册商标)EP-300S(三洋化成)销售的产品。

在免疫反应体系中的聚氧乙烯烷基胺的浓度优选为0.01％～10.0％，更优选0.1％～5％，仍然更优选0.2％～3％，和最优选0.3至1.5％。

在将聚氧乙烯烷基胺掺入反应系统的一个方面，聚氧乙烯烷基胺可以直接添加到免疫反应系统中。然而在典型的方面，如后文描述，使预先添加在样品稀释剂中的聚氧乙烯烷基胺与针对肺炎支原体蛋白P30的抗体进行接触，由此将聚氧乙烯烷基胺掺入免疫反应体系中。

(样品稀释剂)

本发明的样品稀释剂包含聚氧乙烯烷基胺，并优选进一步包含缓冲液。

本发明的样品稀释剂中聚氧乙烯烷基胺的浓度范围优选为0.01％～10.0％，更优选0.1％～5％，仍然更优选0.2％～3％，最优选0.3至1.5％。

本发明的样品稀释剂中含有的缓冲液的实例包括通常使用的磷酸盐缓冲液，Tris缓冲液，和Good′s缓冲液。本发明的样品稀释剂可以为任一种包含上述化合物和缓冲溶液的样品稀释剂。样品稀释剂可以为含有上述化合物的缓冲溶液。样品稀释剂可进一步地包含盐，如氯化钠，稳定剂或防腐剂如蔗糖，抗菌剂如ProClin(注册商标)等等。所述盐除了包括用于调整离子强度而掺入的盐如氯化钠以外，包括用于调整pH的缓冲液而添加的盐如氢氧化钠。本发明的样品稀释剂的pH，优选在6.0至10.0的范围，更优选7.0至9.0，仍然更优选7.5至8.5。

本发明的样品稀释剂为用于稀释样品的液体，因此样品稀释剂承担以下作用：溶解、提取或分散要添加到样品稀释剂中来稀释的含有肺炎支原体的样品(样本)。据此，当将样品提供到测试条的样品垫时，样品和样品稀释剂通常处于混合状态。然而，除了上述方面以外，本发明还包括一个方面，其中样品为直接提供至样品垫的，或将在除了本发明的样品稀释剂以外的稀释剂中稀释的样品提供至样品垫，并将本发明的样品稀释剂同时或随后提供至样品垫。

本发明的免疫学检测方法可以为使用免疫反应的任何检测方法，其实例包括为颗粒凝集免疫分析的乳胶免疫凝集分析(以下称为LTIA方法)，为典型夹心免疫分析方法也为标记免疫分析的ELISA方法，以及使用免疫层析的检测方法。其中，特别优选使用免疫层析的检测方法。使用免疫层析的检测方法的实例包括基于流动通过和基于横向流的免疫层析，并且由于简单和快速，使用基于横向流的免疫层析为优选的检测方法。

当本发明的样品稀释剂用于LTIA方法时，在用本发明的样品稀释剂稀释样品后，将稀释液与乳胶试剂混合，据此能检测免疫凝集反应。当乳胶试剂由含有缓冲液的第一试剂和含有乳胶试剂的第二试剂组成时，本发明的样本稀释剂能用作第一试剂。

本发明也提供了用于免疫学检测肺炎支原体的样品预处理方法，方法包括使聚氧乙烯烷基胺与含有肺炎支原体的样品接触的步骤。

通常，能通过将聚氧乙烯烷基胺掺入样本稀释剂中，及将样本稀释剂与样品混合而进行预处理。

(待检测物质)

本发明的待检测(分析)物质为肺炎支原体。在本发明中，通过使用针对肺炎支原体蛋白P30的抗体检测肺炎支原体蛋白P30，直接检测或定量肺炎支原体的存在。

(使用免疫层析检测)

本发明的免疫层析测试条为用于通过在不溶性膜中展开样品，而检测在样品中的待检测物质与缀合物的复合物的测试条。测试条包括：多孔体的膜，其具有(1)样品供应部分，(2)展开部分，和(3)检测部分，其中，展开部分的一部分以可溶解状态保持缀合物，所述缀合物含有用标记物质标记的第一抗体；检测部分为存在于在缀合物保持部分的下游侧的展开部分的一部分，并具有固定其上的第二抗体。

