DE69021953T2 - Enzymimmuntest für Antigene und dafür verwendbare feste Phase. - Google Patents

Enzymimmuntest für Antigene und dafür verwendbare feste Phase.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Messen einer Menge eines Antigens in einer Probe sowie eine hierzu verwendete feste Phase. Insbesondere betrifft die Erfindung einen Enzymimmunoassay zur Messung einer Menge eines Antigens in einer Probe, der folgendes umfaßt: Umsetzen eines Antigens in einer Probe entweder mit einem biotinylierten Antikörper, einem Enzym-markierten Antikörper und einer Avidinimmobilisierten festen Phase (feste Phase mit immobilisiertem Avidin) oder mit einem Enzym-markierten Antikörper und einer biotinylierten, Antikörper-gebundenen, Avidin-immobilisierten festen Phase unter Bildung eines biotinylierten Antikörper/Antigen/Enzym-markierter-Antikörper-Komplexes an der Avidin-immobilisierten festen Phase und Messen einer Enzymaktivität an der festen Phase; sowie eine hierfür verwendete feste Phase.
    • Stand der Technik
  • In der modernen Medizin spielt die Messung von Spurensubstanzen, zum Beispiel von Tumormarkern oder Hormonen, eine immer wichtigere Rolle. Da eine Messung von derartigen Spurensubstanzen eine hohe Spezifität und Empfindlichkeit erfordert, wird in großem Umfang ein immunologisches Verfahren unter Ausnutzung einer Antigen- Antikörper-Reaktion herangezogen, das eine hohe Spezifität und Empfindlichkeit besitzt. Es sind verschiedene immunologische Verfahren bekannt. Hierzu gehören Verfahren mit fluoreszierenden Antikörpern, Radioimmunoassays, Enzymimmunoassays und dergl. Enzymimmunoassays, bei denen ein Enzym zur Markierung verwendet wird, haben unter anderem den Vorteil eines breiten Anwendungsbereichs, einer leichten Handhabung der Reagenzien, der Möglichkeit zur Behandlung einer großen Anzahl an Proben und dergl., so daß sie bei der Messung von Spurensubstanzen zur vorherrschenden Methode geworden sind.
  • Beim Enzymimmunoassay zur Messung einer Menge eines Antigens wird in breitem Umfang ein Sandwich-Verfahren angewandt, bei dem zur Trennung eines mit einem Antigen in einer Probe umgesetzten Enzym-markierten Antikörpers von einem nichtumgesetzten, mit Enzym verknüpften Antikörper (nachstehend als "B/F-Trennung" bezeichnet) die Reaktionslösung zusätzlich einer Antigen-Antikörper-Reaktion mit einem an einer festen Phase immobilisierten Antikörper unterworfen wird. Nach der B/F-Trennung wird die Aktivität des an der festen Phase gebundenen Enzyms gemessen. Jedoch erfordert die Antigen- Antikörper-Reaktion an einer festen Phase bei einer derartigen B/F-Trennung eine lange Zeitspanne für die Gleichgewichtseinstellung, woraus sich eine zeitaufwendige Messung ergibt und das Verfahren somit auf dem Gebiet der klinischen Chemie, wo rasche und kurzzeitige Messungen erforderlich sind, ungeeignet ist. In den letzten Jahren wurde es in Betracht gezogen, eine andere spezifische Reaktion, beispielsweise eine Avidin-Biotin-Reaktion anstelle einer Antigen-Antikörper-Reaktion anzuwenden, um die Reaktion an einer festen Phase rascher durchzuführen.
  • Die Anwendung einer derartigen spezifischen Bindung von Avidin-Biotin auf ein immunologisches Verfahren ist in der Histochemie bekannt; vergl. beispielsweise G. W. Anderson et al., J. Amer. Chem. Soc., Bd. 86 (1964), S. 1839. Bei diesem Verfahren werden ein biotinylierter Antikörper, der beispielsweise an ein Antigen in einem Gewebe gebunden ist, und ein Avidin-markiertes Enzym einer weiteren Umsetzung unter Bildung eines Antikörper/Biotin/Avidin/Enzym-Komplexes in dem Gewebe unterzogen. Die Lokalisierung eines Antigens im Gewebe wird dann aus dem erhaltenen Enzymreaktionsprodukt bestimmmt. Jedoch kann dieses Verfahren nicht zur Messung eines Antigens in einer Probe herangezogen werden.
