KR20180002752A - 마이코플라스마ㆍ뉴모니에 검출용 면역 크로마토그래피 분석 장치 - Google Patents

마이코플라스마ㆍ뉴모니에 검출용 면역 크로마토그래피 분석 장치 Download PDF

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게이타 스즈키
히사히코 이와모토
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다나카 기킨조쿠 고교 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 고감도로 마이코플라스마ㆍ뉴모니에를, 신속하면서도 간이하게 검출할 수 있고, 그 결과 폐렴 마이코플라스마의 진단을 보다 확실하면서도 신속하게 행하는 면역 크로마토그래피 분석 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 시료 첨가부, 표지 물질 유지부, 검출부를 갖는 크로마토그래프 매체부 및 흡수부를 포함하는, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에(Mycoplasma pneumoniae)를 검출하기 위한 면역 크로마토그래피 분석 장치이며, 상기 표지 물질 유지부 및 검출부가, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III을 강하게 인식하는 항체를 함유하는, 면역 크로마토그래피 분석 장치에 관한 것이다.

Description

마이코플라스마ㆍ뉴모니에 검출용 면역 크로마토그래피 분석 장치
본 발명은 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 검출을 위한 면역 크로마토그래피 분석 장치, 면역 크로마토그래피 분석 키트 및 그 검출 방법에 관한 것이다.
마이코플라스마 폐렴은, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에(Mycoplasma pneumoniae)를 주된 원인으로 한 호흡기계의 감염증이다. 마이코플라스마ㆍ뉴모니에는 비정형 폐렴의 대표적인 기인균이다. 마이코플라스마 폐렴 환자의 연령은, 유아기, 학동기, 청년기(5세에서 35세)가 중심이며, 초기 증상은, 감기 증후군 유사 증상, 소위 감모 유사 증상을 나타내지만, 시간의 경과와 함께 기침이 강해져, 해열 후에도 1개월 정도 계속되는 경우도 있다.
마이코플라스마 폐렴의 진단을 위해, 종래 다양한 방법이 이용되고 있다. 예를 들어, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에에 대한 항체를 사용한 검출법이 이용되고 있다. 마이코플라스마 폐렴에서는, 항생제 선택을 위해 감염 초기에 마이코플라스마ㆍ뉴모니에 감염의 유무를 판정하고 싶다는 의료 현장의 요구가 높은데, 조작이 간편한 면역 크로마토그래피 분석법에 응용함으로써, 신속하면서도 간이하게 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 검출을 행할 수 있고, 마이코플라스마 폐렴의 진단을 행할 수 있다.
면역 크로마토그래피 분석법에 사용하는 면역 크로마토그래피 분석 장치의 가장 간단한 구조로서는, 시료 첨가부, 표지 물질 유지부, 검출부를 갖는 크로마토그래프 매체부, 및 흡수부가 서로 연결된 구조이다.
예를 들어, 특허문헌 1에는, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P1 단백질에 특이적인 모노클로날 항체를 사용한 면역 크로마토그래피 분석 장치가 개시되어 있다.
또한, 특허문헌 2에는, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 리보솜 단백질 Ribosomal Protein L7/L12에 특이적인 항체를 사용한 면역 크로마토그래피 분석 장치가 개시되어 있다.
일본 특허 공개 제2013-72663호 공보 일본 특허 공개 제2014-167439호 공보
그러나, 종래 사용되고 있던 마이코플라스마ㆍ뉴모니에에 대한 항체를 사용한 면역 크로마토그래피 분석 장치에 의한 진단 방법에서는, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에에 대한 감도는 충분하지 않고, 비특이적인 반응도 많기 때문에, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에 감염의 진단 방법으로서는 충분한 것이 아니었다.
그래서, 본 발명자들은, 예의 연구한 결과, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P1 단백질보다 고감도로 검출할 수 있는 표적 단백으로서, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질에 주목하여, 특히 P30 단백질의 특정한 부위를 인식하는 항체는, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에를 고감도로 검출할 수 있음을 알아냈다.
또한, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 특정한 부위에 결합하는 항체를 사용한 면역 크로마토그래피 분석 장치에 따르면, 신속하면서도 간이하게 마이코플라스마ㆍ뉴모니에 감염을 고감도로 검출할 수 있음을 알아내고, 본 발명에 이르렀다.
따라서, 본 발명은 이하와 같다.
1. 시료 첨가부, 표지 물질 유지부, 검출부를 갖는 크로마토그래프 매체부 및 흡수부를 포함하는, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에(Mycoplasma pneumoniae)를 검출하기 위한 면역 크로마토그래피 분석 장치이며,
상기 표지 물질 유지부 및 검출부가, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III을 강하게 인식하는 항체를 함유하는, 면역 크로마토그래피 분석 장치.
2. 상기 항체가, 상기 도메인 III 중 서열 번호 3의 아미노산 서열을 인식하는, 상기 1에 기재된 면역 크로마토그래피 분석 장치.
3. 상기 표지 물질 유지부가 함유하는 표지 물질이 금 입자이며, 상기 표지 물질 유지부가 상기 금 입자를 0.25 내지 0.7㎍/㎠ 함유하는, 상기 1 또는 2에 기재된 면역 크로마토그래피 분석 장치.
4. 상기 1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 면역 크로마토그래피 분석 장치와, 검체를 희석하여 전개하기 위한 검체 희석액을 포함하는, 면역 크로마토그래피 분석 키트.
5. 상기 검체 희석액이 적어도 1종의 비이온성 계면 활성제를 함유하는, 상기 4에 기재된 면역 크로마토그래피 분석 키트.
6. 상기 검체 희석액이 함유하는 비이온성 계면 활성제의 50％ 이상이, HLB값이 13 내지 18인 비이온성 계면 활성제인, 상기 5에 기재된 면역 크로마토그래피 분석 키트.
7. 시료 첨가부, 표지 물질 유지부, 검출부를 갖는 크로마토그래프 매체부 및 흡수부를 포함하는 면역 크로마토그래피 분석 장치를 사용하여, 검체 중의 마이코플라스마ㆍ뉴모니에를 검출하는 방법이며, 이하의 공정 (1) 내지 (4)를 포함하는 면역 크로마토그래피 분석 방법.
(1) 검체 희석액에 의해 검체를 희석한 검체 함유액을 시료 첨가부에 첨가하는 공정
(2) 표지 물질 유지부에 유지되어 있는, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III을 강하게 인식하는 항체(이하, 항체 P30(A)라고 표기함)에 의해 마이코플라스마ㆍ뉴모니에를 인식시키는 공정
(3) 상기 검체 및 항체 P30(A)를 이동상으로 하여 크로마토그래프 매체부에 전개시키는 공정
(4) 전개된 이동상 중의 마이코플라스마ㆍ뉴모니에를 검출부에 포함되는 항체 P30(A)에 의해 검출하는 공정
본 발명에 따르면, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 특정한 부위에 결합하는 항체를 사용한 면역 크로마토그래피 분석 장치를 사용함으로써, 고감도로 마이코플라스마ㆍ뉴모니에를, 신속하면서도 간이하게 검출할 수 있다. 즉, 폐렴 마이코플라스마의 진단을 보다 확실하면서도 신속하게 행할 수 있다.
도 1은, 본 발명의 일 실시 형태의 면역 크로마토그래피 분석 장치의 구조를 설명하기 위한 단면도이다.
도 2는, 본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 장치를 사용하여, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 검출을 행하고, 그 발색 강도를 측정한 결과를 도시하는 그래프이다.
도 3은, 본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 장치를 사용하여, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 검출을 행하고, 그 발색 강도를 측정한 결과를 도시하는 그래프이다.
도 4는, 본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 장치를 사용하여, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 검출을 행하고, 그 발색 강도를 측정한 결과를 도시하는 그래프이다.
도 5는, 시험예 4에 있어서, 항체 P30(a)를 사용하여, 펩티드 1 또는 펩티드 2를 항원으로 한 경합 저해 ELISA 시험을 행하고, 그 발색 강도를 측정한 결과를 도시하는 그래프이다.
도 6은, 시험예 4에 있어서, 항체 P30(b)를 사용하여, 펩티드 1 또는 펩티드 2를 항원으로 한 경합 저해 ELISA 시험을 행하고, 그 발색 강도를 측정한 결과를 도시하는 그래프이다.
이하에, 본 발명을 실시하기 위한 형태를 설명한다.
본 발명의, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에를 검출하기 위한 면역 크로마토그래피 분석 장치는, 검체를 첨가하는 시료 첨가부와, 표지 물질을 유지하는 표지 물질 유지부와, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에를 검출하는 검출부를 갖는 크로마토그래프 매체부와, 검출부를 통과한 액체를 흡수하는 흡수부를 구비하고, 표지 물질 유지부 및 검출부가, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III을 강하게 인식하는 항체를 함유하는 것을 특징으로 하고 있다.
본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 장치에 사용하는 항체는, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III을 강하게 인식하는 항체(이하, 항체 P30(A)라고도 함)이다.
마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질이란, 서열 번호 1로 표시되는 274의 아미노산을 포함하고, 프롤린이 풍부하고(20.7％), 분자량 29, 743의 접착 단백질이다.
또한, 서열 번호 2로 표시되는 P30 단백질의 도메인 III은, P30 단백질(서열 번호 1) 중 아미노산 서열의 177번째부터 274번째에 상당하는 영역이며, 특정한 아미노산의 반복 서열이 풍부한 도메인이다. 도메인 III에 있어서의 아미노산의 반복 서열은 3종류 있으며, 서열 번호 3(PGMAPR)으로 표시되는 아미노산 서열이 7개소, 서열 번호 4(PGMPPH)로 표시되는 아미노산 서열이 3개소, 서열 번호 5(PGFPPQ)로 표시되는 아미노산 서열이 3개소 존재한다.