在本发明的一个方面，聚氧乙烯烷基胺含在样品稀释剂中。在另一个可能的方面中，其中测试条构成的垫的一部分为用聚氧乙烯烷基胺浸渍的。例如，样品垫，第三垫，缀合物垫，不溶性膜等为用聚氧乙烯烷基胺浸渍的。在又一个可能的方面中，过滤芯片为用本发明的聚氧乙烯烷基胺浸渍的。

在缀合物中，与待检测物质免疫学地反应的抗体被固定至标记体，且关于缀合物的存在方式，缀合物可以作为缀合物垫存在，或缀合物能够以用缀合物浸渍的除了样品垫，第三垫，和不溶性膜以外的垫的状态存在(类型A)，或缀合物能够表现为在样品垫的一部分中的缀合物部分(类型B)，或缀合物能够以使缀合物能与样本混合的方式而作为在测试条以外的单独的缀合物试剂存在(类型C)。

以下将会描述其中缀合物以类型A的方式存在的测试条。

在样品流动方向上从上游朝向下游，依次配置样品垫，缀合物垫，第三垫和不溶性膜，使得每一垫至少部分与上面的层和下面的层重叠。具有这样的排列的测试条的实例示于图1。

当含有待检测物质的样品提供至在这样的测试条中的样品垫时，待检测的物质通过样品垫向在下游侧的缀合物垫流动。在缀合物垫中，待检测的物质流过缀合物垫而同时与缀合物接触而形成复合物(聚集体)。然后，复合物流过放置使得与缀合物垫的更低表面接触的多孔第三垫，以展开到不溶性膜中。

因为和待检测的物质免疫学地反应的抗体固定在不溶性膜的一部分上，复合物将通过经由免疫反应与其结合而固定在那里。被固定的复合物通过用于检测归因于缀合物的吸光度，反射光，荧光，或磁力的方式而检测。

接下来，将会描述其中缀合物以类型B的方式存在的测试条。

它与类型A测试条的不同之处在于样品垫和缀合物垫为集成的，即在样品垫的一部分配置了样品供应部分和缀合物部分。

样品供应部分为含有待检测物质的样品将被供应到的部分，缀合物部分为含有缀合物的部分。样品供应部分在缀合物部分的上游侧。

接下来，将会描述其中缀合物以类型C的方式存在的测试条。

它与类型A的测试条的不同之处在于没有缀合物垫，缀合物以单独的缀合物试剂形式存在。一个实例为过滤芯片，其中缀合物含在过滤器中。当使用这样的过滤芯片，并让样品稀释剂和待检测的物质通过过滤芯片时，缀合物与待检测的物质结合而形成复合物(聚集体)。通过将复合物供应到除了没有缀合物垫以外与类型A相同的测试条，能检测待检测的物质。

除了上述情况外，缀合物垫或过滤芯片可以包含本发明的聚氧乙烯烷基胺。

(样品垫)

本发明使用的样品垫为接受样品的部分，并包括能够吸收液态样品并允许液体和待检测对象在被模压成垫形状的状态下通过的任何物质和形式。适合样品垫的材料的具体实例包括但不限于玻璃纤维、丙烯酸纤维、亲水性的聚乙烯材料、干纸、纸浆和纺织品。玻璃纤维垫是适合使用的。样品垫也可具有如以下描述的缀合物垫的功能。此外，样品垫能够包含封闭试剂，所述封闭试剂通常使用于预防或抑制抗体固定膜中的非特异性反应(吸附)。

除了上述以外，样品垫也可以包含本发明的聚氧乙烯烷基胺。

(第三垫)

第三垫优选取决于样品的特性等而根据需要提供，可使用能够允许样品中的待检测的物质与缀合物的复合物通过所述垫的任何类型。

本发明的第三垫的平均孔径例如为1至100μm，优选5至80μm，更优选10至60μm，进一步优选15至55μm，特别优选20至50μm，最优选25至45μm。

除了上述以外，第三垫可以包含本发明的聚氧乙烯烷基胺。

(不溶性膜)