  • JP-A-229368/1988 beschreibt die Anwendung der Avidin-Biotin- Reaktion für eine B/F-Trennung auf dem Gebiet der klinischen Chemie. Dieses Verfahren umfaßt die Umsetzung eines zu bestimmenden Antikörpers mit einem markierten Antigen, einem biotinylierten Antigen und einer Avidin-immobilisierten festen Phase unter Bildung eines Avidin/biotinyliertes Antigen/Antikörper/markiertes Antigen-Komplexes an der festen Phase und die Messung der Markierung zur Bestimmung einer Menge des Antikörpers.
  • Andererseits wird als Reagenz, das sich zur Messung einer Menge eines Antigens unter Anwendung der Avidin-Biotin- Reaktion eignet, von der Firma Nippon Mediphysics Co. Ltd. ein Reagenz zur Messung von Ferritin vertrieben, das eine Avidin-immobilisierte feste Phase, einen biotinylierten Antikörper und einen mit einem Radioisotop markierten Antikörper umfaßt. Jedoch erfordert die Messung mit diesem Reagenz immer noch eine lange Zeitdauer von 3 bis 4 Stunden.
  • Über ein ähnliches Verfahren wird im Program Abstract, General Subject No. 41, Proceeding of the 28th Annual Meeting of Japan Society Clinical Chemistry, abgehalten am 18. und 19. November 1988 berichtet. Dieses Verfahren umfaßt die Zugabe eines Enzym-markierten Antikörpers und eines biotinylierten Antikörpers zu einer Probe mit einem Gehalt an einem Antigen, um die Antigen-Antikörper-Reaktion in einer flüssigen Phase durchzuführen, die Zugabe einer Avidinimmobilisierten festen Phase, wodurch der gebildete Sandwich- Komplex von Enzym-markiertem Antikörper/Antigen/biotinyliertem Antikörper an der festen Phase adsorbiert wird, und die Messung der Enzymaktivität zur Bestimmung einer Menge des Antigens.
  • Bei diesem Verfahren läuft die Antigen-Antikörper-Reaktion in der flüssigen Phase ab und erreicht somit rasch den Gleichgewichts Zustand. Außerdem läuft die Avidin-Biotin- Reaktion an der festen Phase rascher als die Antigen- Antikörper-Reaktion an der festen Phase ab, was die Reaktionszeit verkürzt. Bei diesem Verfahren wird ferner eine fluoreszierende Substanz verwendet, um die unzureichende Empfindlichkeit aufgrund der Verkürzung der Reaktionszeit (auf etwa 10 Minuten) auszugleichen. Jedoch stellt dies immer noch keine substantielle Lösung des Problems der unzureichenden Empfindlichkeit dar, da der Antikörpertiter möglicherweise beeinträchtigt wird, weil der biotinylierte Antikörper durch Verknüpfen eines Biotinderivats mit einer Aminogruppe eines Antikörpers hergestellt wird und ferner ein Anteil des Avidins an der festen Phase möglicherweise ausfällt, was auf die Schwierigkeit der Verknüpfung von Avidin mit der festen Phase zurückzuführen ist.
  • EP-A-0 072 902 beschreibt ein Festphasenverfahren zur Bestimmung von karzinoembryonalem Antigen (CEA) durch Inkubieren der zu untersuchenden Probe mit einem ersten CEA- Antikörper, der an einen in Wasser unlöslichen Träger gebunden ist, und mit einem zweiten CEA-Antikörper, an den Peroxidase direkt oder über eine Biotin-Avidin-Brücke gebunden ist.
  • WO-87/04 794 beschreibt ein Reagenz zum Nachweis eines Analyten in einer Probenflüssigkeit, das ein inertes Teilchen, eine Mehrzahl von nicht-kovalent an der Oberfläche des Teilchens gebundenen Avidinmolekülen und derivatisierte Biotinmoleküle, die mit mindestens einem Teil der Avidinmoleküle komplexiert sind, umfaßt.
  • US -A-4 282 287 beschreibt ein Verfahren zum Modifizieren der Oberflächeneigenschaften einer Oberfläche, wobei Schichten eines ersten und zweiten Materials auf eine zu modifizierende Oberfläche aufgebracht werden, wobei das erste Material Avidin enthält und das zweite Material ein nicht-kovalentes, Biotin-modifiziertes Streckmittel umfaßt.