본 발명에 사용하는 항체 P30(A)는, 이 아미노산의 반복 서열이 풍부한 도메인 III을 인식하기 때문에, 본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 장치를 사용하여 분석을 행함으로써, 하기에 나타내는 바와 같은 샌드위치 구조가 형성되고, 검출 감도가 현저히 향상되고, 현저하게 그 효과를 발휘할 것으로 추측된다.
즉, 본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 장치의 표지 물질 유지부 및 검출부에 항체 P30(A)를 함유시킨 경우, 우선, 표지 물질 유지부에 유지된 항체 P30(A)가, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질 중에서 도메인 III의 반복 서열의 일부에 결합한다.
이어서, 검출부에 고정화된 항체 P30(A)가, 표지 물질 유지부에 유지된 항체 P30(A)가 결합한 개소와 다른 개소에 존재하는 동일한 반복 서열에 결합함으로써, P30 단백질을 항체 P30(A) 사이에 끼우도록 하여 샌드위치의 구조를 형성하고, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에를 검출한다.
이와 같이, 항체 P30(A)는, 상기 반복 서열을 갖는 도메인 III을 인식하기 때문에, P30 단백질의 복수의 개소를 인식할 수 있고, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 검출 감도를 높일 수 있을 것으로 추측된다.
본 발명에 사용하는 항체 P30(A)는, 바람직하게는 상기 도메인 III의 아미노산의 반복 서열 중, 적어도 서열 번호 3(PGMAPR)의 아미노산 서열을 인식하는 것이면 바람직하다. 하기 실시예의 결과에도 나타나 있는 바와 같이, 상기 서열을 인식하는 항체는, 보다 강하게 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III을 인식하기 때문에, 고감도로 마이코플라스마ㆍ뉴모니에를 검출할 수 있다.
본 발명에 있어서의 항체 P30(A)가, 「마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III을 강하게 인식하는」 항체라는 것은, ELISA 시험을 행하였을 때, 450nm의 흡광도가 0.2Abs 이상이 되는 항체로서 정의할 수 있다.
구체적으로는, 이하의 프로토콜에 따라, ELISA 시험을 행한다. 우선, Nunc Immuno modules(Thermo Fisher Scientific사제, 코드 469949) ELISA용 96웰 플레이트에, Mycoplasma pneumonia P30((아미노산 96-274)를, 대장균을 이용한 통상의 방법으로 발현, 정제한 단백질 P30Ag) 4ng/mL in 50mM 탄산 버퍼 pH9.5를 100μL 첨가하고, 4℃에서 16시간 인큐베이트한다. 16시간 후, P30 용액을 제거하고, 웰을 300μL PBST(0.05％ Tween20 in PBS)로 3회 워시한다. 웰에 남은 액은, 페이퍼 타올에 털어서 제거한다.
블로킹액으로서, 5％ BSA in PBST(BSA: 오리엔탈 고보사제)를 300μL 첨가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이트한다. 그 후 BSA 용액을 제거하고, 웰을 300μL PBST(0.05％ Tween20 in PBS)로 3회 워시한다. 웰에 남은 액은, 페이퍼 타올에 털어서 제거한다.
1차 항체로서, 항 Mycoplasma pneumoniae P30 항체(항체 P30(A)) 5㎍/mL in 50％ 블로킹 용액 100μL를 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 인큐베이트한다. 그 후 1차 항체 용액을 제거하고, 웰을 300μL PBST(0.05％ Tween20 in PBS)로 3회 워시한다.
2차 항체로서, Anti Mouse IgG(H+L), Rabbit, IgG Whole, Peroxidase Cojugated(와코 준야쿠사제, 코드 014-17611) 1mg/mL를 100μL 웰에 첨가하고, 37℃, 1.5시간 인큐베이트한다. 그 후 BSA 용액을 제거하고, 웰을 300μL PBST(0.05％ Tween20 in PBS)로 3회 워시한다. 웰에 남은 액은, 페이퍼 타올에 털어서 제거한다.
웰에 발색 기질로서, Sure Blue Reserve TMB Microwell Peroxidase Substrate(1-Component)(KPL사제, 코드 53-00-01)를 100μL 첨가하고, 15분 반응시키고, 2N 황산을 100μL 첨가하여 반응을 정지시킨다.
마이크로플레이트 리더(BIORAD사제)로 450nm의 흡광도를 측정한다.
상기 방법에서, 블랭크(1차 항체를 넣지 않고 2차 항체, 발색 반응을 행한 웰)의 흡광도를 뺀 값이, 0.2Abs 이상이 되는 항체를, 「마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III을 강하게 인식하는」 항체로 하였다.
또한, 본 발명에 있어서의 항체 P30(A)가, 「마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III을 강하게 인식하는」 항체라는 것은, 구체적으로는, 전체 길이의 Mycoplasma pneumonia P30 단백질(아미노산 1-274: 서열 번호 1) 혹은 Mycoplasma pneumonia P30 단백질의 아미노산 96-274 단편(이들 단백질을 단백질 A라고 함)과, 도메인 III 혹은 도메인 III에 있어서의 아미노산의 3종류의 반복 서열(서열 번호 3 내지 5)을 1 이상 포함하는 도메인 III의 단편(이들 단백질을 단백질 B라고 함)의, ELISA법에 의한 경합 저해 시험(경합 저해 ELISA 시험)을 행하였을 때, 단백질 A에 대한 항체의 반응이 단백질 B의 존재에 의해 반응이 저해되는 경우에 있어서의 그 항체라고도 정의할 수 있다. 경합 저해 ELISA 시험으로서는, 직접 경합법과 간접 경합법의 어느 시험 방법에 의해서도 정의할 수 있다.
간접 경합법에 의한 시험을 예시하면, Nunc Immuno modules(Thermo Fisher Scientific사제, 코드 469949) ELISA용 96웰 플레이트에, 전체 길이 단백질의 Mycoplasma pneumonia P30(아미노산 1-274: 서열 번호 1) 4ng/mL in 50mM 탄산 버퍼 pH9.5를 100μL 첨가하고, 4℃에서 16시간 인큐베이트한다. 16시간 후, P30 용액을 제거하고, 웰을 300μL PBST(0.05％ Tween20 in PBS)로 3회 워시한다. 웰에 남은 액은, 페이퍼 타올에 털어서 제거한다.
블로킹액으로서, 5％ BSA in PBST(BSA: 오리엔탈 고보사제)를 300μL 첨가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이트한다. 그 후 BSA 용액을 제거하고, 웰을 300μL PBST(0.05％ Tween20 in PBS)로 3회 워시한다. 웰에 남은 액은, 페이퍼 타올에 털어서 제거하고, 전체 길이 단백질 고정 웰을 작성한다.
이어서, 전체 길이 단백질 고정 웰에 1차 항체로서, 항 Mycoplasma pneumoniae P30 항체(항체 P30(A)) 5㎍/mL in 50％ 블로킹 용액 100μL를 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 인큐베이트한다. 그 후 1차 항체 용액을 제거하고, 웰을 300μL PBST(0.05％ Tween20 in PBS)로 3회 워시한다.
또한, 상기 1차 항체만을 첨가한 것과는 별도로, 1차 항체의 항 Mycoplasma pneumoniae P30 항체(항체 P30(A)) 5㎍/mL와, 상기 1차 항체량의 40배량 또는 80배량의 도메인 III 혹은 도메인 III에 있어서의 아미노산의 3종류의 반복 서열을 1 이상 포함하는 도메인 III의 단편을 포함하는 50％ 블로킹 용액 100μL를 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 인큐베이트한다. 그 후 1차 항체 용액을 제거하고, 웰을 300μL PBST(0.05％ Tween20 in PBS)로 3회 워시한다.
2차 항체로서, Anti Mouse IgG(H+L), Rabbit, IgG Whole, Peroxidase Cojugated(와코 쥰야쿠사제, 코드 014-17611) 1mg/mL를 100μL, 상기 작성한 2종의 각각의 웰에 첨가하고, 37℃, 1.5시간 인큐베이트한다. 그 후 BSA 용액을 제거하고, 웰을 300μL PBST(0.05％ Tween20 in PBS)로 3회 워시한다. 웰에 남은 액은, 페이퍼 타올에 털어서 제거한다.
웰에 발색 기질로서, Sure Blue Reserve TMB Microwell Peroxidase Substrate(1-Component)(KPL사제, 코드 53-00-01)를 100μL 첨가하고, 15분 반응시키고, 2N 황산을 100μL 첨가하여 반응을 정지시킨다.
마이크로플레이트 리더(BIORAD사제)로 450nm의 흡광도를 측정한다.
상기 방법에서, 1차 항체만을 첨가한 웰의 흡광도로부터 1차 항체와 도메인 III 또는 도메인 III에 있어서의 아미노산의 3종류의 반복 서열을 1 이상 포함하는 도메인 III의 단편을 첨가한 웰의 흡광도가 감소함을 확인할 수 있고, 「마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III을 강하게 인식함」을 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서는, 도메인 III 혹은 도메인 III에 있어서의 아미노산의 3종류의 반복 서열을 1 이상 포함하는 도메인 III의 단편을 1차 항체의 40배량 사용한 경우의 흡광도가 30％ 이상 감소, 또는 1차 항체의 80배량 사용한 경우의 흡광도가 50％ 이상 감소하면, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III을 보다 강하게 인식함을 확인할 수 있다.
본 발명에 사용하는 항체 P30(A)로서는, 예를 들어 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 들 수 있다. 감도의 관점에서 모노클로날 항체인 것이 바람직하다. 항체 P30(A)는, 예를 들어 Fucal Research사로부터, 상품명: Mp-P30-3-AB를 구입하고, 입수할 수 있다.
