JPH03128460A - 抗原の定量法およびそれに用いる固相 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、試料中の抗原の定量法およびそれに用いる固
相に関する。さらに詳しくは、試料中の抗原にビオチン
化抗体、酵素標識抗体およびアビジン固定化固相を反応
させるか、または酵素標識抗体およびビオチン化抗体結
合アビジン固定化固相を反応させて、アビジン固定化固
相上にビオチン化抗体／抗原／酵素標識抗体の複合体を
生成させ、固相の酵素活性を測定することにより抗原を
定量する免疫分析法、およびそれに用いる固相に関する
。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）近年
、医療分野において癌マーカーやホルモン等の微量物質
の測定が重要になってきている。このような微量物質の
測定には高い特異性と感度が要求されるため、そのよう
な特異性および感度を満たすものとして抗原抗体反応を
利用した免疫学的方法が広（用いられている。現在知ら
れている免疫学的測定法としては、蛍光抗体法、ラジオ
イムノアッセイ法、酵素標識免疫測定法などがあるが、
なかでも標識物質として酵素を用いた酵素標識免疫測定
法が、適用範囲の広さ、試薬の扱い易さ、試料を大量に
処理できること等の利点があるため微量物質測定の主流
になりつつある。

抗原を定量するための酵素免疫測定法では、試料中の抗
原と反応した酵素標識抗体と未反応の酵素標識抗体とを
分離（以下、「Ｂ／Ｆ分離」という）するために、これ
らの標識抗体をさらに固相上に固定化させた抗体と抗原
抗体反応させて結合させ、固相上に結合した酵素を測定
するサンドイツチア・ノセイ法が一般に用いられている
。しかしながら、このようなり／Ｆ骨分離おける固相上
の抗原抗体反応は平衡化に長時間を要し、測定に時間が
かかるため、短時間で測定結果を得ることが望ましい臨
床化学分野では不都合である。そこで、近年、固相上で
の反応を速く行うために、抗原抗体反応の代わりにアビ
ジン−ピオチン等の特異的反応をＢ／Ｆ分離に利用する
ことが考えられている。

従来より免疫学的手法にアビジン−ビオチンの特異的結
合を応用した例としては、たとえばアンダーソン（Ａ　
ｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｇ　、　Ｗ、　）らのＪ　、　Ａ　
ｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、　８６　：　１８３９　（１９６４）などに記
載されているような組織化学の分野での利用がよ（知ら
れている。これは、たとえば組織上の抗原にビオチン標
識抗体を結合させ、さらにアビジン標識酵素を反応させ
て組織上に抗体／ビオチン／アビジン／酵素複合体を生
成させ、この酵素反応の生成物から組織上の抗原部位を
確認するものである。しかしながら、この方法では試料
中の抗原を定量することはできない。

臨床化学分野においてＢ／Ｆ分離にアビジンビオチン反
応を利用する方法は、特開昭６３−２２９３６８号明細
書に記載がある。この方法は、たとえば、測定しようと
する抗体と標識抗原、ビオチン化抗原およびアビジン固
定化固相を反応させて固相上にアビジン／ビオチン化抗
原／抗体／標識抗原複合体を生成させ、標識を測定して
抗体を定量しようとするものである。

一方、抗原を測定する方法は、アビジン固定化固相に、
ビオチン化抗体および放射性物質標識抗体を用いたフェ
リチン測定試薬として日本メジフィジックス（株）から
市販されている。しかしながら、この試薬を用いた方法
では反応時間が長（かかる（３〜４時間）。また、第２
８回日本臨床化学会年会（１９８８年１１月１８日、１
９日）プログラム要旨集一般演題Ｎｏ、４１にも同様の
報告がある。

この方法は、測定しようとする抗原を含む試料に標識抗
体およびビオチン化抗体を加え、液相中で抗原抗体反応
を行った後にアビジン固定化固相を加え、酵素標識抗体
／抗原／ビオチン化抗体からなるサンドイッチ複合体を
固相に吸着させ、ついで酵素活性を測定して抗原を定量
するものである。

この方法では、抗原抗体反応は液相中で進行するため速
（平衡化し、さらに固相上のアビジンビオチン反応も固
相上の抗原抗体反応に比べて速（進行するため、反応時
間が短縮される。しかしながら、この方法では、酵素反
応に要する時間を約１０分間と短くするために、蛍光基
質を用いて感度不足の解消を図っているが、ビオチン化
抗体として抗体のアミノ基にビオチン誘導体を結合した
ものを用いているため抗体価が損なわれていること、さ
らにアビジンが固相に結合しにくいため固相上のアビジ
ン量が不足していることが考えられ、本質的な感度不足
の解消はなされていない。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、上記方法における感度不足を解消するた
め、すなわち抗体価を損なうことなくビオチン化抗体を
調製し、固相上のアビジン結合量を多くするための手段
を開発するために鋭意研究を重ねた結果、第一の課題は
抗体のＦ　ａｂ’フラグメントのチオール基にビオチン
誘導体を結合させることにより、第二の課題はビオチン
化高分子物質を介してアビジンを固相に結合することに
より解決され、感度が上昇すること、さらにこの両方の
手段を併用すれば感度がさらに上昇すること、また、通
常のビオチン化抗体およびアビジン固定化固相であって
も、該ビオチン化抗体をアビジン固定化固相に結合させ
たビオチン化抗体結合アビジン固定化固相を用いること
により、通常のアビジン固定化固相に比べて高い感度が
得られること、さらに、この方法では酵素標識抗体のみ
を加えるだけで抗原を測定できるため操作が簡便である
ことを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明の目的は、固相法による抗原の酵素免
疫測定法において、ビオチン誘導体を抗体のＦ　ａｂ’
フラグメントのチオール基に結合させたビオチン化抗体
、酵素標識抗体、および上記ビオチン誘導体と特異的に
反応し得るアビジン、ストレプトアビジンおよびそれら
の誘導体から選ばれる１種を固定化させた固相を用いる
ことを特徴とする方法（方法１）；および固相法による
抗原の酵素免疫測定法において、ビオチン誘導体を抗体
に結合させたビオチン化抗体を、該ビオチン誘導体に特
異的に結合したアビジン、ストレプトアビジンおよびそ
れらの誘導体から選ばれる１種を介して、固相に固定化
させた固相、および酵素標識抗体を用いることを特徴と
する方法（方法２）を提供することにある。

