JPS62192662A

JPS62192662A - Ｃｒｐの高感度定量法

Info

Publication number: JPS62192662A
Application number: JP3386386A
Authority: JP
Inventors: Kazuaki Yoshikawa; 吉川　和明; Hideo Kato; 英夫加藤
Original assignee: NIPPON BIO TESUTO KENKYUSHO KK; NITSUSUI SEIYAKU KK; Nissui Pharmacetuical Co Ltd
Current assignee: NIPPON BIO TESUTO KENKYUSHO KK; NITSUSUI SEIYAKU KK; Nissui Pharmacetuical Co Ltd
Priority date: 1986-02-20
Filing date: 1986-02-20
Publication date: 1987-08-24

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明はＣＲＰ即ちＣ反応性蛋白の定量法に係り、殊に
その高感度定量法に係る。

ＣＲＰは１周知のように、炎症や組織壊死が生ずる場合
に血中に出現する特性を有している蛋白であるが、正常
人の血清中にも微量のＣＲＰが存在していることが明ら
かとなり、その機能が解明されつつある。又、微ｉ　Ｃ
ＲＰの定量が新生児における感染症の早期診断に有用で
あるとの報告もなされている。

従って、本発明による定量法は上記の炎症や感染症等の
臨床診断における検査法の一つとして利用することがで
きる。

（従来の技術）従来におけるＣＲＰの定量法としては毛細管法、ラテッ
クス凝集法、−元免疫拡散法及び免疫比濁法がある。

これらの従来法は、何れも試料中のＣＲＰ　′ａ度が低
い場合にはその測定が困難乃至不可能であり、そのため
にＣＲＰ　７１１度が低濃度域において変動する場合に
はその動態把握に難点を生ずる。

低濃度における抗原の測定に際しては、一般に、ＥＩＡ
　（酵素免疫測定法）において汎用されているサンドイ
ンチ法を適用するのが有効とされており。

この場合に一般に抗体としてポリクローナル抗体が採用
されている。

（発明が解決しようとする問題点）抗ＣＲＰポリクローナル抗体を用い且つサンドイッチ法
を適用してＣＲＰ抗原を定量することを目的として、高
感度な且つ特異性の高い測定系を確立するためには、ポ
リクローナル抗体を親和性クロマトグラフィー等により
充分に精製する必要がある。又、ポリクローナル抗体は
免疫動物の個体差等により異なるものとなり、従って常
に一定の品質乃至性質を有する抗体を調製することが困
難であると謂う問題を有していた。

更に、サンドイッチ法による測定中には、固相化抗体と
測定抗原との反応後及び酵素標識抗体との反応後にそれ
ぞれ洗浄を行うことが通常必要とされるために、工程数
が増加し、操作の所要時間が長くなる点に問題があった
。

（発明の目的）従って、本発明の主たる目的は、従来法では測定不可能
とされる程低濃度域のＣＲＰを測定可能となす、ＣＲＰ
の高感度定量法を提供することにある。

本発明の附随的目的は、操作が簡便であり且つ所要時間
の短い、ＣＲＰの高感度定量法を提供することにある。

（目的を達成するための手段及び作用）本発明方法は、
同相化抗体及び酵素標識抗体としてモノクローナル抗体
を用いることを基本とするものである。

本発明方法によれば、微量のＣＲＰを含有している試料
中のＣＲＰをサンドイッチ法により定量するに際して、
固相化抗体及び酵素標識抗体として共に抗ＣＲＰマウス
モノクローナル抗体を用い、該モノクローナル抗体を上
記の試料と反応させ。

次いで抗原抗体反応に関与した標識酵素の活性を測定し
てＣＲＰを定量することにより、上記の基本的目的を達
成することができる。

本発明方法の実施に際して、固相化抗体及び酵素標識抗
体と測定抗原であるＣＲＰとを同時に反応させることが
でき、この場合には洗浄操作が一回で済むので上記の附
随的目的を達成することができる。

同相化抗体及び酵素標識抗体に用いる抗ＣＲＰマウスモ
ノクロ一方ル抗体は、測定抗原であるＣＲＰのそれぞれ
異なる抗原決定部位を認識して結合する少なくとも２種
の互いに異なるモノクローナル抗体であるのが好ましい
。固相化抗体及び酵素標識抗体に用いる抗ＣＲＰマウス
モノクローナル抗体は沈降反応を呈するものであるのが
好ましい。

抗体の標識に用いら九る酵素としては慣用のもの、例え
ばアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガ
ラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等から選択さ
れた任意のものを用いることができる。標識を付すため
には、自体周知の任意の方法、例えば過沃素酸法、マレ
イミド法等を採用することができる。