이어서, 도면을 참조하면서 본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 장치의 일 실시 형태에 대하여 설명한다. 또한, 본 명세서에 있어서, 「고정」이란, 항체가 이동하지 않도록 막 등의 담체에 배치되어 있음을 의미하고, 「유지」란, 막 등의 담체 중 또는 표면을 이동 가능하게 배치됨을 의미한다.
본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 장치의 일 실시 형태로서는, 도 1에 도시하는 바와 같이, 시료 첨가부(샘플 패드라고도 함)(1), 표지 물질 유지부(콘쥬게이트 패드라고도 함)(2), 크로마토그래프 매체부(3), 검출부(4), 흡수부(5) 및 배킹 시트(6)로 구성되어 있다.
시료 첨가부(1)는, 면역 크로마토그래피 분석 장치에 있어서, 검체를 함유하는 시료를 첨가하는 부위이다. 시료 첨가부(1)에서는 시료가 신속하게 흡수되지만, 빠르게 시료가 이동해 가는 성질의 다공질 시트로 구성할 수 있다. 다공질 시트로서는, 예를 들어 셀룰로오스 여과지, 유리 섬유, 폴리우레탄, 폴리아세테이트, 아세트산셀룰로오스, 나일론, 면포 등을 들 수 있다.
표지 물질 유지부(2)는, 후술하는 표지 물질(마커 물질)을 함유하고 있고, 해당 표지 물질은 상기 항체 P30(A)와 결합한 표지 항체(이하 간단히 표지 항체라고도 함)로서 표지 물질 유지부(2)에 유지되어 있다. 표지 물질 유지부 내를 검체가 이동할 때, 상기 표지 항체와 검체 중의 마이코플라스마ㆍ뉴모니에가 결합한다. 표지 물질 유지부(2)에는, 유리 섬유, 셀룰로오스 등의 막이 통상 사용된다.
표지 물질 유지부 중의 표지 항체의 함유량은, 통상 0.06 내지 0.25㎍/장치이고, 바람직하게는 0.1 내지 0.2㎍/장치이고, 보다 바람직하게는 0.1 내지 0.15㎍/장치이다. 또한, 표지 물질 유지부의 단위 면적당 표지 항체의 함유량은, 통상 0.1 내지 0.42㎍/㎠이고, 바람직하게는 0.17 내지 0.33㎍/㎠이고, 보다 바람직하게는 0.17 내지 0.25㎍/㎠이다.
면역 크로마토그래피 분석에 있어서의 검출 시약의 표지에는, 일반적으로 효소 등도 사용되지만, 피검출 물질의 존재를 눈으로 판정하는 데 적합하다는 점에서, 표지 물질로서는 불용성 담체를 사용하는 것이 바람직하다. 항체 P30(A)를 불용성 담체에 감작시킴으로써 표지화한 검출 시약을 조제할 수 있다. 또한, 항체 P30(A)를 불용성 담체에 감작시키는 수단은, 공지된 방법에 따르면 된다.
표지 물질로서의 불용성 담체에는, 금, 은 혹은 백금 등의 금속 입자, 산화철 등의 금속 산화물 입자, 황 등의 비금속 입자 및 합성 고분자를 포함하는 라텍스 입자, 또는 그 밖의 불용성 담체를 사용할 수 있다. 상술한 바와 같이 불용성 담체는, 피검출 물질의 존재를 시각적으로 판정하기에 적합한 표지 물질이며, 눈에 의한 판정을 용이하게 하기 위해서는 유색인 것이 바람직하다. 금속 입자 및 금속 산화물 입자는, 그 자체가 입경에 따른 특정한 자연색을 나타내는 것이며, 그 색채를 표지로서 이용할 수 있다.
특히, 금 입자가, 검출이 간편하고, 또한 응집하기 어렵고 비특이적인 발색이 일어나기 어렵다는 점에서 바람직하다. 금 입자의 평균 입경은, 예를 들어 10nm 내지 250nm, 바람직하게는 35nm 내지 120nm이다. 평균 입경은, 투과형 전자 현미경(TEM: 니혼 덴시(주)제, JEM-2010)에 의해, 촬영한 투영 사진을 사용하여 무조작으로 100개의 입자를 입자의 투영 면적 원 상당 직경을 계측하고, 그 평균값으로부터 산출할 수 있다.
표지 물질 유지부가 함유하는 금 입자는, 표지 물질 유지부의 단위 면적당, 통상 0.25 내지 0.7㎍/㎠이고, 바람직하게는 0.3 내지 0.65㎍/㎠이고, 보다 바람직하게는 0.4 내지 0.6㎍/㎠이다. 상기 범위로 설정함으로써, 표지된 입자가 분산된 채 전개되고, 항체의 인식 부위가 저해되지 않고 고감도화할 수 있기 때문이다.
크로마토그래프 매체부(3)는, 크로마토그래프의 전개 부위이다. 크로마토그래프 매체부(3)는, 모관 현상을 나타내는 미세 다공성 물질을 포함하는 불활성의 막이다. 크로마토그래프에서 사용되는 검출 시약, 고정화 시약 또는 피검출 물질 등과 반응성을 갖지 않는다는 관점에서, 또한, 본 발명의 효과가 향상된다고 하는 관점에서, 예를 들어 니트로셀룰로오스제의 멤브레인(이하, 니트로셀룰로오스 멤브레인이라고도 함)이나, 아세트산셀룰로오스제의 멤브레인(이하, 아세트산셀룰로오스 멤브레인이라고도 함)이 바람직하고, 니트로셀룰로오스 멤브레인이 더욱 바람직하다. 또한, 셀룰로오스류 멤브레인, 나일론 멤브레인 및 다공질 플라스틱포류(폴리에틸렌, 폴리프로필렌)도 사용 가능하다.
니트로셀룰로오스 멤브레인으로서는, 니트로셀룰로오스가 주체로 포함되어 있으면 되며, 순품 또는 니트로셀룰로오스 혼합품 등 니트로셀룰로오스를 주재로 하는 멤브레인을 사용할 수 있다.
니트로셀룰로오스 멤브레인은, 또한 모세관 현상을 촉진시키는 물질을 함유시킬 수도 있다. 해당 물질로서는, 막면의 표면 장력을 저하시키고, 친수성을 초래하는 물질이 바람직하다. 예를 들어, 당류, 아미노산의 유도체, 지방산 에스테르, 각종 합성 계면 활성제 또는 알코올 등의 양친매성의 작용을 갖는 물질이며, 피검출 물질의 이동에 영향이 없고, 표지 물질의 발색에 영향을 미치지 않는 물질이 바람직하다.
니트로셀룰로오스 멤브레인은 다공성이며, 모세관 현상을 나타낸다. 이 모세관 현상의 지표는, 흡수 속도(흡수 시간: capillary flow time)를 측정함으로써 확인할 수 있다. 흡수 속도는, 검출 감도와 검사 시간에 영향을 미친다.
상기와 같은 니트로셀룰로오스 멤브레인이나 아세트산셀룰로오스 멤브레인으로 대표되는 크로마토그래프 매체부(3)의 형태 및 크기는 특별히 제한되는 것은 아니며, 실제의 조작점 및 반응 결과의 관찰점에 있어서 적절하면 된다.
또한, 조작을 보다 간편하게 하기 위해서는, 크로마토그래프 매체부(3)의 이면에, 플라스틱 등을 포함하는 지지체를 설치하는 것이 바람직하다. 이 지지체의 성상은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 눈으로 판정함으로써 측정 결과의 관찰을 행하는 경우에는, 지지체는, 표지 물질에 의해 초래되는 색채와 유사하지 않은 색채를 갖는 것이면 바람직하며, 통상, 무색 또는 백색인 것이 바람직하다.
검출부(4)는, 상기 크로마토그래프 매체부(3) 상에 형성된다. 즉, 피검출 물질의 마이코플라스마ㆍ뉴모니에와 결합하는 상기 항체 P30(A)가, 크로마토그래프 매체부(3) 상의 임의의 위치에 고정화된다. 상기 항체 P30(A)의 고정화는 통상법에 따라 행할 수 있다.
검출부(4)에 있어서의 항체 P30(A)의 함유량은, 통상 0.1 내지 2.5㎍/장치이고, 바람직하게는 0.3 내지 2.0㎍/장치이고, 보다 바람직하게는 0.3 내지 1.0㎍/장치이다. 또한, 검출부(4)의 단위 면적당 항체 P30(A)의 함유량은, 통상 0.04 내지 1.0g/㎠이고, 바람직하게는 0.125 내지 0.8㎍/㎠이고, 보다 바람직하게는 0.125 내지 0.42㎍/㎠이다.
또한, 크로마토그래프 매체부(3) 상에는, 비특이적인 흡착에 의해 분석의 정밀도가 저하되는 것을 방지하기 위해, 필요에 따라, 크로마토그래프 매체부(3)에, 공지된 방법으로 블로킹 처리를 행할 수 있다. 일반적으로 블로킹 처리는 소 혈청 알부민, 탈지유, 카제인 또는 젤라틴 등의 단백질이 적합하게 사용된다. 이러한 블로킹 처리 후에, 필요에 따라, 예를 들어 Tween20, Triton X-100 또는 SDS 등의 계면 활성제를 1개 또는 2개 이상 조합하여 세정해도 된다.
흡수부(5)는, 크로마토그래프 매체부(3)의 말단에, 검출부(4)를 통과한 검체나 전개액 등의 액체를 흡수시키기 위해 설치된다. 본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 장치에 있어서, 흡수부(5)는, 예를 들어 유리 섬유, 펄프, 셀룰로오스 파이버 등, 또는 그들 부직포에 아크릴산 중합체 등의 고분자, 에틸렌옥사이드기 등을 갖는 친수성 약제를 함유시킨 것이 사용되고, 특히 바람직하게는 유리 섬유이다. 흡수부(5)가 유리 섬유를 포함함으로써, 시료액의 액 복귀를 대폭 저감할 수 있다.