本发明使用的不溶性膜具有至少一个检测部分，与待检测的物质免疫学反应的抗体固定在检测部分上。将与待检测的物质免疫学地反应的抗体与不溶性膜支持物的固定，可以通过常规已知的方法达到。在基于横向流的免疫层析试剂的情况下，可以通过制备含有规定浓度的抗体的液体，使用例如具有能够在水平方向上移动喷嘴同时以恒定速度从喷嘴喷射液体的机构的装置以线形式将所述液体施用在不溶性膜支持物上，并干燥所述液体而固定抗体。液体中抗体的浓度优选为0.1至5mg/mL，更合适地0.5至2mg/mL。固定在不溶性膜支持物上的抗体的量可以在横向流形式的情况下通过调整从装置的喷嘴射出速度而进行最优化，所述量优选为0.5至2μL/cm。

注意，使用基于横向流免疫层析试剂的测定方法为样品展开以便利用在平行于不溶性膜支持物方向的毛细作用下进行移动的形式的测定方法。

含有为规定浓度的抗体的液体可以通过将抗体添加至缓冲液中而制备。缓冲液类型的实例包括通常使用的磷酸盐缓冲液，Tris缓冲液，和Good′s缓冲液。缓冲液的pH优选在6.0至9.5的范围，更优选6.5至8.5，进一步地优选7.0至8.0。缓冲液可进一步地包含盐如氯化钠，如氯化钠，稳定剂或防腐剂如蔗糖，抗菌剂如ProClin(注册商标)等等。所述盐除了包括用于调整离子强度而掺入的盐如氯化钠以外，也包括用于调整缓冲液的pH而添加的盐如氢氧化钠。

将抗体固定在不溶性膜上后，除了抗体固定化部分以外的部分可以进一步用通常用于封闭的封闭剂的溶液或蒸汽进行包覆。

注意，在不溶性膜上，可以固定常规使用于免疫层析试剂的对照捕获试剂。对照捕获试剂为用于保证分析可靠性的试剂，并捕获并入缀合物垫中的对照试剂。例如，当缀合物垫包含标记的钥孔虫戚血兰素(以下称为KLH)作为对照试剂时，抗KLH抗体等对应于对照捕获试剂。固定对照捕获试剂的位置可以适当选择，以便符合分析系统的设计。

除了上述以外，不溶性膜可以包含本发明的聚氧乙烯烷基胺。

作为构成本发明使用的不溶性膜的膜，可以使用常规用作免疫层析试剂的不溶性膜支持物的已知的膜。其实例包括聚乙烯，聚对苯二甲酸乙二酯，尼龙、玻璃、多糖如纤维素和纤维素衍生物以及陶瓷的纤维形成的膜。具体实例包括可从Sartorius AG，MilliporeCorp.，东洋滤纸社，Whatman(注册商标)商购获得的玻璃纤维滤纸和纤维素滤纸等等。其中，优选来自Sartorius AG的UniSart CN140。此外，通过适当选择不溶性膜支持物的孔径和结构，可以控制缀合物与在样品中的待检测的物质的复合物在不溶性膜支持物中的流动速度。

免疫层析测试条优选放置在固相支持物，如塑料粘合片上。固相支持物由不妨碍样品和缀合物的毛细管流动的物质构成。免疫层析测试条可以用粘合剂等等固定在固相支持物上。在这种情况下，粘合剂的成分等也由不妨碍样品和缀合物的毛细管流动的物质构成。考虑到免疫层析测试条的大小，应用样品的方式和位置，检测部分在不溶性膜的形成位置和检测信号的方法，免疫层析测试条可以以在适当的容器(外壳)中或安装在适当的容器(外壳)上的状态下使用。这样的存储或安装的这种状态称为“装置”。

(针对肺炎支原体蛋白P30的抗体)