抗原抗体反応に関与した標識酵素の活性測定も自体公知
の方法により実施することができ、例えば標識酵素とし
てアルカリホスファターゼを用いた場合には、Ｋｉｎｄ
　−Ｋｉｎｇ法により活性の測定を行うことができる。

尚、測定試料中のｃｎｐの定量は測定された吸光度値を
標準検量線に照合することにより行うことができる。

（発明の効果）抗原抗体反応を利用し且つ所謂サンドイッチ法によりＣ
ＲＰを定量する方法において、本発明方法によれば、固
相化抗体及び酵素標識抗体として共に抗ＣＲＰマウスモ
ノクローナル抗体を用いているので特異性及び測定感度
を向上させることができ、従来極めて困雉乃至不可能と
されていた程の低濃度のＣＲＰを定量することができる
。又。

モノクローナル抗体を利用するために、常に一定の性質
乃至品質を有する固相化抗体及び酵素標識抗体を調製す
ることができるので、定量結果の信頼性が向上する。

尚、本発明方法の実施に際しては、固相化抗体及び酵素
標識抗体と測定抗原であるＣＲＰとを同時に反応させる
。所謂１ステップサンドインチ法を採用することができ
るので操作を簡便化できる。

（実施例）ａ）抗ＣＲＰマウスモノクローナル抗体の作製ＣＲＰ陽
性血清を原料とし、硫安分画、　ＤＥＡＥイオン交換ク
ロマトグラフィー、Ｃａ２　？　沈澱、セファクリルＳ
　−３００ゲル濾過により精製したＣＲＰをＢＡＬＢ／
Ｃ系マウスに免疫し、その牌細胞をマウス骨ａ腫細胞（
Ｐ３Ｕｌ）と融合させたハイブリドーマから５種類のモ
ノクローナル抗体（ＣＲＢ１７、ＣＲ８１ｇ、ＣＲＢ１
９、ＣＲＢ２０．　Ｃｌ１ｆ＋２３）　　を得た。これ
らのモノクローナル抗体については硫安分画、ＤＥＡＥ
イオン交換クロマトグラフィー及びプロティンＡセファ
ロースＣＬ　−４Ｂ　（ファルマシア社製）により精製
した。

尚、抗体産生細胞を無血清培地で培養した培養上清を濃
縮し、５０％飽和硫安で七ツクローナル抗体を硫安分画
することによってもモノクローナル抗体を回収すること
ができる。

ｂ）抗ＣＲＰマウスモノクローナル抗体による沈降反応寒天ゲル内の中心孔にＣＲＰ　１ｍｇ／ｍｌを置き、周
囲にモノクローナル抗体を置いて０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎ
ｙのゲル内沈降反応を行った処、上記のａ）項に記載の
方法で得た５ＷＩ類のモノクローナル抗体は何れも沈降
反応を呈した。尚、ＣＲＢ１８、ＣＲＢ１９及びＣＲＢ
２３の各々はｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｆｕｓｅ　Ｌ／たが。

ＣＲＢ１７及びＣＲＢ２０とＣ１１Ｂ１．８、ＣＲＢ１
９及びＣＲＢ２３とはｄｏｕｂｌｅ　５ｐｕｒ様な形態
を呈し、従ってこれらの５種類のモノクローナル抗体は
ＣＲＢ１７とＣＲ［１２０の２種類からなるグループと
、（１：ＲＢ１８とＣＲＢ１９とＣＲＢ２３の３種類か
らなるグループとに分かれる。このことは、各グループ
がＣＲＰ分子上の異なる抗原決定部位を認識して結合す
るものであることを示唆している。

Ｃ）固相化抗体の調製上記のａ）項に記載の方法により得た抗ヒトＣＲＰマウ
スモノクローナル抗体を０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９
，６）で稀釈して５０　ｔｔ　ｇ／ｍｌの抗体溶液とし
、ヌンク社製のマイクロタイタープレートの各ウェルに
２００μｌ宛分注した。このマイクロタイタープレート
を４℃で２４時間放置した後にウェル内容物を除去し、
蒸留水で洗浄した。次いで各ウェル内に、１％牛アルブ
ミン含有燐酸緩衝食塩水（ｐＨ７，２）を２００μｌ宛
分注し、４℃で更に２４時間放置して固相化抗体とした
。尚、この固相化抗体は使用に先立ち蒸留水で洗浄され
る。