배킹 시트(6)는 기재이다. 편면에 점착제를 도포하거나, 점착 테이프를 첩부함으로써, 편면이 점착성을 갖고, 해당 점착면 상에 시료 첨가부(1), 표지 물질 유지부(2), 크로마토그래프 매체부(3), 검출부(4) 및 흡수부(5)의 일부 또는 전부가 밀착되어 설치되어 있다. 배킹 시트(6)는, 점착제에 의해 시료액에 대하여 불투과성, 비투습성으로 되는 것이면, 기재로서는, 특별히 한정되지 않는다.
상기와 같이 하여 제작한 면역 크로마토그래피 분석 장치는, 제품화하기 전에, 통상 건조 처리가 실시된다. 건조 온도는 예를 들어 20 내지 50℃, 건조 시간은 0.5 내지 1시간이다.
본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 키트는, 상기 면역 크로마토그래피 분석 장치와, 검체를 희석하여 전개하기 위한 검체 희석액을 포함한다.
본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 키트에 있어서 검체 희석액은, 전개액으로서도 사용할 수 있는 것이지만, 통상 용매로서 물을 사용하고, 이것에 완충액, 염 및 비이온성 계면 활성제, 또한 예를 들어 항원 항체 반응의 촉진 또는 비특이적 반응을 억제하기 위한 단백질, 고분자 화합물(PVP 등), 이온성 계면 활성제 혹은 폴리음이온, 또는 항균제, 킬레이트제 등등의 1종 혹은 2종 이상을 첨가해도 된다.
특히, Mycoplasma pneumonia의 세포 접착 기관에 존재하는 단백질 복합체(P1, P90, P40, P30)로부터 P30을 단리하고, 항 P30 항체의 항원 인식 부위를 노출시키기 위해 비이온성 계면 활성제를 검체 희석액에 함유시키는 것이 바람직하다. 비이온성 계면 활성제로서는, 예를 들어 Triton X-100(상품명, 폴리에틸렌글리콜모노-p-이소옥틸페닐에테르), Tween20(상품명, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트), NP-40(상품명 노니테드 40), Brij35를 들 수 있고, 1종 혹은 2종 이상을 첨가해도 된다.
바람직하게는, 검체 희석액이 함유하는 비이온성 계면 활성제의 50％ 이상이, HLB값이 13 내지 18인 비이온성 계면 활성제이다. 더욱 바람직하게는, 검체 희석액이 함유하는 비이온성 계면 활성제의 60％ 이상이, HLB값이 13 내지 17인 비이온성 계면 활성제이고, 특히 바람직하게는, 검체 희석액이 함유하는 비이온성 계면 활성제의 100％가, HLB값이 13 내지 17인 비이온성 계면 활성제이다. 구체적으로는, Triton X-100(HLB값: 13.7)과 Tween20(HLB값: 16.7)의 2종을, 질량 비율로 1:1의 비율로 함유시키는 것이 바람직하다.
검체 희석액을 전개액으로서 사용하는 경우에는, 검체와 전개액을 미리 혼합한 것을, 시료 첨가부 상에 공급ㆍ적하하여 전개시킬 수도 있고, 우선 검체를 시료 첨가부 상에 공급ㆍ적하한 후, 전개액을 시료 첨가부 상에 공급ㆍ적하하여 전개시켜도 된다.
본 발명의 면역 크로마토그래피 분석 방법은 이하의 공정 (1) 내지 (4)를 포함하고, 상기 면역 크로마토그래피 분석 장치를 사용하여 검체에 포함되는 피검출 물질의 마이코플라스마ㆍ뉴모니에를 검출한다.
(1) 검체 희석액에 의해 검체를 희석한 검체 함유액을 시료 첨가부에 첨가하는 공정
(2) 표지 물질 유지부에 유지되어 있는, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III을 강하게 인식하는 항체(이하, 항체 P30(A)라고 표기함)에 의해 마이코플라스마ㆍ뉴모니에를 인식시키는 공정
(3) 상기 검체 및 항체 P30(A)를 이동상으로 하여 크로마토그래프 매체부에 전개시키는 공정
(4) 전개된 이동상 중의 마이코플라스마ㆍ뉴모니에를 검출부에 포함되는 항체 P30(A)에 의해 검출하는 공정
각 공정에 대하여 이하에 설명한다.
(1) 검체 희석액에 의해 검체를 희석한 검체 함유액을 시료 첨가부에 첨가하는 공정
공정 (1)에서는, 첫 번째, 검체를, 측정 정밀도를 저하시키지 않고, 면역 크로마토그래프 매체 중에 원활하게 이동할 정도의 농도로, 검체 희석액으로 조정 또는 희석하여 검체 함유액으로 하는 것이 바람직하다. 검체 희석액은 상술한 것을 사용할 수 있다. 두 번째, 검체 함유액을 시료 첨가부(1) 상에, 소정량(통상, 0.1 내지 2mL) 적하한다. 검체 함유액이 적하되면, 검체 함유액은 시료 첨가부(1) 중에서 이동을 개시한다.
본 발명에 있어서 사용하는 검체는, 피검출 물질인 마이코플라스마ㆍ뉴모니에를 포함할 가능성이 있는 검체이며, 예를 들어 생체 시료 중, 인두 닦기액, 비강 닦기액, 비강 흡인액, 비강 세정액, 객담, 폐포 세정액 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
(2) 표지 물질 유지부에 유지되어 있는, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III을 강하게 인식하는 항체(이하, 항체 P30(A)라고 표기함)에 의해 마이코플라스마ㆍ뉴모니에를 인식시키는 공정
공정 (2)는, 공정 (1)에 있어서 시료 첨가부에 첨가된 검체 함유액을, 표지 물질 유지부(2)로 이동시키고, 표지 물질 유지부에 유지되어 있는 표지 물질이 결합한 항체 P30(A)에 의해 검체 중의 피검출 물질인 마이코플라스마ㆍ뉴모니에에 있어서의, P30 단백질의 도메인 III을 인식시키는 공정이다.
표지 물질은 상기의 것을 사용할 수 있다. 상기 표지 물질이 결합한 항체 P30(A)는, P30 단백질의 도메인 III의 아미노산 서열 중, 상기 특정한 반복 서열의 일부를 인식하여 결합한다.
(3) 상기 검체 및 항체 P30(A)를 이동상으로 하여 크로마토그래프 매체부에 전개시키는 공정
공정 (3)은, 공정 (2)에 있어서 피검출 물질인 마이코플라스마ㆍ뉴모니에가 표지 물질 유지부에 있어서 표지 물질이 결합한 항체 P30(A)에 인식된 후, 검체 및 항체 P30(A)를, 크로마토그래프 매체부 상에 이동상으로 하여 통과시키는 공정이다.
(4) 전개된 이동상 중의 마이코플라스마ㆍ뉴모니에를, 검출부에 포함되는 항체 P30(A)에 의해 검출하는 공정
공정 (4)는, 크로마토그래프 매체부 상에 이동상으로 하여 통과한 검체 중의 마이코플라스마ㆍ뉴모니에가, 항원ㆍ항체의 특이적 결합 반응에 의해, 검출부에 고정되어 있는 항체 P30(A)와, 상기 공정 (2)에 있어서 표지 물질이 결합한 항체 P30(A)에 의해 샌드위치형으로 끼워지도록 특이적으로 반응 결합하여, 검출부가 착색되는 공정이다.
본 공정 (4)에서는, 검출부에 고정화된 항체 P30(A)가, 표지 물질 유지부에 유지된 항체 P30(A)가 결합한 개소와 다른 개소에 존재하는 동일한 반복 서열에 샌드위치형으로 끼워지도록 결합한다.
피검출 물질인 마이코플라스마ㆍ뉴모니에가 존재하지 않는 경우에는, 시료의 수분에 용해된 표지 시약은, 크로마토그래프 매체부 상의 검출부를 통과해도 특이적 결합 반응이 일어나지 않으므로, 검출부가 착색되지 않는다.
마지막으로, 검체 함유액의 수분은, 흡수부(5)로 이동한다.
<실시예>
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더 설명하지만, 본 발명은 하기 예에 제한되는 것은 아니다.
[시험예 1]
본 시험에서는, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III을 인식하는 종류가 상이한 2개의 항체를 준비하고, 각각 항체가 P30 단백질의 도메인 III의 어느 부위를 인식하는지를 조사하였다. 사용한 항체는, Fucal Research사, 상품명: Mp-P30-3-AB(이하, 항체 P30(a)라고 표기함)와, Fucal Research사, 상품명: Mp-P30-9-AB(이하, 항체 P30(b)라고 표기함)의 2종류이다. 이 항체 P30(a) 및 항체 P30(b)가, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III의 어느 개소에 결합하는지를, 하기의 면역 크로마토그래피 분석법에 의해 검증하였다.
우선, 상기 도메인 III에 있어서의 3종류의 아미노산의 반복 서열(서열 번호 3 내지 5) 중 어느 것을 포함하는 이하의 2종류의 펩티드를 펩티드의 화학 합성법의 통상의 방법인 펩티드 고상 합성법에 의해 제작하였다.
펩티드 1: PGMAPRPGMPPHPGMAPR(서열 번호 6)
펩티드 2: PGMAPRPGFPPQPGMAPR(서열 번호 7)
상기 펩티드 1은, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열(PGMPPH)과 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열(PGMAPR)을 갖는 펩티드이다. 상기 펩티드 2는, 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열(PGFPPQ)과 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열(PGMAPR)을 갖는 펩티드이다.
항체 P30(a) 또는 항체 P30(b)가 도메인 III의 어느 개소에 결합하는지는, 이하와 같이 하여 판정 가능하다.