本発明の他の目的は、固相が、ビオチン誘導体に特異的
に結合したアビジン、ストレプトアビジンおよびそれら
の誘導体から選ばれる１種を、該ビオチン誘導体を介し
て、固相に結合した高分子物質に結合させることにより
、固相に固定化させたものである上記方法１１ビオチン
化抗体と酵素標識抗体を試料中の測定すべき抗原と反応
させてビオチン化抗体／抗原／酵素標識抗体複合体を生
成させ、ついでこの複合体を、固相に固定化したアビジ
ン、ストレプトアビジンおよびそれらの誘導体から選ば
れる１種と反応させることを特徴とする上記方法ｌ、ビ
オチン化化体体酵素標識抗体、測定すべき抗原を含有す
る試料および固相を同時に反応させて行う上記方法１１
固相が、ビオチン誘導体とビオチン化抗体とに特異的に
結合したアビジン、ストレプトアビジンおよびそれらの
誘導体から選ばれる１種を、該ビオチン誘導体を介して
、固相に結合した高分子物質に結合させることにより、
固相に固定化させたものである上記方法２、ビオチン化
抗体が、ビオチン誘導体を抗体のＦ　ａｂ’フラグメン
トのチオール基に結合させたものである上記方法２、さ
らに酵素標識抗体、測定すべき抗原を含有する試料およ
び固相を同時に反応させて行う上記方法２を提供するこ
とにある。

本発明のさらに他の目的は、ビオチン誘導体に特異的に
結合したアビジン、ストレプトアビジンおよびそれらの
誘導体から選ばれる１種を、該ビオチン誘導体を介して
、固相に結合した高分子物質に結合させることにより、
固相に固定化させたことを特徴とする酵素免疫測定用固
定化固相（本発明固相ｌ）：およびビオチン誘導体を抗
体に結合させたビオチン化抗体を、該ビオチン誘導体に
特異的に結合したアビジン、ストレプトアビジンおよび
それらの誘導体から選ばれる１種を介して、固相に固定
化させたことを特徴とする酵素免疫測定用固定化固相（
本発明固相２）を提供することにある。

本発明固相１は、高分子物質がビオチン化され、そのビ
オチン部分にアビジンが結合した高分子物質／ビオチン
／アビジン複合体が、固相上に固定化されていることを
特徴とし、ビオチン化高分子物質を介してアビジン、ス
トレプトアビジン、またはそれらの誘導体が固相上に固
定化されたものである。また、本発明固相２は、ビオチ
ン化抗体を本発明固相ｌに結合させるか、またはアビジ
ン、ストレプトアビジンおよびそれらの誘導体から選ば
れる１種を直接固相に固定化した固相に結合させたもの
である。

本発明固相ｌを調製するには、たとえば、ビオチン誘導
体く以下、「ビオチン化試薬」ともいう）を用いてビオ
チン化した高分子物質を、高分子物質の部位で固相に結
合させ、ビオチン部位にさらにアビジン、ストレプトア
ビジンまたはこれらの誘導体（たとえば、あらかじめ遊
離のアミノ基を無水酢酸によりアセチル化するなどして
ブロックした中性化アビジン等）を結合させればよい。

高分子物質の固相への結合方法としては、物理的吸着法
、共有結合法等が挙げられる。また、本発明固相２を調
製するには、本発明固相１、またはアビジン、ストレプ
トアビジンまたはこれらの誘導体を直接固定化した固相
に、通常のビオチン化抗体またはビオチン誘導体を抗体
のＦ　ａｂ’フラグメントのチオール基に結合させたビ
オチン化抗体を結合させればよい。

本発明に使用する高分子物質は、ビオチン化試薬と反応
することのできる官能基を有し、かっ固相に物理的吸着
または共有結合することができるものであればよい。具
体的には、ウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）、卵白ア
ルブミン（ＯＡ）、イムノグロブリン、コラーゲン、ゼ
ラチン、カゼイン等の蛋白、デキストラン、プルラン等
の多糖類等を挙げることができる。

本発明に使用するビオチン化試薬は、高分子物質と反応
して共有結合することができる官能基を有するビオチン
誘導体であって、たとえば、ビオチン−Ｎ−ハイドロキ
シサクシンイミドエステル（ＮＨ３−ビオチン）、Ｎ−
ビオチニル−６−アミノカプロイル−Ｎ−ハイドロキシ
スルホサクシンイミドエステル（ＮＨ３−ＬＣ−ビオチ
ン）、スルホサクシンイミジル−２−（ビオチンアミド
）エチル−１，３−ジチオプロピオネート（ＮＨＳ−３
Ｓ−ビオチン）などが挙げられる［Ａｎａｌｙｔｉｃａ
ｌ　Ｂｉ。

ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：上Ｌ↓、１〜３２（１９８８）参
照］。

ビオチン化試薬と高分子物質とを結合させるには、ビオ
チン化試薬および高分子物質の種類に依存するが、高分
子物質１モルに対しビオチン化試薬１〜１００モル程度
を使用することが好ましい。

反応は、高分子物質とビオチン化試薬が充分に結合し、
高分子物質上の固相との結合部位が失活しないような条
件下で行い、たとえば、溶液のｐＨは４〜ＩＯ程度、反
応温度は４〜４５°Ｃ程度、反応時間は１０分〜２４時
間程度で行えばよい。

固相とビオチン化高分子物質との結合は、通常の方法（
物理的吸着法、共有結合法など）により行うことができ
、結合後にアビジン、ストレプトアビジンまたはそれら
の誘導体の結合が阻害されない方法であればよい。たと
えば、物理的吸着法としては、ビオチン化高分子物質の
溶液（１〜１０００μ９／ｘＱ）中に固相を浸漬する方
法、共有結合法としては、ビオチン化高分子物質の溶液
（１〜１０００　μ９／ｍ（１、ｐＨ５〜７）を、カル
ボキシル基を有する固相をｌ−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の溶液（５
〜２００　ｍｇ／ｘ□で１〜２４時間処理したものと反
応させる方法などが挙げられる。

最後にアビジン、ストレプトアビジンまたはこれらの誘
導体の溶液（１〜１０００μ９／１１Ｑ）中に上記ビオ
チン化高分子物質の結合した固相を１〜２０時間浸漬す
れば本発明固相１が得られる。

本発明固相２は、本発明固相１１またはアビジン、スト
レプトアビジンまたはこれらの誘導体の溶液（１〜１０
０００μｇ／Ｒ（２）中に固相を１〜２０時間浸漬して
得た固相を、さらにビオチン化抗体のｌ１ｆｆｌ（１〜
１０００ピコモル／１ｇ）中に１〜２０時間浸漬するこ
とにより調製することができる。

本発明固相１および２に使用する固相物質としては、複
合体を安定に固定でき、洗浄や測定に適した形状を有す
るものであればよく、ポリスチレン、ポリプロピレン、
ポリ塩化ビニル、ガラス、セラミック、アガロース等か
らなるビーズ、プレート、試験管、ラテックス等、酵素
免疫測定法に通常用いるものを使用することができる。