本发明的针对肺炎支原体蛋白P30的抗体可以为多克隆抗体或单克隆抗体，只要其为能够特异性检测所述蛋白的抗体即可，其中，优选单克隆抗体。

这样的针对肺炎支原体蛋白P30的抗体能根据普通的方法使用例如以下物质作为免疫抗原而获得：从肺炎支原体细菌细胞提取的蛋白P30，或通过将克隆的蛋白P30基因用宿主如大肠杆菌的基因工程来表达，接着提取和纯化而获得的重组蛋白P30，或构成蛋白P30的一部分的多肽。多克隆抗体可以从当用免疫抗原对动物，如小鼠进行免疫时生成的抗血清获得。单克隆抗体可以通过将动物，如小鼠免疫，然后使经免疫的动物的脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，选择得到的融合细胞并将其培养在含有HAT的培养基中，并使用蛋白P30筛选抗蛋白P30抗体产生株而获得。

本发明的针对肺炎支原体蛋白P30的抗体也包括针对肺炎支原体蛋白P30的抗体的片段，及基本上相当于该抗体的修饰抗体。抗体片段的实例包括Fab片段，F(ab)₂片段，Fab片段和scFv片段。

对作为本发明的针对肺炎支原体蛋白P30的第一抗体的经标记的抗体，及作为本发明的针对肺炎支原体蛋白P30的第二抗体的固定化抗体而言，可以各自为多克隆抗体或单克隆抗体，但优选其中至少一个为单克隆抗体，并更优选两者皆为单克隆抗体。

此外，第一抗体和第二抗体优选为识别存在于蛋白P30中的不同表位的抗体。

蛋白P30为粘附蛋白之一，分子量为30KDa。在肺炎支原体的细菌细胞中，蛋白P30定位在细胞的表面，在附着细胞器的顶端，其为N末端包埋在细胞膜中C末端存在于细胞膜外的跨膜蛋白。

此外，在C末端侧存在含有许多脯氨酸残基的氨基酸序列的重复结构。一般来说，已知包括含有许多脯氨酸残基的氨基酸序列的区域具有立体的高序结构(Higher orderstructure)，可以成为与抗体反应的表位。

本发明的对于蛋白P30的抗体为能够特异性识别蛋白P30的任何抗体。优选的单克隆抗体为识别蛋白P30的细胞外区域中的部分的单克隆抗体，所述部分包括包含许多脯氨酸残基的氨基酸序列的重复结构。

作为本发明的针对肺炎支原体蛋白P30的抗体，可以使用可商购获得的抗P30单克隆抗体。可商购获得的抗P30单克隆抗体的实例包括Meridian Life Science有限公司制的C01939M，C01940M，C01941M，C01942M和C01943M。

(抗P30单克隆抗体的制备例)

以下试验使用的抗P30单克隆抗体通过(Kohler和Milstein的方法(Nature，Vol.256，p.495(1975))等等)获得，该方法为由本领域技术人员通常使用的用于产生单克隆抗体的方法。

(标记体)

作为本发明使用的标记体，可以使用通常用在免疫层析测试条中的已知的标记体。例如，优选为胶体金属颗粒，如胶体金颗粒或胶体铂颗粒，有色乳胶颗粒，磁性颗粒，荧光颗粒等等，且特别优选胶体金颗粒或有色乳胶颗粒。

(缀合物)

在本发明使用的缀合物中，如上所述，与作为待检测的物质的肺炎支原体免疫学地反应的抗体是固定至标记体的。在缀合物的优选实施例中，抗肺炎支原体蛋白P30单克隆抗体或多克隆抗体是固定至胶体金颗粒的。

将与待检测的物质免疫学地反应的抗体固定至标记体的方法的实例包括：物理吸附和化学键合。抗体通常通过物理吸附进行固定。

(试剂盒)

本发明的用于检测肺炎支原体的试剂盒，可以为包括使用了针对肺炎支原体蛋白P30的抗体的检测试剂及含有聚氧乙烯烷基胺的样品稀释剂的任何试剂盒。

另外，本发明的使用免疫层析的用于检测肺炎支原体的试剂盒可以为包括使用了针对肺炎支原体蛋白P30的抗体的免疫层析测试条，及含有聚氧乙烯烷基胺的样品稀释剂的任何试剂盒。