(1) 시료 첨가부의 제작
시료 첨가부로서 유리 섬유를 포함하는 부직포(밀리포어사제: 300mm×30mm)를 사용하였다.
(2) 표지 물질 유지부의 제작
금 콜로이드 현탁액(다나카 기킨조쿠 고교사제: LC40nm) 0.5mL에, 인산 완충액(pH7.4)으로 0.05mg/mL의 농도가 되도록 희석한 항체 P30(a)(Fucal Research사, 상품명: Mp-P30-3-AB)를 0.1mL 첨가하고, 실온에서 10분간 정치하였다.
이어서, 1질량％의 소 혈청 알부민(BSA)을 포함하는 인산 완충액(pH7.4)을 0.1mL 첨가하고, 실온에서 10분간 더 정치하였다. 그 후, 충분히 교반한 후, 8000×g으로 15분간 원심 분리를 행하여 상청을 제거한 후, 1질량％의 BSA를 포함하는 인산 완충액(pH7.4)을 0.1mL 첨가하였다. 이상의 수순으로 표지 물질 용액을 제작하였다.
상기 제작한 표지 물질 용액 300μL에 300μL의 10질량％ 트레할로오스 수용액과 1.8mL의 증류수를 첨가한 것을 12mm×300mm의 유리 섬유 패드(밀리포어사제)에 균일해지도록 첨가한 후, 진공 건조기로 건조시켜, 표지 물질 유지부를 제작하였다.
(3) 크로마토그래프 매체부 및 검출부의 제작
멤브레인으로서 니트로셀룰로오스를 포함하는 시트(밀리포어사제, 상품명: HF120, 300mm×25mm)를 사용하였다.
이어서, 5질량％의 이소프로필알코올을 포함하는 인산 완충액(pH7.4)으로 1.0mg/mL의 농도가 되도록, 상기 항체 P30(a)를 희석한 용액 150μL를, 건조된 멤브레인 상의 검출 부위(검출 라인)에 1mm의 폭으로 면역 크로마토그래피용 디스펜서 「XYZ3050」(BIODOT사제)을 사용하여 1μL/mm의 양(1 시트당 25μL)으로 라인형으로 도포하였다.
또한, 금 입자 표지 시약의 전개 유무나 전개 속도를 확인하기 위해 검출 부위의 하류에, 금 입자 표지 물질과 널리 친화성을 갖는 염소 유래 항혈청을 인산 완충액(pH7.4)으로 희석한 액을 컨트롤 부위(컨트롤 라인)에 도포하였다. 그 후, 50℃에서 30분간 건조시키고, 실온에서 밤새 건조시켜, 크로마토그래프 매체부 및 검출부를 제작하였다.
(4) 면역 크로마토그래피 분석 장치의 제작
이어서, 배킹 시트를 포함하는 기재에, 시료 첨가부, 표지 물질 유지부, 검출부를 갖는 크로마토그래프 매체부, 전개한 시료나 표지 물질을 흡수하기 위한 흡수부로서 유리 섬유제의 부직포를 순차적으로 접합하였다. 그리고, 재단기로 폭이 5mm가 되도록 재단하고, 면역 크로마토그래피 분석 장치로 하였다. 또한, 표지 물질 유지부의 시료 전개 방향의 길이를 12mm로 하였다.
(5) 검체 희석액
1질량％의 비이온성 계면 활성제 나카라이테스크사제 NP-40(상품명: 노니데트 P-40, HLB값 17.7), 니치유사제 상품명 노니데트 MN-811(HLB값 9.3)의 1:1 혼합물을 포함하는 50mM의 HEPES 완충액(pH7.5)을 조제하고, 검체를 희석 처리하기 위한 검체 희석액으로 하였다.
(6) 측정
마이코플라스마ㆍ뉴모니에 및 펩티드 1 또는 펩티드 2를 함유하는 검체 시료를 사용하여, 상기 제작한 면역 크로마토그래피 분석 장치를 사용한 경우의, 검출부에 있어서의 발색 강도를 측정하였다. 마이코플라스마ㆍ뉴모니에를 함유하는 검체 시료로는, Mycoplasma pneumonia P30((아미노산 96-274)를, 대장균을 이용한 통상의 방법으로 발현, 정제한 단백질 P30Ag)을 사용하였다. 이 P30Ag를 상기 추출액으로 목적 농도 10pg/mL로 조정하고, 또한 펩티드 1 또는 펩티드 2가 400ng 전개되도록, 펩티드 1 또는 펩티드 2를 조제하고, 검체 시료로 하였다.
상기 검체 시료 150μL를 면역 크로마토그래피 분석 장치의 시료 첨가부 상에 얹어 전개시키고, 검출부의 착색 정도(발색 강도)를 덴시토미터에 의해 측정하였다(표 중의 단위는 mAbs).
<판정 방법>
펩티드 1로 저해되고 펩티드 2로 저해되지 않는 경우: 항체는, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열(PGMPPH)에 결합한다.
펩티드 1로 저해되지 않고 펩티드 2로 저해되는 경우: 항체는, 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열(PGFPPQ)에 결합한다.
펩티드 1로 저해되고 펩티드 2로도 저해되는 경우: 항체는, 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열(PGMAPR)에 결합한다.
또한, 펩티드 1 또는 펩티드 2를 검체인 P30Ag와 함께 전개시킴으로써 저해가 발생하였다고 생각되는 메커니즘을 이하에 설명한다. 펩티드 1 및 펩티드 2는 검체인 P30Ag와 비교하여 분자량이 훨씬 작고, 또한 전개시키는 양도 훨씬 많기 때문에, P30Ag보다 빠르게 표지 물질 유지부에 도달하고, 동 부위에 유지된 항체와 결합하여 검출부 쪽으로 전개된다. 그러나, 펩티드 1 및 펩티드 2가 갖는 항체 결합 부위는 P30Ag와 비교하여 훨씬 적으므로(1 내지 2개소), 항체가 이미 결합한 상태의 대부분의 상기 펩티드는, 검출부에 고정된 항체를 결합할 수 있는 개소가 적거나 혹은 존재하지 않고, 대부분의 펩티드가 검출부로 포착되지 않은 채 흡수부로 흘러 감으로써 검출부에 포착되어 퇴적되는 표지 물질이 감소함으로써 발색 강도가 감소한다. 한편, 표지 물질 유지부에 유지된 항체는, P30Ag보다 먼저 펩티드 1 및 펩티드 2에 결합함으로써, 나중에 전개되는 P30Ag에 결합하는 해당 항체의 양이, 펩티드 1 또는 펩티드 2가 존재하지 않는 경우와 비교하여 적어지기 때문에, 검출부에서 포착되는 P30Ag는, 해당 항체가 결합하지 않은 것이 상대적으로 많아지고, 그 결과 검출부에서 검출되는 P30Ag에 기인하는 발색 강도가 낮아져, 저해가 생긴다고 하는 것이 된다.
본 시험에서는, 항체 P30(a)를 사용하고, 또한 상기 펩티드 1 및 2 모두를 사용하지 않은 경우, 항체 P30(a)를 사용하고, 또한 펩티드 1을 사용한 경우, 항체 P30(a)를 사용하고, 또한 펩티드 2를 사용한 경우의 3 패턴에 대하여, 면역 크로마토그래피 분석을 행하고, 발색 강도를 측정한 결과를 표 1에 나타낸다.
또한, 항체 P30(a)를 항체 P30(b)로 변경하여 동일한 시험을 행한 결과를 표 2에 나타낸다.
Figure pct00001
Figure pct00002
표 1의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 항체 P30(a)에 대하여, 펩티드 없음의 경우와 비교하여, 펩티드 1을 사용한 경우 및 펩티드 2를 사용한 경우의 어느 경우도 발색 강도가 감소되어 있고, 항체 P30(a)는 펩티드 1 및 펩티드 2의 어느 것에도 저해를 받음을 알 수 있다. 따라서, 항체 P30(a)는 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열(PGMAPR)을 인식함을 알 수 있었다.
또한, 표 2의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 항체 P30(b)에 대하여, 펩티드 없음의 경우와 비교하여, 펩티드 1을 사용한 경우에는, 발색 강도에 변화는 보이지 않았지만, 펩티드 2를 사용한 경우에는 발색 강도가 감소되어 있고, 항체 P30(b)는 펩티드 1의 저해를 받지 않고 펩티드 2의 저해를 받음을 알 수 있다. 따라서, 항체 P30(b)는 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열(PGFPPQ)을 인식함을 알 수 있었다.
[시험예 2]
본 시험에서는, 하기 시험예 3에서 제작하는 본원 발명의 면역 크로마토그래피 장치에 사용하는, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III을 인식하는 항체(항체 P30(a))가, 해당 도메인 III을 「강하게」 인식하는 항체인지를 확인하기 위해, 단락 [0025] 내지 [0030]에 기재된 ELISA법에 의한 시험 및 단락 [0032] 내지 [0039]에 기재된 경합 저해 ELISA 시험을 행하였다.
우선, 시험예 1에서 사용한 항체 P30(a)가 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III을 강하게 인식하는 항체인지 여부를 확인하기 위해, 단락 [0025] 내지 [0030]에 기재된 프로토콜에 따라 ELISA법에 의한 시험을 행하였다. 구체적으로는, 항체 P30(a)가, 블랭크를 뺀 450nm의 흡광도가 0.2Abs 이상이 되는 항체인지 여부를, 이하와 같이 실험하였다.