本発明はさらに、ビオチン化抗体、酵素標識抗体、およ
びアビジン、ストレプトアビジンまたはそれらの誘導体
を固定化した固相を用いた抗原のサンドイッチアッセイ
法において、ビオチン化抗体として抗体のＦ　ａｂ’フ
ラグメントのチオール基にピオチン誘導体を結合させた
ものを用いることを特徴とする方法をも提供する。この
ようなビオチン化抗体は、抗体、好ましくはモノクロー
ナル抗体から既知の方法、たとえば続生化学実験講座５
免疫生化学研究法（東京化学同人、ｌ　９８６）８９〜
１１２頁記載の方法によりＦ　ａｂ’フラグメントを得
、ついで、このＦ　ａｂ’フラグメントのチオール基に
ビオチン誘導体を結合させることにより調製することが
できる。

この場合のビオチン誘導体は、チオール基と反応する官
能基（たとえば、ヨードアセチル基またはマレイミド基
）を有するビオチン化試薬であり、その例示としては、
Ｎ−ヨードアセチル−Ｎ−ビオチニルヘキシレンジアミ
ン、３−（Ｎ−マレイミドブチリル）−ビオシチン（Ｍ
ＢＢ）、３−（Ｎマレイミドプロピオニル）−ビオシチ
ン、３−（Ｎ−マレイミドカプロイル）−ビオシチン、
Ｎ−ビオチニル−Ｎ−（６−マレイミドカプロイル）ヒ
ドラジド等が挙げられる。

上記結合反応におけるＦ　ａｂ’フラグメントとビオチ
ン化試薬の使用量はビオチン化試薬の種類によって異な
るが、フラグメント１モルに対してビオチン化試薬５〜
２０倍モル程度を使用すればよい。反応は、Ｆａｂ’フ
ラグメントとビオチン化試薬が充分に結合し、抗体価が
失活しないような条件下で行い、たとえば、溶液のｐＨ
は６〜７程度、反応温度は４〜４０°Ｃ程度、好ましく
は２０〜３０°Ｃ程度、反応時間は１〜２４時間程時間
待えばよい。

かくして得られたビオチン化抗体を用いて抗原定量を行
うには、試料（１〜１００μｇ、好ましくは５〜５０μ
Ｑ）に上記ビオチン化抗体および酵素標識抗体の混合液
（５０〜１０００μｇ、好ましくは１００〜５００μｍ
２）を加えて反応させ、ビオチン化抗体／抗原／酵素標
識抗体複合体を生成させた後にアビジン固定化固相を加
えてさらに反応させる。本反応は、試料、ビオチン化抗
体、酵素標識抗体およびアビジン固定化固相を１工程で
加えて、上記２反応を同時に行うこともできる。この場
合、使用するアビジン固定化固相としては、固相に前記
アビジン類を直接固定化した公知の固相（ベクター社製
固定化アビジンＤや特開昭６３２２９３６８号など）の
ほか、前記本発明の固定化固相ｌが用いられ、本発明の
固定化固相ｌではより安定した抗原測定が可能であるた
め好ましい。

また、上記で調製したビオチン化抗体または通常のビオ
チン化抗体をあらかじめアビジン固定化固相に結合させ
た本発明固相２を用いる場合には、該固相に、試料（１
−１００μＱ１好ましくは５〜５０μｍ２）および酵素
標識抗体溶液（５０〜１０００μＱ１好ましくは１００
〜５００μσ）を加えて反応させ、該固相上に抗原／酵
素標識抗体複合体を生成させる。

上記の反応における反応時間は、本発明固相１を用いる
場合では、抗原抗体反応およびアビジンビオチン反応と
も１〜２０分、好ましくは５〜１５分程度でよい。同時
に反応させる場合は、１〜３０分、好ましくは５〜２０
分程度反応させればよい。また、本発明固相２を用いる
場合では、抗原抗体反応を１〜３０分、好ましくは５〜
２０分程度行えばよい。反応後に固相を洗浄し、基質溶
液（５０〜１０００μＱ１好ましくは１００〜５００μ
ａ）を加え、比色測定では１〜３０分、好ましくは５〜
２０分間、蛍光測定では１５秒〜１５分、好ましくは１
〜５分間酵素反応させる。反応後に反応液をそのまま、
または適量の反応停止液を加えた後に比色または蛍光測
定する。あらかじめ濃度既知の抗原を用いて検量線を作
成しておき、これから試料中の抗原濃度を測定する。

上記反応はいずれも１０〜４５°Ｃ１好ましくは２０〜
４０°Ｃで行う。またビオチン−アビジン反応および抗
原抗体反応時のｐＨは５〜９、好ましくは中性付近で、
酵素活性測定時のｐＨは用いた標識酵素の至適ｐＨ付近
である。

標識酵素としては、酵素免疫測定法に用いる通常の酵素
、たとえば、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）
、ベルオキシダーゼ（Ｐ　ＯＤ）、アルカリホスファタ
ーゼ（ＡＬＰ）等を用いることができる。固相上の酵素
活性の測定は、基質として、標識酵素がβ−Ｇａｌの場
合はオルト−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシド等を、ＰＯＤの場合は過酸化水素と２，２°
−アジノービス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−ス
ルホン酸）（Ａ　Ｂ　Ｔ　Ｓ　）、過酸化水素と３．３
’５．５’−テトラメチルベンチジン、過酸化水素と０
−フェニレンジアミン等を、ＡＬＰの場合はパラ−ニト
ロフェニルリン酸、（４−メチル）ウンベリフェリルリ
ン酸等を反応系に適量で加え、比色法や蛍光法等の常法
により測定する。

本発明の方法によれば、ヒト血清、血漿、尿等の試料中
に存在する抗原の定量を高感度で゛行うことができ、ア
ッセイ時間も極めて短時間ですむ。

上記方法に本発明固相を用いれば、感度がさらに向上し
、−層適切なアッセイを行うことが可能となる。

つぎに本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらに限られるものではない。

実施例１［ビオチン化抗体（ピオチン−Ｆａｂ″）の調
製コ （ａ）抗アルファーフェトプロティン（ＡＦＰ）モノク
ローナル抗体の調製： ＡＦＰで免疫したＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウスの牌臓細胞
とマウスミエローマ細胞ＦＯを用い、ポリエチレングリ
コール法によりハイブリドーマを作製し、得られたハイ
ブリドーマを限界希釈法により２回クローニングし、抗
ＡＦＰモノクローナル抗体産生ハイプリドーマＮＨＡＦ
Ｐ−１４を得た。このハイブリドーマをＡＳＦ培地１０
３で培養し、その培養上清をプロティンＡ−アガロース
カラムを用いて抗ＡＦＰモノクローナル抗体（ＭＮＨＡ
ＦＰ−１４）を精製した。