ｄ）酵素標識抗体の調製アルカリホスファターゼ（修生小腸由来、べ一リンガー
社製）　３　ｍｇを１ｍＭ塩化マグネシウム含有０．１
Ｍ　Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−グリシン
緩衝液（ｐＨ８，５）　Ｌ　ｍｌに添加して溶解させ、
次いで過沃素酸カリウム２０　ｍｇを添加し。

３７℃で２時間放置した。その後に８００　ｒｐｍで５
分間遠心して不溶物を除去し、上清を１ｍＭ塩化マグネ
シウム含有０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐｌ　９．５）で−晩
透新した。次いで、上記のａ）項で得た抗ＣＲＰマウス
モノクローナル抗体１．５　ｍｇを添加し。

４℃で１４日間放置し、１％牛アルブミン含有燐酸緩衝
食塩水で５０倍に稀釈した後に凍結保存した。尚、使用
時には、０．１ｚ牛アルブミン含有燐酸緩衝食塩水で稀
釈される。

ｅ）測定法上記のｄ）項に記載の方法により得た、酵素標識抗体の
稀釈液２００μｍを抗体固相化マイクロタイタープレー
トの各ウェルに分注し、試料ＣＲＰ濃度６．２５−４０
０　ｎｇ／ｍｌ）　２０　ｐｌを添加し、室温で２時間
反応させた後に内容物を蒸留水で洗浄する。次いで、ア
ルカリホスファターゼ活性測定用基質（４，５ｍＭフェ
ニル燐酸２ナトリウム及び２ｍＭ　４−アミノアンチピ
リン含有０．０５Ｍ炭酸緩衝液、　ｐＨ１０，２）を２
００μｍ添加し、室温で２０分間反応させる。その後に
、発色液（０，８％過沃素酸す１−リウム溶液）　１０
０　μｍを添加して酵素反応を停止させると共に発色さ
せ、次いでＥＬＩＳＡアナライザ（ＥＴＹ　−９６）を
用いて吸光度を測定した。

ｆ）結果上記のａ）項に記載の方法により得た５種類の抗ＣＲＰ
マウスモノクローナル抗体を用い、上記の　Ｃ）及びｄ
）項に記載の方法に従い固相化抗体及び酵素標識抗体を
調製し、これらを用いて、各種ＣＲＰ濃度の試料につい
て、上記のｅ）項に記載の操作手順に従゛い、吸光度（
５００ｎｍ）の測定を行ない、ＣＲＰ濃度と吸光度との
関係を調べた処、第１−５図に示される結果が得られた
。

これらの結果から、本発明方法によれば測定感度が極め
て良好であること並びに５種類のモノクローナル抗体に
おける２つのグループ〔上記のｂ）項参照〕を適宜選択
することにより感度を更に向上させ得ることが判る。

尚、ＣＲＰ　３３度が未知の試料のＣＲＰを定量する場
合に、第１−５図に示されるグラフを標準検量線として
用いることができる。

【図面の簡単な説明】

図面は、本発明によるＣＲＰの高感度定量法における、
ＣＲＰ　１度と吸光度との関係を示すグラフであり、第
１図、２図、３図、４図及び第５図はそれぞれＣＲＢ１
７、ＣＲＢ１８、ＣＲＢ１９、ＣＲ１３２０、ＣＲＢ２
３を固相化抗体として用い且つこれら５種類のモノクロ
ーナル抗体を酵素標識して調製したものを酵素標識抗体
として用いた場合を示している。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）微量のＣＲＰを含有している試料中のＣＲＰをサ
ンドイッチ法により定量するに際して、固相化抗体及び
酵素標識抗体として共に抗ＣＲＰマウスモノクローナル
抗体を用い、該モノクローナル抗体を上記の試料と反応
させ、次いで抗原抗体反応に関与した標識酵素の活性を
測定してＣＲＰを定量することを特徴とする、ＣＲＰの
高感度定量法。
（２）固相化抗体及び酵素標識抗体と測定抗原であるＣ
ＲＰとを同時に反応させることを特徴とする、特許請求
の範囲第１項に記載のＣＲＰの高感度定量法。
（３）固相化抗体及び酵素標識抗体に用いる抗ＣＲＰマ
ウスモノクローナル抗体が、測定抗原のそれぞれ異なる
抗原決定部位を認識して結合する少なくとも２種の互い
に異なるモノクローナル抗体であることを特徴とする、
特許請求の範囲第１項に記載のＣＲＰの高感度定量法。
（４）固相化抗体及び酵素標識抗体に用いる抗ＣＲＰマ
ウスモノクローナル抗体が沈降反応を呈するものである
ことを特徴とする、特許請求の範囲第１項に記載のＣＲ
Ｐの高感度定量法。