우선, Nunc Immuno modules(Thermo Fisher Scientific사제, 코드 469949) ELISA용 96웰 플레이트에 Mycoplasma pneumonia P30((아미노산 96-274)를, 대장균을 이용한 통상의 방법으로 발현, 정제한 단백질 P30Ag) 4ng/mL in 50mM 탄산 버퍼 pH9.5를 100μL 첨가하고, 4℃에서 16시간 인큐베이트하였다. 16시간 후, P30 용액을 제거하고, 웰을 300μL PBST(0.05％ Tween20 in PBS)로 3회 워시하고, 웰에 남은 액은, 페이퍼 타올에 털어서 제거하였다. 블로킹액으로서, 5％ BSA in PBST(BSA: 오리엔탈 고보사제)를 300μL 첨가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이트하였다. 그 후 BSA 용액을 제거하고, 웰을 300μL PBST(0.05％ Tween20 in PBS)로 3회 워시하고, 웰에 남은 액은, 페이퍼 타올에 털어서 제거하였다.
1차 항체로서 상기 항체 P30(a) 5㎍/mL in 50％ 블로킹 용액(일 항체 용액) 100μL를 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 인큐베이트한 후, 1차 항체 용액을 제거하고, 웰을 300μL PBST(0.05％ Tween20 in PBS)로 3회 워시하였다.
2차 항체로서, Anti Mouse IgG(H+L), Rabbit, IgG Whole, Peroxidase Cojugated(와코 쥰야쿠사제, 코드 014-17611) 1mg/mL를 100μL 웰에 첨가하고, 37℃ 1.5시간 인큐베이트하였다. 그 후 BSA 용액을 제거하고, 웰을 300μL PBST(0.05％ Tween20 in PBS)로 3회 워시하고, 웰에 남은 액은, 페이퍼 타올에 털어서 제거하였다.
웰에 발색 기질로서 Sure Blue Reserve TMB Microwell Peroxidase Substrate(1-Component)(KPL사제, 코드 53-00-01)를 100μL 첨가하고, 15분 반응시키고, 2N 황산을 100μL 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 마이크로플레이트 리더(BIORAD사제)로 450nm의 흡광도를 측정하였다.
상기 방법으로 ELISA 시험을 행한바, 블랭크(1차 항체를 넣지 않고 2차 항체, 발색 반응을 행한 웰)의 흡광도를 뺀 450nm의 흡광도가 0.403Abs이며, 0.2Abs 이상임이 확인되었다. 즉, 항체 P30(a)가 「마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III을 강하게 인식함」이 확인되었다.
이어서, 이 항체 P30(a)가, 「마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III을 강하게 인식하는」 항체인지 여부를 더 확인하기 위해, 단락 [0032] 내지 [0039]에 기재된 프로토콜에 따라 경합 저해 ELISA 시험(간접 경합법)을 행하였다. 구체적으로는, 항체 P30(a)를 사용하여 경합 저해 ELISA 시험을 행한 결과, 흡광도가 30％ 이상 감소하는지 여부를, 이하와 같이 실험하였다.
Nunc Immuno modules(Thermo Fisher Scientific사제, 코드 469949) ELISA용 96웰 플레이트에, 전체 길이 단백질의 Mycoplasma pneumonia P30(아미노산 1-274: 서열 번호 1) 4ng/mL in 50mM 탄산 버퍼 pH9.5를 100μL 첨가하고, 4℃에서 16시간 인큐베이트하였다. 16시간 후, P30 용액을 제거하고, 웰을 300μL PBST(0.05％ Tween20 in PBS)로 3회 워시하였다. 웰에 남은 액은, 페이퍼 타올에 털어서 제거하였다.
블로킹액으로서, 5％ BSA in PBST(BSA: 오리엔탈 고보사제)를 300μL 첨가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이트한다. 그 후 BSA 용액을 제거하고, 웰을 300μL PBST(0.05％ Tween20 in PBS)로 3회 워시하였다. 웰에 남은 액은, 페이퍼 타올에 털어서 제거하고, 전체 길이 단백질 고정 웰을 작성하였다.
이어서, 전체 길이 단백질 고정 웰에 1차 항체로서, 항 Mycoplasma pneumoniae P30 항체(항체 P30(a)) 5㎍/mL in 50％ 블로킹 용액 100μL를 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 인큐베이트하였다. 그 후 1차 항체 용액을 제거하고, 웰을 300μL PBST(0.05％ Tween20 in PBS)로 3회 워시하였다.
또한, 상기 1차 항체만을 첨가한 것과는 별도로, 1차 항체의 항 Mycoplasma pneumoniae P30 항체(항체 P30(a)) 5㎍/mL와, 상기 1차 항체 P30(a)의 40배량인, 시험예 1에서 사용한 상기 펩티드 1(서열 번호 6: PGMAPRPGMPPHPGMAPR) 또는 펩티드 2(서열 번호 7: PGMAPRPGFPPQPGMAPR)를 포함하는 50％ 블로킹 용액 100μL를 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 인큐베이트하였다. 그 후 1차 항체 용액을 제거하고, 웰을 300μL PBST(0.05％ Tween20 in PBS)로 3회 워시하였다.
2차 항체로서, Anti Mouse IgG(H+L), Rabbit, IgG Whole, Peroxidase Cojugated(와코 쥰야쿠사제, 코드 014-17611) 1mg/mL를 100μL, 상기 작성한 2종의 각각의 웰에 첨가하고, 37℃, 1.5시간 인큐베이트하였다. 그 후 BSA 용액을 제거하고, 웰을 300μL PBST(0.05％ Tween20 in PBS)로 3회 워시하였다. 웰에 남은 액은, 페이퍼 타올에 털어서 제거하였다.
웰에 발색 기질로서, Sure Blue Reserve TMB Microwell Peroxidase Substrate(1-Component)(KPL사제, 코드 53-00-01)를 100μL 첨가하고, 15분 반응시키고, 2N 황산을 100μL 첨가하여 반응을 정지시켰다.
마이크로플레이트 리더(BIORAD사제)로 450nm의 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 1차 항체와 상기 펩티드 1 또는 펩티드 2를 첨가한 웰의 흡광도는, 1차 항체만을 첨가한 웰의 흡광도와 비교하여, 30％ 이상 감소하였음이 확인되었다. 즉, 항체 P30(a)가 「마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III을 강하게 인식함」이 확인되었다.
[시험예 3]
<본원 발명의 면역 크로마토그래피 분석 장치의 제작>
[실시예 1]
(1) 시료 첨가부의 제작
시료 첨가부로서 유리 섬유를 포함하는 부직포(밀리포어사제: 300mm×30mm)를 사용하였다.
(2) 표지 물질 유지부의 제작
금 콜로이드 현탁액(다나카 기킨조쿠 고교사제: LC40nm) 0.5mL에, 인산 완충액(pH7.4)으로 0.05mg/mL의 농도가 되도록 희석한 항체 P30(a)(Fucal Research사, 상품명: Mp-P30-3-AB)를 0.1mL 첨가하고, 실온에서 10분간 정치하였다.
이어서, 1질량％의 소 혈청 알부민(BSA)을 포함하는 인산 완충액(pH7.4)을 0.1mL 첨가하고, 실온에서 10분간 더 정치하였다. 그 후, 충분히 교반한 후, 8000×g으로 15분간 원심 분리를 행하여 상청을 제거한 후, 1질량％의 BSA를 포함하는 인산 완충액(pH7.4)을 0.1mL 첨가하였다. 이상의 수순으로 표지 물질 용액을 제작하였다.
상기 제작한 표지 물질 용액 300μL에 300μL의 10질량％ 트레할로오스 수용액과 1.8mL의 증류수를 첨가한 것을 12mm×300mm의 유리 섬유 패드(밀리포어사제)에 균일해지도록 첨가한 후, 진공 건조기로 건조시켜, 표지 물질 유지부를 제작하였다.
(3) 크로마토그래프 매체부 및 검출부의 제작
멤브레인으로서 니트로셀룰로오스를 포함하는 시트(밀리포어사제, 상품명: HF120, 300mm×25mm)를 사용하였다.
이어서, 5질량％의 이소프로필알코올을 포함하는 인산 완충액(pH7.4)으로 1.0mg/mL의 농도가 되도록, 상기 항체 P30(a)를 희석한 용액 150μL를, 건조된 멤브레인 상의 검출 부위(검출 라인)에 1mm의 폭으로 면역 크로마토그래피용 디스펜서 「XYZ3050」(BIODOT사제)을 사용하여 1μL/mm의 양(1 시트당 25μL)으로 라인형으로 도포하였다.
또한, 금 입자 표지 시약의 전개 유무나 전개 속도를 확인하기 위해 검출 부위의 하류에, 금 입자 표지 물질과 널리 친화성을 갖는 염소 유래 항혈청을 인산 완충액(pH7.4)으로 희석한 액을 컨트롤 부위(컨트롤 라인)에 도포하였다. 그 후, 50℃에서 30분간 건조시키고, 실온에서 밤새 건조시켜, 크로마토그래프 매체부 및 검출부를 제작하였다.
(4) 면역 크로마토그래피 분석 장치의 제작
이어서, 배킹 시트를 포함하는 기재에, 시료 첨가부, 표지 물질 유지부, 검출부를 갖는 크로마토그래프 매체부, 전개한 시료나 표지 물질을 흡수하기 위한 흡수부로서 유리 섬유제의 부직포를 순차적으로 접합하였다. 그리고, 재단기로 폭이 5mm가 되도록 재단하고, 면역 크로마토그래피 분석 장치로 하였다. 또한, 표지 물질 유지부의 시료 전개 방향의 길이를 12mm로 하였다.
(5) 검체 희석액
1질량％의 비이온성 계면 활성제 나카라이테스크사제 NP-40(상품명: 노니데트 P-40, HLB값 17.7), 니치유사제 상품명 노니데트 MN-811(HLB값 9.3)의 1:1 혼합물을 포함하는 50mM의 HEPES 완충액(pH7.5)을 조제하고, 검체를 희석 처리하기 위한 검체 희석액으로 하였다.