（ｂ）　Ｆ　ａｂ’の調製： 上記工程（ａ）で得た抗ＡＦＰモノクローナル抗１本（
ＭＮＨＡＦＰ−１４；ＩＣ）＋ｇ／２ｚのｔ夜を０．１
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，２）にて透析し、これにペブ／
ン溶液（ヘーリンガー・マンハイム社製；２ＯＲ９／１
ｇ０．１Ｍ酢酸緩衝液；１００μのを加え、３７°Ｃで
２００時間反応せた。反応液を遠心分離し、上清をセフ
ァクリル−３−２００カラム（直径１゜５ＣｘＸ５０ｃ
ｍ、溶出液：Ｑ、１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６，０）にかけ
、Ｆ　（ａｂ’　）２分画を得た。このＦ　（ａｂ’　
）２分画に２−メルカプトエチルアミン塩酸塩を濃度が
ｌＯミリモル／Ｑになるように加え、３７°Ｃで１時間
反応させた。反応液を遠心分離し、上清を七フアクリル
ーＳ−２００カラム（直径１．５ｃｘＸ　５０　ｃｍ、
溶出液：Ｑ、１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６，０）にかけ、Ｆ
　ａｂ’分画を得た。

（ｃ）ビオチン化抗体（ビオチン−Ｆａｂ“）の調製Ａ
　ｎａｌ、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　１４９．５２９〜５
３６（１９８５）記載の方法に従い、３−（Ｎ−マレイ
ミドブチリル）−ビオシチン（ＭＢＢ）を合成し、Ｆ　
ａｂ’　（１，６６幻／１．３酎）にＭＢＢ溶液（０，
５肩９７１（１０゜１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６，０；０．
５Ｒｇ）を加え、室温で２時間反応させた。反応液を遠
心分離し、上清をセファデックス−Ｇ−２５カラム（直
径１．５Ｃ次×３０Ｃ次、溶出液：Ｑ、１Ｍリン酸緩衝
液ｐＨ６゜０）にかけ、ビオチン−Ｆ　ａｂ’を得た。

実施例２［酵素標識抗体（ＰＯＤ−Ｆａｂ″）の調製］
（ａ）抗Ａ　Ｆ　Ｐモノクローナル抗体の調製：実施例
１（ａ）と同様の手順に従い、抗ＡＦＰモノクローナル
抗体（ＭＮＨＡＦＰ−１８）を得た。

（ｂ）　Ｆ　ａｂ″の調製： 上記工程（ａ）で得た抗ＡＦＰモノクローナル抗体（Ｍ
Ｎ）（ＡＦＰ−１８）を用い、実施例１　（ｂ）と同様
の手順に従い、Ｆ　ａｂ’を得た。

（ｃ）　Ｐ　ＯＤ−マレイミドの調製：ＰＯＤ（ベーリ
ンガー・マンハイム社製；　６　ｍｇ）をＯ，１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０；０．８＋ｙ（２）に溶解し、こ
れにＮ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）サクシンイ
ミド（同口化学（株）製）液（８０＋ｖ９／Ｒ（２Ｎ、
Ｎ“−ジメチルホルムアミド；５０μのを加え、３０°
Ｃで１時間反応させた。反応液を遠心分離し、上清をセ
ファデックス−Ｇ−２５カラム（直径１．５Ｃ肩Ｘ３Ｑ
ｃｉ、溶出液＋Ｑ、ＩＭリン酸緩衝液ｐＨ６，０）にか
け、ＰＯＤ−マレイミド分画を得た。

（ｄ）　Ｐ　ＯＤ　−Ｆ　ａｂ’の調製：Ｆ　ａｂ’　
（Ｉ　Ｒ９）に対してＰＯＤ−マレイミド（１ｏ）を加
え、冷所にて２００時間反応せた。反応液を遠心分離し
、上清をセファクリル−３−２００カラム（直径１．５
ｃ＋ｙｘ　５　Ｑｃｘ、溶出液：Ｑ、１Ｍリン酸緩衝液
ｐＨ６，５）にかけ、Ｐ　ＯＤ　−Ｆ　ａｂ’分画を得
た。

困遣廻（従来のアビジン固定化同相の調製）アビジン（
和光純薬（株）製、生化学用、５　ＪＩ９）を２０ｍＭ
炭酸緩衝液（ｐＨ９，６，０，１５Ｍ塩化ナトリウム含
有、１０舷）に溶解し、得られた溶液中にポリスチレン
ビーズ（住友ベークライト（株）製、Ｃタイプ）約３０
個を入れ、室温にて２０時間放置し、固相にアビジンを
吸着させた。この固相を生理食塩水で数回洗浄した後、
１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（０，１Ｍリン酸緩
衝液ｐＨ７゜０）溶液中に浸し、室温にて２０時間放置
し、アビジン固定化固相を得た。

実施例３（ビオチン−Ｆ　ａｂ’を用いたＡＦＰの定量
（２工程法）） ヒ１−ＡＦＰ（ダコ社製）をＡＦＰを含まないヒト血清
に溶解し、ＡＦＰ／ＪＩ度をＯ〜１０００ｎ９／ＲＱに
調整したものを試料とし、この試料（５０μＱ）を試験
管に取り、これに抗体液［Ｆａｂ’濃度が１６０ｕ９／
ｙＱのビオチン−Ｆａｂ’（５０μのおよびＰＯＤ活性
が２６．１　Ｉ　Ｕ／ｘＱのＰＯＤ−Ｆａｂ’（５００
ｕのに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０，１１５Ｍ塩
化ナトリウム、０．５％ＢＳＡ含有）を加え全量を１０
雇にしたもの］（４００μＩ２）を加え、３７℃で１０
分間加温した。ついで、反応液に製造例で調製したアビ
ジン固定化固相を加え、３７°Ｃで１０分間加温した。

反応後、反応液を吸引除去し、洗浄液（生理食塩水Ｘ２
ｘ（２）を加え、撹拌し、洗浄液を吸引除去した。この
洗浄操作をさらに２回繰り返した。洗浄後、基質液（Ａ
ＢＴＳ　　ｌｕ／ｘＱ、０．０１％過酸化水素、０．１
Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ４，２）（５００μのを加え、３
７°Ｃで１５分間反応させた後、反応停止液として５Ｉ
ＩＩＭアジ化ナトリウム液（２Ｎのを加え、４１５μｍ
における吸光度を測定した。その結果を第１図の・に示
す。