所述检测试剂盒可进一步包括检测所需要的试剂，试管，取样工具，说明书，用于承装测试条的外壳等等。

(其他)

如本文所用，使用的术语″上游″或″下游″的含义为在样品流方向的″上游侧″或″下游侧″。即，当样品垫，缀合物垫，第三垫和不溶性膜从上堆叠以使在本发明的测试条中部分地重叠时，样品垫位于最上游而不溶性膜位于最下游。此外，有时将端垫堆叠在不溶性膜上并使得它们的末端在下游侧彼此重叠，在这种情况下，端垫是位于最下游的。

实施例

[实施例1]添加表面活性剂至样品稀释剂中的研究(1)

1.试验材料

(1)试验装置

制作了试验装置，所述试验装置包含使用针对肺炎支原体蛋白P30的单克隆抗体的免疫层析测试条。

在图1中，示出了本发明的免疫层析测试条的构成示意图。

将不溶性膜(b)结合至塑料粘合片(a)，然后放置第三垫(g)，缀合物垫(d)和样品垫(e)并按此顺序进行附着，并将吸收垫(f)放置并附着在另一端。缀合物垫已经用缀合物浸渍，在所述缀合物中，金胶体用抗蛋白P30单克隆抗体(示于表中的标记抗体S08214R)进行了敏化。在不溶性膜上，将抗蛋白P30单克隆抗体(固定化抗体S08210R，应用浓度：0.75mg/mL，应用量：1.0μL/cm)和-对照试剂(山羊抗小鼠IgG，应用浓度：0.75mg/mL，应用量：1.0μL/cm)各自固定在相对于流动方向垂直的线上。将垫堆叠，使得每一个垫与上面的垫和下面的垫部分地接触。将抗蛋白P30单克隆抗体的线称为试验线(c1)，将对照试剂的线称为对照线(c2)。

将成分堆叠成的结构进行切割，切成恒定宽度以制成免疫层析测试条。将测试条安装在并储存在专用的塑料壳体中，成为免疫层析试验装置形式(未显示)。

(2)样品稀释剂

向20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中，添加1.0％的聚氧乙烯烷基胺，添加50mM的NaCl以制备样品稀释剂。添加0.25％的BSA作为添加剂。

(3)样品

将接收自NBRC的冰冻支原体通过离心进行浓缩，并以在该表中的稀释率用生理盐水进行稀释。将稀释物用作样本。将每一样本15μL悬浮在300μL的样品稀释剂中而制备样品。

2.试验方法

滴加一百二十(120)μL的样品到试验装置中，15分钟后，使用称为″比色图表″的颜色样品，根据如下标准目测评价了试验线的显色的强度。

+：显色

±：显色但弱或非常弱

-：没有显色

3.试验结果

结果示于表1。试验线的显色的强度显示在″Myco″栏中，对照线的显色的强度显示在″Cont″栏中。将极限稀释或更低稀释率(在可检测到的稀释率范围内)的结果标上阴影。本发明的评价标准为在使用本发明的样品稀释剂的情况下，与使用EMULGEN 108(注册商标，以下相同适用)(0.5％)的情况下相比灵敏度是否更高，后者当使用在下述描述的参考例中时，在相同试验中显示了相对更高的灵敏度。

结果显示，当使用其中添加聚氧乙烯烷基胺的样品稀释剂检测肺炎支原体时，EMULGEN(注册商标，以下相同适用)108的检测限为40的稀释率，与此相对，在本发明中用AMIET 105时，即使在320的稀释率时检测仍是可能的。

[表1]

标记抗体S08214R

[实施例2]添加表面活性剂至样品稀释剂中的研究(2)

除了将标记抗体改为S08222R以外，灵敏度评价试验以与实施例1相同的方式进行。

结果示于表2。结果显示，EMULGEN 108的检测限为80的稀释率，与此相对，在本发明中用AMIET 105时，即使在1280的稀释率时检测仍是可能的。

[表2]

标记抗体S08222R

[实施例3]添加表面活性剂至样品稀释剂中的研究(3)