(6) 측정
마이코플라스마ㆍ뉴모니에를 함유하는 검체 시료를 사용하여, 상기 제작한 면역 크로마토그래피 분석 장치를 사용한 경우의, 검출부에 있어서의 발색 강도를 측정하였다. 마이코플라스마ㆍ뉴모니에를 함유하는 검체 시료로는, 시판 중인 불활성화 마이코플라스마ㆍ뉴모니에(Meridian사제, 상품명 Mycoplasma pneumoniae Antigen(FH)), 또는 폐렴 마이코플라스마 감염자의 인두 닦기액을 사용하였다. 인두 닦기액은, 시판 중인 면봉을 사용하여 인두를 닦음으로써 피험자 2명의 폐렴 마이코플라스마 감염자로부터 각각 채취하였다.
시판 중인 불활성화 마이코플라스마ㆍ뉴모니에는, 상기 추출액으로 목적 농도로 조정하고, 검체 시료로 하였다(표 3 중, 시판 검체라고 기재).
또한, 채취한 인두 닦기액은, 상기 검체 희석액으로 20배로 희석하고, 검체 시료로 하였다(표 3 중, 피험자 1 및 피험자 2라고 기재).
상기 각각의 검체 시료 150μL를 면역 크로마토그래피 분석 장치의 시료 첨가부 상에 얹어 전개시키고, 검출부의 착색 정도(발색 강도)를 덴시토미터에 의해 측정하였다(표 중의 단위는 mAbs). 결과를 표 3 및 도 2에 나타낸다.
[비교예 1]
검출부에 도포한 항체 희석액 중의 항체 P30(a)를, 시험예 1에서 사용한 항체 P30(b)(Fucal Research사, 상품명: Mp-P30-9-AB)로 변경한 것 이외에는, 실시예 1을 반복하였다. 결과를 표 3 및 도 2에 나타낸다.
또한, 이 항체 P30(b)가, 「마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III을 강하게 인식하는지」 여부를 확인하기 위해, 단락 [0025] 내지 [0030]에 기재된 ELISA법에 의한 시험 및 단락 [0032] 내지 [0039]에 기재된 경합 저해 ELISA 시험을 행하였다.
우선, 항체 P30(b)가 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III을 강하게 인식하는 항체인지 여부를 확인하기 위해, 단락 [0025] 내지 [0030]에 기재된 프로토콜에 따라 ELISA법에 의한 시험을 행하였다. 구체적으로는, 항체 P30(b)가, 블랭크를 뺀 450nm의 흡광도가 0.2Abs 이상이 되는 항체인지 여부를, 이하와 같이 실험하였다.
Nunc Immuno modules(Thermo Fisher Scientific사제, 코드 469949) ELISA용 96웰 플레이트에, Mycoplasma pneumonia P30((아미노산 96-274)를, 대장균을 이용한 통상의 방법으로 발현, 정제한 단백질 P30Ag) 4ng/mL in 50mM 탄산 버퍼 pH9.5를 100μL 첨가하고, 4℃에서 16시간 인큐베이트하였다. 16시간 후, P30 용액을 제거하고, 웰을 300μL PBST(0.05％ Tween20 in PBS)로 3회 워시하고, 웰에 남은 액은, 페이퍼 타올에 털어서 제거하였다. 블로킹액으로서, 5％ BSA in PBST(BSA: 오리엔탈 고보사제)를 300μL 첨가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이트하였다. 그 후 BSA 용액을 제거하고, 웰을 300μL PBST(0.05％ Tween20 in PBS)로 3회 워시하고, 웰에 남은 액은, 페이퍼 타올에 털어서 제거하였다.
1차 항체로서 상기 항체 P30(b) 5㎍/mL in 50％ 블로킹 용액 100μL를 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 인큐베이트한 후, 1차 항체 용액 항체 P30(b)를 제거하고, 웰을 300μL PBST(0.05％ Tween20 in PBS)로 3회 워시하였다.
2차 항체로서, Anti Mouse IgG(H+L), Rabbit, IgG Whole, Peroxidase Cojugated(와코 쥰야쿠사제, 코드 014-17611) 1mg/mL를 100μL, 웰에 첨가하고, 37℃ 1.5시간 인큐베이트하였다. 그 후 BSA 용액을 제거하고, 웰을 300μL PBST(0.05％ Tween20 in PBS)로 3회 워시하고, 웰에 남은 액은, 페이퍼 타올에 털어서 제거하였다.
웰에 발색 기질로서 Sure Blue Reserve TMB Microwell Peroxidase Substrate(1-Component)(KPL사제, 코드 53-00-01)를 100μL 첨가하고, 15분 반응시키고, 2N 황산을 100μL 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 마이크로플레이트 리더(BIORAD사제)로 450nm의 흡광도를 측정하였다.
상기 방법으로 ELISA 시험을 행한바, 블랭크(1차 항체를 넣지 않고 2차 항체, 발색 반응을 행한 웰)의 흡광도를 뺀 450nm의 흡광도가 0.061Abs이며, 0.2Abs 미만임이 확인되었다. 즉, 항체 P30(b)가 「마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III을 강하게 인식하는」 항체가 아님이 확인되었다.
이어서, 이 항체 P30(b)가, 「마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III을 강하게 인식하는」 항체인지 여부를 더 확인하기 위해, 단락 [0032] 내지 [0039]에 기재된 프로토콜을 따라 경합 저해 ELISA 시험(간접 경합법)을 행하고, 흡광도가 30％ 이하로 감소하는지 여부를, 이하와 같이 실험하였다.
Nunc Immuno modules(Thermo Fisher Scientific사제, 코드 469949) ELISA용 96웰 플레이트에, 전체 길이 단백질의 Mycoplasma pneumonia P30(아미노산 1-274: 서열 번호 1) 10ng/mL in 50mM 탄산 버퍼 pH9.5를 100μL 첨가하고, 4℃에서 16시간 인큐베이트하였다. 16시간 후, P30 용액을 제거하고, 웰을 300μL PBST(0.05％ Tween20 in PBS)로 3회 워시하였다. 웰에 남은 액은, 페이퍼 타올에 털어서 제거하였다.
블로킹액으로서, 5％ BSA in PBST(BSA: 오리엔탈 고보사제)를 300μL 첨가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이트한다. 그 후 BSA 용액을 제거하고, 웰을 300μL PBST(0.05％ Tween20 in PBS)로 3회 워시하였다. 웰에 남은 액은, 페이퍼 타올에 털어서 제거하고, 전체 길이 단백질 고정 웰을 작성하였다.
이어서, 전체 길이 단백질 고정 웰에 1차 항체로서, 항 Mycoplasma pneumoniae P30 항체(항체 P30(a)) 5㎍/mL in 50％ 블로킹 용액 100μL를 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 인큐베이트하였다. 그 후 1차 항체 용액을 제거하고, 웰을 300μL PBST(0.05％ Tween20 in PBS)로 3회 워시하였다.
또한, 상기 1차 항체만을 첨가한 것과는 별도로, 1차 항체의 항 Mycoplasma pneumoniae P30 항체(항체 P30(b)) 5㎍/mL와, 1차 항체 P30(b) 양의 40배량인 양, 시험예 1에서 사용한 펩티드 1(서열 번호 6: PGMAPRPGMPPHPGMAPR) 또는 펩티드 2(서열 번호 7: PGMAPRPGFPPQPGMAPR)를 포함하는 50％ 블로킹 용액 100μL를 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 인큐베이트하였다. 그 후 1차 항체 용액을 제거하고, 웰을 300μL PBST(0.05％ Tween20 in PBS)로 3회 워시하였다.
2차 항체로서, Anti Mouse IgG(H+L), Rabbit, IgG Whole, Peroxidase Cojugated(와코 쥰야쿠사제, 코드 014-17611) 1mg/mL를 100μL, 상기 작성한 2종의 각각의 웰에 첨가하고, 37℃, 1.5시간 인큐베이트하였다. 그 후 BSA 용액을 제거하고, 웰을 300μL PBST(0.05％ Tween20 in PBS)로 3회 워시하였다. 웰에 남은 액은, 페이퍼 타올에 털어서 제거하였다.
웰에 발색 기질로서, Sure Blue Reserve TMB Microwell Peroxidase Substrate(1-Component)(KPL사제, 코드 53-00-01)를 100μL 첨가하고, 15분 반응시키고, 2N 황산을 100μL 첨가하여 반응을 정지시켰다.
마이크로플레이트 리더(BIORAD사제)로 450nm의 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 1차 항체와 상기 펩티드 1 또는 펩티드 2를 첨가한 웰의 흡광도는, 1차 항체만을 첨가한 웰의 흡광도와 비교하여, 펩티드 1에서는 감소가 보이지 않고, 펩티드 2에서는 약 22％밖에 감소하지 않아, 그 감소율은 30％ 미만임이 확인되었다. 즉, 항체 P30(b)가 「마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III을 강하게 인식하는」 항체가 아님이 확인되었다.
[비교예 2]
표지 물질 유지부에 첨가한 표지 물질 용액 중의 항체 P30(a) 및 검출부에 도포한 항체 희석액 중의 항체 P30(a)의 양쪽을, 상기 항체 P30(b)로 변경한 것 이외에는, 실시예 1을 반복하였다. 결과를 표 3 및 도 2에 나타낸다.
[비교예 3]
검출부에 도포한 항체 희석액 중의 항체 P30(a)를, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P1 단백질에 대한 항체(Meridian사제, 상품명 MAb to Mycoplasma pneumonia P1(clone B1947M): 이하, 항체 P1(b)라고 표기함)로 변경한 것 이외에는, 실시예 1을 반복하였다. 결과를 표 3 및 도 2에 나타낸다.
[비교예 4]
표지 물질 유지부에 첨가한 표지 물질 용액 중의 항체 P30(a)를, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P1 단백질에 대한 항체(Meridian사제, 상품명 MAb to Mycoplasma pneumonia P1(clone B1948M): 이하, 항체 P1(a)라고 표기함)로 변경한 것 이외에는, 실시예 1을 반복하였다. 결과를 표 3 및 도 2에 나타낸다.