実施例４（ビオチン−Ｆ　ａｂ’を用いたＡＦＰの定量
（１工程法）） 上記実施例３で調製した試料（５０μのを試験管に取り
、製造例で調製したアビジン固定化固相を加え、さらに
実施例３と同じ抗体液（４００μのを加え、３７℃で１
−０分間加温した。反応後、反応液を吸引除去し、実施
例３と同じ洗浄液（２靜）を加え、撹拌し、洗浄液を吸
引除去した。この洗浄操作をさらに２回繰り返した。洗
浄後、実施例３と同じ基質液（５００μのを加え、３７
℃で１５分間反応させた後、実施例３と同じ反応停止液
（２ｆｆのを加え、４１５μｍにおける吸光度を測定し
た。その結果を第１図のムに示す。

塩軟皿土 実施例３におけるビオチン−Ｆａｂ’の代わりに抗体の
アミ７基にビオチン誘導体を結合させたビオチン化抗体
［抗ＡＦＰモノクローナル抗体液（ＭＮｌ−ＩＡＦ　Ｐ
−１４：２．５ｍ９／ｍ（２０，１Ｍリン酸緩衝液）ｔ
、：ＮＨ３−ビオｆ７液（ｌ　ｍｇ／　ｚ（ＤＭＳ　Ｏ
；３００μのを加え、３０°Ｃで１時間反応させ、反応
液をセファデックス−Ｇ−２５カラムで分離精製したち
の］をビオチン−Ｆ　ａｂ’と同じモル濃度で用いたほ
かは実施例３と同様の操作を繰り返した。

その結果を第１図の×に示す。

比較例２ 実施例４におけるビオチン−Ｆ　ａｂ’の代わりに比較
例１のビオチン化抗体をビオチン−Ｆ　ａｂ’と同じモ
ル濃度で用いたほかは実施例４と同様の操作を繰り返し
た。その結果を第１図の１に示す。

第１図に示した結果から明らかなように、本発明のビオ
チン−Ｆ　ａｂ’を用いた方法は、従来の抗体のアミノ
基にビオチン誘導体を結合させたビオチン化抗体を用い
た方法に比べて感度が約２倍上昇したことがわかる。

実施例５（本発明固相１の調製） （ａ）ビオチン−ＢＳＡの調製： ＢＳＡ（オリエンタル社製、Ｆ−Ｖ；３０！！ｙ）を０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０，１ｊｆ１２）に溶解
し、これにＮＨ３−５Ｓ−ビオチン溶液（ピアス社製、
１６．８諏９／村０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，０；１
ｇのを加え、３０℃で１時間反応させた。反応液を遠心
分離し、上清をセファデックス−Ｇ−２５カラム（直径
１．５Ｘ３０ｃＭ、溶出液：５０ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ９
，６）にかけ、ビオチン−ＢＳＡ分画を得た。

（ｂ）本発明固相ｌの調製： 上記工程（ａ）で得たビオチン−ＢＳＡを５０ｍＭ炭酸
緩衝液（ｐＨ９，６）で希釈し、ビオチン−ＢＳＡ濃度
を１０μ９／ｍ（ｌに調整した。この液（１００μのを
プレート（ヌンク社製、イムノプレートＩ、９６穴）の
ウェルに分注し、室温にて１時間反応させて固定化した
。ウェルを生理食塩水で数回洗浄した後、アビジン溶液
（ベクター社製、アビジンＤ、５０μ９／酎０．１Ｍリ
ン酸緩衝液ｐＨ７，０；１００μのをウェルに分注し、
３７℃で１時間反応させた。ウェルを生理食塩水で数回
洗浄した後、３％ＢＳＡ溶液（５０ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ
９，６；２５０μＩ２）を加え、３７°Ｃで１時間処理
し、本発明固相ｌを得た。

実施例６（本発明固相１の調製） （ａ）ビオチン−ＯＡの調製： ｏＡ（シグマ社製、３０ｍ９）をＯ，１Ｍ’Ｊ７酸緩衝
液（ｐＨ７，０、ＩＪ！のに溶解し、これにＮＨ３ＬＣ
−ビオチン溶液（ピアス社製、１２　、６１９／Ｒ（１
０，１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，ｏ；１００μｉ２）を加
え、３０°Ｃで１時間反応させた。以下、実施例５工程
（ａ）と同様の手順に従い、ビオチン−ＯＡ分画を得た
。

（ｂ）本発明固相ｌの調製： 上記工程（ａ）で得たビオチン−ＯＡを５０ｍＭ炭酸緩
衝液（ｐＨ９，６）で希釈し、１０μ９／村に調整した
。以下、実施例５工程（ｂ）と同様の手順に従い、本発
明固相１を得た。

実施例７（本発明固相１の調製） （ａ）ビオチン−イムノグロブリンの調製：ウサギＩｇ
Ｇを用い、実施例１工程（ｂ）の前半と同様の手順に従
い、Ｆ（ａｂ’）ｔを得た。ついで、Ｆ　（ａｂ’　）
２（］　Ｏｍｑ／　、ｍ（ｌ　Ｏ、］　Ｍリン酸緩ｉｙ
ｉ液ｐＨ７゜０・３１１のに、Ｎ　ｌ（Ｓ　−Ｌ　Ｃ−
ビオチン溶液（ピアス社製、ｌ　５ｍ９／ｍ（ｌ　Ｏ，
１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７０；３００μのを加え、３０°
Ｃで１時間反応させた。以下、実施例５工程（ａ）と同
様の手順に従い、ビオチン−Ｆ　（ａｂ’　）２分画を
得た。さらに実施例１工程（ｂ）の後半と同様の手順に
従い、ビオチン−Ｆ　ａｂ’を得た。

（ｂ）本発明固相１の調製： 上記工程（ａ）で得たビオチン−Ｆ　ａｂ’を５０ｍＭ
炭酸緩衝液（ｐＨ９，６）で希釈腰２０μｇ／　ｊＩ（
ｌに調整した。以下、実施例５工程（ｂ）と同様の手順
に従い、本発明固相１を得た。

実施例８［酵素標識抗体（β−Ｇａｌ−Ｆａｂ’）の調
製］（ａ）　Ｆ　ａｂ’の調製： 実施例２（ａ）で得た抗ＡＦＰモノクローナル抗体（Ｍ
ＮＨＡＦＰ−１８）を用い、実施例２（ｂ）に記載の手
順と同様にしてＦ　ａｂ’を調製した。