除了将标记抗体改为S08224R，并将两种聚氧乙烯烷基胺的添加浓度改变为0.1％以外，灵敏度评价试验以与实施例1相同的方式进行。

结果示于表3。结果显示，EMULGEN 108的检测限为80的稀释率，与此相对，在本发明中用AMIET 105和AMIET 320时，即使在320的稀释率时检测仍是可能的。

[表3]

标记抗体S08224R

[实施例4]添加表面活性剂至样品稀释剂中的研究(4)

除了将标记抗体改为S08228R以外，灵敏度评价试验以与实施例1相同的方式进行。

结果示于表4。

结果显示，EMULGEN 108的检测限为160的稀释率，与此相对，在本发明中用AMIET105时，即使在640的稀释率时检测仍是可能的。

[表4]

标记抗体S08228R

从上述实施例1至4中可以看出，在使用针对肺炎支原体蛋白P30的单克隆抗体的任何案例中，通过在本发明中的聚氧乙烯烷基胺的存在下进行免疫反应，肺炎支原体能够以高灵敏度地检测到。

[参考例]表面活性剂的筛选

在上述实施例之前，对非离子表面活性剂和阴离子表面活性剂进行了灵敏度评价试验以探索用于提高检测灵敏度的化合物。而上述实施例1至4评价了检测下限，本筛选评价了试验线的显色的强度。

(1)试验方法

滴加一百二十(120)μL的样品到与实施例1中相同的试验装置中，15分钟后，使用称为″比色图表″的颜色样品，目测评价了试验线的显色的强度。通过向20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中，以0.1％和1.0％的两种浓度添加了具有表5所示的组成的每种表面活性剂以及50mM的NaCl而调制了样品稀释剂。添加0.25％的BSA作为添加剂。

评价标准为如下的相对性的三点量表：相对于对照Emargen 108将在任何的表面活性剂浓度观察到发色的强度显著增加的情况评价为

将观察到增加的情况评价为§，并将观察到降低或没有观察到发色的情况评价为-。

(2)试验结果

结果示于表5。结果显示，所有的阴离子表面活性剂提供了较差的灵敏度，不能进行检测，并且在非离子表面活性剂中，每种聚氧乙烯烷基胺均提供了高灵敏度。基于这些结果，在上述实施例中进行了用于验证利用多种另外的单克隆抗体时检测灵敏度也高和用于找到可检测的浓度范围的测试。

[表5]

工业实用性

根据本发明，通过在聚氧乙烯烷基胺的存在下使用针对肺炎支原体蛋白P30的抗体进行免疫反应，能以高灵敏度检测肺炎支原体。

参考符号列表

(a)塑料粘合片

(b)不溶性膜

(c1)试验线

(c2)对照线

(d)缀合物垫

(e)样品垫

(f)吸收垫

(g)第三垫

Claims

1.肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)的免疫学检测方法，其使用针对肺炎支原体蛋白P30的抗体，其中，在聚氧乙烯烷基胺的存在下进行免疫反应。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，免疫学检测方法为免疫层析检测方法。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，免疫层析检测方法包括以下步骤(A)至(C)：

(B)将在上述(A)中获得的混合物供应至下文定义的测试条的样品供应部分的步骤，

所述测试条包含：

(C)在检测部分中检测样品中的肺炎支原体与缀合物的复合物的步骤。

4.肺炎支原体检测试剂盒，其包含如下配置(1)和(2)：

(1)使用针对肺炎支原体蛋白P30的抗体的检测试剂；和

(2)含有聚氧乙烯烷基胺的样品稀释剂。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其中，上述(1)中的使用针对肺炎支原体蛋白P30的抗体的检测试剂为如下配置(1)′：

缀合物含有用标记物质标记的针对肺炎支原体蛋白P30的第一抗体，所述缀合物以可溶解状态保持在展开部分的一部分中，和，

6.用于免疫学检测方法的样品稀释剂，其含有聚氧乙烯烷基胺，所述免疫学检测方法使用针对肺炎支原体蛋白P30的抗体。

7.样品预处理方法，其用于免疫学检测肺炎支原体，包括使聚氧乙烯烷基胺与含有肺炎支原体的样品接触的步骤。