[비교예 5]
표지 물질 유지부에 첨가한 표지 물질 용액 중의 항체 P30(a)를 항체 P1(a)로, 검출부에 도포한 항체 희석액 중의 항체 P30(a)를 항체 P1(b)로 변경한 것 이외에는, 실시예 1을 반복하였다. 결과를 표 3 및 도 2에 나타낸다.
Figure pct00003
[실시예 2]
검체 희석액의 조성을, Triton X-100(와코 쥰야쿠사제, 상품명, 폴리에틸렌글리콜모노-p-이소옥틸페닐에테르, HLB값: 13.7), Tween20(와코 쥰야쿠사제, 상품명, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트, HLB값: 16.7)으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1을 반복하였다. 결과를 표 4 및 도 3에 나타낸다.
[비교예 6]
검출부에 도포한 항체 희석액 중의 항체 P30(a)를 항체 P30(b)로 변경한 것 이외에는, 실시예 2를 반복하였다. 결과를 표 4 및 도 3에 나타낸다.
[비교예 7]
표지 물질 유지부에 첨가한 표지 물질 용액 중의 항체 P30(a) 및 검출부에 도포한 항체 희석액 중의 항체 P30(a)의 양쪽을, 항체 P30(b)로 변경한 것 이외에는, 실시예 1을 반복하였다. 결과를 표 4 및 도 3에 나타낸다.
Figure pct00004
[실시예 3]
검출 검체를, P30 단백질((아미노산 96-274)를, 대장균을 이용한 통상의 방법으로 발현, 정제한 단백질 P30Ag)로 변경하고, 검체 희석액의 조성을, Triton X-100(와코 쥰야쿠사제, 상품명, 폴리에틸렌글리콜모노-p-이소옥틸페닐에테르, HLB값: 13.7), Tween20(와코 쥰야쿠사제, 상품명, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트, HLB값: 16.7) 1:1 혼합물로 변경한 것 이외에는, 실시예 1을 반복하였다. 결과를 표 5 및 도 4에 나타낸다.
[비교예 8]
검출부에 도포한 항체 희석액 중의 항체 P30(a)를 항체 P30(b)로 변경한 것 이외에는, 실시예 3을 반복하였다. 결과를 표 5 및 도 4에 나타낸다.
[비교예 9]
표지 물질 유지부에 첨가한 표지 물질 용액 중의 항체 P30(a) 및 검출부에 도포한 항체 희석액 중의 항체 P30(a)의 양쪽을, 항체 P30(b)로 변경한 것 이외에는, 실시예 3을 반복하였다. 결과를 표 5 및 도 4에 나타낸다.
[비교예 10]
검출부에 도포한 항체 희석액 중의 항체 P30(a)를 항체 P1(b)로 변경한 것 이외에는, 실시예 3을 반복하였다. 결과를 표 5 및 도 4에 나타낸다.
[비교예 11]
표지 물질 유지부에 첨가한 표지 물질 용액 중의 항체 P30(a)를 항체 P1(a)로 변경한 것 이외에는, 실시예 3을 반복하였다. 결과를 표 5 및 도 4에 나타낸다.
[비교예 12]
표지 물질 유지부에 첨가한 표지 물질 용액 중의 항체 P30(a)를 항체 P1(a)에, 검출부에 도포한 항체 희석액 중의 항체 P30(a)를 항체 P1(b)로 변경한 것 이외에는, 실시예 3을 반복하였다. 결과를 표 5 및 도 4에 나타낸다.
Figure pct00005
이상의 결과로부터, 표지 물질 유지부 및 검출부의 양쪽에, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III을 강하게 인식하는 항체 P30(a)를 함유시킨 경우에는(실시예 1 내지 3), 그 이외의 경우(비교예 1 내지 12)와 비교하여, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에, 또는 P30 단백질의 검출 감도가 현저하게 높음을 알 수 있었다.
[시험예 4]
시험예 2에 있어서의 항체 P30(a) 및 비교예 1에 있어서의 항체 P30(b)가, 「마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III을 강하게 인식하는」 항체인지를 확인하기 위해, 경합 저해 ELISA 시험(간접 경합법)을 행하였다. 본 시험에서는, 경합시킬 도메인 III의 단편으로서, 시험예 1에서 사용한 상기 펩티드 1 또는 펩티드 2 중 어느 것을 사용하고, 또한 상기 펩티드의 농도를 하기 표 6, 표 7과 같이 변경하여(×1 내지 ×640), 시험예 2 또는 비교예 1에 기재된 방법과 마찬가지로 하여 경합 저해 ELISA 시험(간접 경합법)을 행하였다. 결과를 표 6, 표 7에 나타낸다. 표 6은, 항체로서 항체 P30(a)를 사용한 결과이고, 표 7은, 항체로서 항체 P30(b)를 사용한 결과이다. 또한, 표 6의 결과를 도 5, 표 7의 결과를 도 6에 도시한다.
Figure pct00006
Figure pct00007
표 6 및 도 5의 결과로부터, 펩티드 농도를 1차 항체 항P30(a) 항체 농도의 40배로 한 경우에, 웰의 흡광도가 컨트롤과 비교하여 30％ 이상 감소하고, 80배량으로 한 경우에도 50％ 이상 감소함이 확인되었다. 또한, 항체 P30(a)는 펩티드 1 및 펩티드 2의 어느 것에도 저해를 받는다는 점에서, 항체 P30(a)는 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열(PGMAPR)을 인식함이 본 시험에서도 확인되었다.
또한, 표 7 및 도 6의 결과로부터, 펩티드 농도를 1차 항체 P30(b)량의 40배로 한 경우에도, 웰의 흡광도가 컨트롤과 비교하여 약 22％밖에 감소하지 않고, 30％ 미만이었다. 즉, 항체 P30(b)가 「마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III을 강하게 인식하는」 항체가 아님이 확인되었다. 또한, 항체 P30(b)는 펩티드 1의 저해를 받지 않고 펩티드 2의 저해를 받는다는 점에서, 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열(PGFPPQ)을 인식함이 본 시험에서도 확인되었다.
본 발명을 특정한 형태를 사용하여 상세하게 설명하였지만, 본 발명의 의도와 범위를 벗어나지 않고 여러 가지 변경 및 변형이 가능하다는 것은, 당업자에게 있어서 명확하다. 또한, 본 출원은, 2015년 6월 1일자로 출원된 일본 특허 출원(일본 특허 출원 제2015-111732호), 및 2015년 8월 31일자로 출원된 일본 특허 출원(일본 특허 출원 제2015-171163호)에 기초하고 있으며, 그 전체가 인용에 의해 원용된다.
<산업상 이용가능성>
본 발명에 따르면, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 특정한 부위에 결합하는 항체를 사용한 면역 크로마토그래피 분석 장치를 사용함으로써, 고감도로 마이코플라스마ㆍ뉴모니에를, 신속하면서도 간이하게 검출할 수 있기 때문에, 폐렴 마이코플라스마의 조기 진단에 이용할 수 있다.
1: 시료 첨가부(샘플 패드)
2: 표지 물질 유지부
3: 크로마토그래프 매체부
4: 검출부
5: 흡수부
6: 배킹 시트

Claims (7)

  1. 시료 첨가부, 표지 물질 유지부, 검출부를 갖는 크로마토그래프 매체부 및 흡수부를 포함하는, 마이코플라스마ㆍ뉴모니에(Mycoplasma pneumoniae)를 검출하기 위한 면역 크로마토그래피 분석 장치이며,
    상기 표지 물질 유지부 및 검출부가, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III을 강하게 인식하는 항체를 함유하는, 면역 크로마토그래피 분석 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체가, 상기 도메인 III 중 서열 번호 3의 아미노산 서열을 인식하는, 면역 크로마토그래피 분석 장치.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 표지 물질 유지부가 함유하는 표지 물질이 금 입자이고, 상기 표지 물질 유지부가 상기 금 입자를 0.25 내지 0.7㎍/㎠ 함유하는, 면역 크로마토그래피 분석 장치.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 면역 크로마토그래피 분석 장치와, 검체를 희석하여 전개하기 위한 검체 희석액을 포함하는, 면역 크로마토그래피 분석 키트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 검체 희석액이 적어도 1종의 비이온성 계면 활성제를 함유하는, 면역 크로마토그래피 분석 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 검체 희석액이 함유하는 비이온성 계면 활성제의 50％ 이상이, HLB값이 13 내지 18인 비이온성 계면 활성제인, 면역 크로마토그래피 분석 키트.
  7. 시료 첨가부, 표지 물질 유지부, 검출부를 갖는 크로마토그래프 매체부 및 흡수부를 포함하는 면역 크로마토그래피 분석 장치를 사용하여, 검체 중의 마이코플라스마ㆍ뉴모니에를 검출하는 방법이며, 이하의 공정 (1) 내지 (4)를 포함하는, 면역 크로마토그래피 분석 방법.
    (1) 검체 희석액에 의해 검체를 희석한 검체 함유액을 시료 첨가부에 첨가하는 공정
    (2) 표지 물질 유지부에 유지되어 있는, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 마이코플라스마ㆍ뉴모니에의 P30 단백질의 도메인 III을 강하게 인식하는 항체(이하, 항체 P30(A)라고 표기함)에 의해 마이코플라스마ㆍ뉴모니에를 인식시키는 공정
    (3) 상기 검체 및 항체 P30(A)를 이동상으로 하여 크로마토그래프 매체부에 전개시키는 공정
    (4) 전개된 이동상 중의 마이코플라스마ㆍ뉴모니에를 검출부에 포함되는 항체 P30(A)에 의해 검출하는 공정
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