（ｂ）β−Ｇａｌ−マレイミドの調製：β−Ｇａｌ（オ
リエンタル酵母（株）製、ＩＣ１＋９）を０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ６、０，２ａＱ）に溶解し、これにＯ−
フェニレンジマレイミド溶液（アルドリッチ社製、２５
ｘｙ／ｘ１２Ｎ、　Ｎ　−ジメチルホルムアミド；Ｉ　
ｏｏμのを加え、３０’Ｃで２０分間反応させた。反応
液を遠心分離し、上清をセファデックス−Ｇ−２５カラ
ム（直径１．５ｃ皮Ｘ３ＱｃＩ！、溶出液：Ｑ、１Ｍリ
ン酸緩ｉＩｉ液ｐＨ６，０）にかけ、β−Ｇａｌ−マレ
イミド分画を得た。

（ｃ）β−Ｇａｌ　　Ｆａｂ’の調）？Ｆ　ａｂ’　（
ｌ　ｆｆ９）に対してβ−Ｇａｌ−７レイミド（３９ｘ
ｑ）を加え、３０’Ｃで３０分間反応させた。反応液を
遠心分離し、上清をセファローズ−６Ｂカラム（直径１
．５ｃｚＸ　５　Ｑｃｘ、溶出液：１０ｍＭリン酸緩衝
液ｐＨ６，５，０１％ＢＳＡ含有）にかけ、β−Ｇａｌ
−Ｆａｂ’分画を得た。

実施例９（ＡＦＰの定量） 実施例３で調製した試料（２０μＱ）を実施例５で調製
した本発明固相ｌのウェルに入れ、抗体液［実施例１で
調製したビオチン−Ｆａｂ’（１６μｇ）およびβ−Ｇ
ａｌ　−Ｆ　ａｂ’　（２０Ｕ）に０．０１Ｍリン酸緩
衝液（ｐｉ−１７，０，０，１Ｍ塩化ナトリウム、０２
％ＢＳＡ含有）を加え、全量をＩＭとしたちの；１００
μａ］を加え、３７°Ｃで１５分間加温した。反応後、
反応液を吸引除去し、洗浄液（生理食塩水）を加え、洗
浄液を吸引除去した。この洗浄操作をさらに４回繰り返
した。洗浄後、基質液［０−ニトロフェニル−β−Ｄ−
ガラクトピラノ７ド３．０１．９／ｆ　５０ｍＭリン酸
緩衝液（７５ｍＭ塩化ナトリウム、０．０４％Ｍ　ｇ　
Ｃｌ　ｔ、０．０５％ＢＳＡ、６％エチレングリコール
ｌｒ）；１００μｆ２］を加え、３７°Ｃで１０分間反
応させた後、反応停止液として１％炭酸ナトリウム（１
００μのを加えた。この液の吸光度を４１５μｍおよび
６００ｒ＋＋ｎ（副波長）で測定した。その結果を第２
図に・で示す。

比較例３ 本発明固相ｌの代わりに、従来のアビジン固定化固相（
実施例５においてビオチン−ＢＳＡの固定化を行わずに
：Ａ製したもの）を用いたほかは実施例８と同様の操作
を行った。その結果を第２図のムで示す。

第２図に示した結果から明らかなように、本発明固相１
を用いて行った定量法では、従来のアビジン固定化固相
を用いて行った定量法に比べて感度が約２倍上昇したこ
とがわかる。

第３図には、本発明固相１を用いて測定したＡＦＰ濃度
と従来の酵素免疫測定法（ＡＦＰＥＩＡキット「三片」
■、カイノス社より市販）による測定結果との相関関係
を示す。図から良好な相関が得られていることがわかる
。

実施例１０（ＡＦＰの定量） 実施例５で調製した本発明固相１の代わりに実施例６お
よび７で調製した本発明固相Ｉ（ビオチン−ＯＡおよび
ビオチン−Ｆａｂ”を用いたもの）を用いた他は実施例
９と同様の手順に従いＡＦＰの定量を行った。その結果
を、それぞれ第４図および第５図に・で示す。また、比
較例３の方法についても同様に行った。その結果を、そ
れぞれ第４図および第５図にムで示す。

第４図および第５図に示す結果から明らかなように、本
発明固相ｌを用いて行った定量法では、従来のアビジン
固定化固相を用いて行った定量法に比べて感度が、ビオ
チン−ＯＡの場合は約１゜５倍、ビオチン−Ｆ　ａｂ’
の場合は約１．８倍上昇したことがわかる。

実施例１１［癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の定量］（ａ）ビ
オチン−Ｆ　ａｂ’の調製： 抗ＡＦＰモノクローナル抗体の代わりに抗ＣＥＡモノク
ローナル抗体［オリエンタル酵母（株）製、ＭＡ３５６
４Ｆ］を用いた他は実施例１と同様の操作を行い、ビオ
チン−Ｆ　ａｂ’　（抗ＣＥＡ抗体）を調製した。

（ｂ）　Ｐ　ＯＤ　−Ｆ　ａｂの調製：抗ＡＦＰモノク
ローナル抗体の代わりに抗ＣＥＡモノクローナル抗体（
森永生科学研究所製、２３９−１）用いた他は実施例２
と同様の操作を行い、Ｐ　ＯＤ　−Ｆ　ａｂ’　（抗Ｃ
ＥＡ抗体）を調製した。

（ｃ）本発明固相１の調製： ビオチン−ＢＳＡを用いた実施例５と同様の操作に従い
調製した。なお、対照として比較例３と同様の手順も行
い、従来のアビジン固定化固相も調製した。

（ｄ）ＣＥＡの定量： ヒ１−ＣＥＡ（森永生科学研究所製）をＣＥＡを含まな
いヒト血清に溶解し、ＣＥＡ濃度が０〜５０ｎｇ／ｍ（
ｌの試料を調製した。上記工程（Ｃ）で調製した固相の
ウェルに試料（５０μａ）を入れ、抗体液［ビオチン−
ｐａｂ’（１０μ９）およびＰ　ＯＤ　−Ｆ　ａｂ’　
（１５１Ｕ）に０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０，
０゜１Ｍ塩化ナトリウム、０．２％ＢＳＡ含有）を加え
、全量を１ＯＲＩ２としたちの；１００μ５］を加え、
３７°Ｃで１５分間加温した。反応後、反応液を吸引除
去し、洗浄液（生理食塩水）を加え、洗浄液を吸引除去
した。この洗浄操作をさらに４回繰り返した。洗浄後、
基質液（Ａ　Ｂ　Ｔ　Ｓ　　ｌ　ｎ／Ｍ（１，０，０１
％過酸化水素水、０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ４゜２；
１００μＱ）を加え、３７°Ｃで１０分間反応させた後
、反応停止液として５ｍＭアジ化ナトリウム液（１００
μρ）を加えた。この液の吸光度を４１５ｎｍおよび６
００　ｎｍ（副波長）で測定した。その結果を第６図に
・で示す。

また、本発明固相ｌの代わりに従来のアビジン固定化固
相のウェルを用い、上記と同様の操作でＣＥＡの定量を
行った。その−結果を第６図にムで示す。

第６図に示した結果から明らかなように、ＣＥＡの定量
においても本発明固相ｌを用いた方が従来のアビジン固
定化固相を用いた方法に比べ感度が約１．７倍上昇した
ことがわかる。

（ｅ）相関 本発明固相１を用いた方法と従来の酵素免疫測定法（Ｃ
ＥＡ−、ＥＩＡｎｒアボット」：タイナボット社より市
販）との相関（ｎ−２０）を調べた。その結果、相関係
数ｒ＝０．９６４、回帰式ｙ＝０．６４２ｘ＋２．０と
良好な相関が得られた。

実施例１２（蛍光基質を用いたＡＦＰの定量）実施例９
と同様の手順に従ってＡＦＰの定量を行ったが、抗原抗
体反応およびビオチン−アビジン反応は３７°Ｃで８分
間、酵素反応は３７℃で１分間とし、基質液としては０
−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドの代わり
に４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド
（３３，８Ｍ９／＋２）を用い、吸光度の測定は励起波
長３６０ｎｍ、測定波長４５０ｎｍで行った。その結果
を第７図に示す。第７図から明らかなように良好な検量
線が得られた。

蛍光基質を用いることにより、実施例９の比色法に比べ
てより短時間に測定できることがわかる。

実施例１３（本発明固相２の調製） 実施例５工程（ｂ）と同様の手順に従って調製した本発
明固相１に、実施例１で調製したビオチンＦ　ａｂ’液
［１，６μｇ／１１２（ｌ　０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７
，０，０，１５Ｍ　ＮａＣ１，０，１％Ｂ　Ｓ　Ａ）：
　１００μＱコを加え、３７°Ｃで１時間反応させ処理
し、ＡＦＰ定量用本発明固相２を得た。

実施例１４（本発明固相２の調製） 実施例５工程（ｂ）と同様の手順に従って調製した本発
明固相ｌに、実施例１１工程（ａ）で調製したビオチン
−Ｆ　ａｂ’液［１μ９／ｗＱ（ｌ　０ｍＭリン酸緩衝
液ｐＨ７，０，０，１５Ｍ　ＮａＣ１，０，１％ＢＳ　
Ａ）＋　１００μρ］を加え、３７°Ｃて１時間反応さ
せ処理し、ＣＥＡ定逍定本用本発明固相２た。

実施例＋５（本発明固相２の調製） 比較例３と同様の手順に従って調製した従来のアビジン
固定化固相に、実施例１で調製したビオチン−Ｆａｂ’
ｉ（ｌ［１，６μ９／１１ｆ２（１０ｍＭリン酸緩衝液
ｐＨ７，０，０，１５Ｍ　ＮａＣ１，０，１％ＢＳＡ）
１００μＣ］を加え、３７°Ｃで１時間反応させ処理し
、ＡＦＰ定量用本発明固相２を得た。

実施例１５（ＡＦＰの定量） ヒトＡＦＰ（ダコ辻製）をＡＦＰを含まないヒト血清中
に溶解し、ＡＦＰ濃度がＯ〜５００ｎ９／ｆｆ１２の試
料を調製した。この試料（２０μＱ）を実施例１３で調
製した本発明固相２のウェルに入れ、さらに実施例８で
調製した酵素標識抗体液［β−Ｇａ１−　Ｆ　ａｂ’　
（２０Ｕ）に０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０，０
，１Ｍ塩化ナトリウム、０．２％ＢＳＡ含有）を加え、
全量をｔｏｘｃとしたもの、１００μＱ、］を加え、３
７°Ｃで１５分間加温した。以下、実施例９と同様の操
作に従いＡＦＰの定量を行った。

その結果を第８図に示す。

火悔週±７（Ｃ［ＥＡの定量） ヒトＣＥＡ（森永生科学研究所製）をＣＥＡを含まない
ヒト血清に溶解し、ＣＥＡ濃度かＯ〜５０ｎｇ／靜の試
料を調製した。実施例１４て調製した本発明固相２のウ
ェルに試料（５０μＱ）を入れ、さらに実施例１１工程
（１））で調製した酵素標識抗体液［ＰＯＤ−Ｆａｂ’
（１５１ｔＪ）に０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７、０
，０，１Ｍ塩化ナトリウム、０２％ＢＳＡ含有）を加え
、全量をｌ０ｍ１２としたちの；ｌ　ｏｏμρ］を加え
、３７°Ｃで１５分間加温した。以下、実施例１．１工
程（ｄ）と同様の操作に従いＣＥＡの定量を行った。そ
の結果を第９図に示す。

実施例１３（ＡＦＰの定量） ヒ１−ＡＦＰ（ダコ社製）をＡＦＰを含まないヒト血清
中に溶解し、ＡＦＰ７１度か０〜１０００ｎ９／Ｒρの
試料を調製した。この試料（２０μσ）を実施例１５で
調製した本発明固相２のウェルに入れ、さらに実施例８
で調製した酵素標識抗体液［β−Ｇａｌ　−Ｆ　ａｂ　
（２０Ｕ）にＯ，０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０，０
，１Ｍ塩化ナトリウム、０．２％ＢＳＡ含有）を加え、
全量を１．０１１１ｇとしたちの；１００μ（２］を加
え、３７°Ｃで１５分間加温した。以下、実施例９と同
様の操作に従いＡＦＰの定１を行った。その結果を第１
０図に・で示す。

また、従来のアビジン固定化同相を用いて比較例３と同
様の操作に従ってＡＦＰの定量を行った。

その結果を第１０図にムで示す。

第１０図の結果から明らかなように、本発明固相２を用
いた方法が従来のアビノン固定化固を目を用いた方法に
比べて感度が約３．０倍上昇したことがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、酵素免疫測定法により試料中の抗原（ＡＦＰ
）の定量結果を示すグラフであって、ビオチン−Ｆａｂ
”を用いた場合とビオチン−１ｇＧを用いた場合の感度
を比較したもの、 第２図は、酵素免疫測定法により試料中の抗原（ＡＦＰ
）の定量結果を示すグラフであって、ビオチン−ＢＳＡ
を使用した本発明固相ｌを用いた場合と従来のアビジン
固定化固相を用いた場合の感度を比較したもの、 第３図は、酵素免疫測定法による試１［中の抗原（ＡＦ
Ｐ）の定量において、ビオチン−ＢＳＡを使用した本発
明固相１を用いた本発明の方法と市販キットの方法との
ＡＦＰ測定の相関関係を示すグラフ、 第４図は、酵素免疫測定法により試料中の抗原（ＡＦＰ
）の定量結果を示すグラフであって、ビオチン−ＯＡを
使用した本発明固相ｌを用いた場合と従来のアビジン固
定化固相を用いた場合の感度を比較したもの、 第５図は、酵素免疫測定法により試料中の抗原（Ａ　Ｆ
　Ｐ）の定量結果を示すグラフであって、ビオチン−Ｆ
　ａｂ’を使用した本発明固相■を用いた場合と従来の
アビジン固定化固相を用いた場合の感度を比較したもの
、 第６図は、酵素免疫測定法により試料中の抗原（ＣＥＡ
）の定量結果を示すグラフであって、ビオチン−ＢＳＡ
を使用した本発明固相１を用いた場合と従来のアビジン
固定化固相を用いた場合の感度を比較したもの、 第７図は、酵素免疫測定法により試料中の抗原（ＡＦＰ
）の定量結果を示すグラフであって、ビオチン−ＢＳＡ
を使用した本発明固相ｌを用い、酵素基質として蛍光基
質を用いた場合のグラフ、第８図は、本発明固相２を用
いた酵素免疫測定法により試料中の抗原（ＡＦＰ）の定
量結果を示すグラフ、 第９図は、ビオチン−Ｆ　ａｂ’を使用した本発明固相
２を用いた酵素免疫測定法により試料中の抗原（ＣＥ　
Ａ）の定量結果を示すグラフ、第１０図は、酵素免疫測
定法により試料中の抗原（ＡＦＰ）の定量結果を示すグ
ラフであって、ビオチン−Ｆ　ａｂ’を使用した本発明
固相２を用いた場合と従来のアビジン固定化固相を用い
た場合の感度を比較したものである。 ＡＦＰ （ｎｇ／ｍｌ） ＡＦＰ （ｎｇ／ｍ１） １００．２００　　　３００　　　４００　　　５００
カイ／７１．社　ＡＦＰ（ｎｇ／ｍｌ）第４図 ＡＦＰ　ｒ口ｇ／ｍｌｌ 第６図 ＣＥＡ（ｎｇ／ｍｌ　１ 第５図 ＡＦＰ［ｎｇ／ｍ 第 凹 ＡＦＰ （口ｇ／ｍｌｌ 第８Ｉ￥］ ＡＦＰ （ｎｇ／ｍｌｌ 第 図 ＥＡ （ｎｇ／ｍｌ　１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）固相法による抗原の酵素免疫測定法において、ビ
   オチン誘導体を抗体のＦａｂ′フラグメントのチオール
   基に結合させたビオチン化抗体、酵素標識抗体、および
   上記ビオチン誘導体と特異的に反応し得るアビジン、ス
   トレプトアビジンおよびそれらの誘導体から選ばれる１
   種を固定化させた固相を用いることを特徴とする方法。 （２）固相が、ビオチン誘導体に特異的に結合したアビ
   ジン、ストレプトアビジンおよびそれらの誘導体から選
   ばれる１種を、該ビオチン誘導体を介して、固相に結合
   した高分子物質に結合させることにより、固相に固定化
   させたものである請求項（１）記載の方法。（３）ビオ
   チン化抗体と酵素標識抗体を試料中の測定すべき抗原と
   反応させてビオチン化抗体／抗原／酵素標識抗体複合体
   を生成させ、ついでこの複合体を、固相に固定化したア
   ビジン、ストレプトアビジンおよびそれらの誘導体から
   選ばれる１種と反応させることを特徴とする請求項（１
   ）または（２）記載の方法。 （４）ビオチン化抗体、酵素標識抗体、測定すべき抗原
   を含有する試料および固相を同時に反応させて行う請求
   項（１）または（２）記載の方法。 （５）固相法による抗原の酵素免疫測定法において、ビ
   オチン誘導体を抗体に結合させたビオチン化抗体を、該
   ビオチン誘導体に特異的に結合したアビジン、ストレプ
   トアビジンおよびそれらの誘導体から選ばれる１種を介
   して、固相に固定化させた固相、および酵素標識抗体を
   用いることを特徴とする方法。 （６）固相が、ビオチン誘導体とビオチン化抗体とに特
   異的に結合したアビジン、ストレプトアビジンおよびそ
   れらの誘導体から選ばれる１種を、該ビオチン誘導体を
   介して、固相に結合した高分子物質に結合させることに
   より、固相に固定化させたものである請求項（５）に記
   載の方法。 （７）ビオチン化抗体が、ビオチン誘導体を抗体のＦａ
   ｂ′フラグメントのチオール基に結合させたものである
   請求項（５）または（６）に記載の方法。 （８）酵素標識抗体、測定すべき抗原を含有する試料お
   よび固相を同時に反応させて行う請求項（５）、（６）
   または（７）に記載の方法。 （９）ビオチン誘導体に特異的に結合したアビジン、ス
   トレプトアビジンおよびそれらの誘導体から選ばれる１
   種を、該ビオチン誘導体を介して、固相に結合した高分
   子物質に結合させることにより、固相に固定化させたこ
   とを特徴とする酵素免疫測定用固定化固相。（１０）高
   分子物質がウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、イム
   ノグロブリン、コラーゲン、ゼラチン、カゼイン、プル
   ランおよびデキストランよりなる群から選ばれたもので
   ある請求項（９）に記載の固相。 （１１）ビオチン誘導体を抗体に結合させたビオチン化
   抗体を、該ビオチン誘導体に特異的に結合したアビジン
   、ストレプトアビジンおよびそれらの誘導体から選ばれ
   る１種を介して、固相に固定化させたことを特徴とする
   酵素免疫測定用固定化固相。 （１２）ビオチン誘導体とビオチン化抗体とに特異的に
   結合したアビジン、ストレプトアビジンおよびそれらの
   誘導体から選ばれる１種を、該ビオチン誘導体を介して
   、固相に結合した高分子物質に結合させることにより、
   固相に結合させたものである請求項（１１）に記載の固
   相。 （１３）ビオチン化抗体が、ビオチン誘導体を抗体のＦ
   ａｂ′フラグメントのチオール基に結合させたものであ
   る請求項（１１）または（１２）に記載の固相。 （１４）高分子物質がウシ血清アルブミン、卵白アルブ
   ミン、イムノグロブリン、コラーゲン、ゼラチン、カゼ
   イン、プルランおよびデキストランよりなる群から選ば
   れたものである請求項（１２）または（１３）に記載の
   固相。