  • In FR-A-2 382 450 wird ein Produkt der Formel R¹-S-S-A-Z beschrieben, worin R¹ spezielle Pyridinderivate bedeutet, A einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet und Z eine spezielle Gruppe mit einem Gehalt an Carboxyl-und Carboimidbindungen bedeutet. Das vorstehende Produkt kann als Mittel für biofunktionelle Bindungen und zur Bildung von Thiolen eingesetzt werden.
  • In WO-A-90/04 786 wird eine Fängermembran beschrieben, bei der Biotin an die Membran gebunden wird und ein Komplex mit einem Gehalt an einem Antikörper und Antigenen an das Enzym und den Streptavadin/Biotin-Komplex gebunden wird. Dabei kann das Streptavidin an eine mit Biotin beschichtete Membran gebunden werden, und biotinyliertes BSA wird an eine mit Streptavidin beschichtete Membran gebunden.
  • In EP-A-0 077 671 wird ein Reagenz zum Nachweis einer immunologischen Substanz beschrieben, das ein für das nachzuweisende Substrat spezifisches immunologisches Homologes, ein wasserlösliches Polymeres mit einer Nettoladung von nicht mehr als 0 und eine Einrichtung zur Bindung des wasserlöslichen Polymeren an das Homologe umfaßt. Bei der Bindungseinrichtung kann es sich um einen Biotin/Avidin-Komplex handeln.
    • Kurze Beschreibung der Erfindung
  • Unter diesen Umständen haben die Erfinder umfangreiche Untersuchungen in Bezug auf die Herstellung von biotinyliertem Antikörper ohne Beeinträchtigung des Antikörpertiters und in Bezug auf Maßnahmen zur Erhöhung der Menge an Avidin an der festen Phase durchgeführt, um die vorerwähnte Schwierigkeit einer unzureichenden Empfindlichkeit zu überwinden. Als Ergebnis dieser Untersuchungen wurde festgestellt, daß die erstgenannte Schwierigkeit gelöst werden kann, indem man das Biotinderivat an eine Thiolgruppe eines Fab'-Fragments des Antikörpers bindet, daß das zweite Problem gelöst werden kann, indem man Avidin an die feste Phase über eine biotinylierte, hochmolekulare Substanz zur Erhöhung der Empfindlichkeit bindet, daß die Empfindlichkeit weiter gesteigert werden kann, wenn man beide Maßnahmen zusammen einsetzt, daß auch bei Verwendung eines herkömmlichen biotinylierten Antikörpers und einer Avidin-immobilisierten festen Phase die Empfindlichkeit gesteigert werden kann, wenn diese in Form von biotinyliertem Antikörper-gebundenem-Avidinimmobilisierter-Festphase verwendet werden, wobei der biotinylierte Antikörper an die Avidin-immobilisierte- Festphase gebunden ist, und daß dieses letztgenannte Verfahren in vorteilhafter Weise zur Messung eines Antigens nur durch Zugabe des Enzym-markierten Antikörpers durchgeführt werden kann, was im Hinblick auf ein leichteres Herstellungsverfahren vorteilhaft ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Enzymimmunoassay für ein Antigen unter Verwendung einer festen Phase bereitgestellt, bei dem folgendes eingesetzt wird: (a') eine biotinylierter Antikörper-immobilisierte Festphase, d. h. ein biotinylierter Antikörper, bei dem ein Biotinderivat an eine Thiolgruppe eines Fab'-Fragments des Antikörpers, der an einer festen Phase immobilisiert ist, über eine Substanz gebunden ist, die aus der Gruppe Avidin, Streptavidin und ein Derivat davon ausgewählt ist, wobei diese Substanz an den Biotinrest des biotinylierten Antikörpers gebunden ist und ferner an die feste Phase über eine Verknüpfung zwischen einem anderen Biotinderivat und einer an die feste Phase gebundenen, hochmolekularen Substanz gebunden ist, und (b') ein Enzymmarkierter Antikörper, wobei die beiden Antikörper (a') und (b') auf das gleiche, zu bestimmende Antigen gerichtet sind, aber unterschiedliche Epitope des Antigens erkennen.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird der erfindungsgemäße Enzymimmunoassay durch gleichzeitige Umsetzung des Enzym-markierten Antikörpers (b'), einer Probe mit einem Gehalt an einem zu bestimmenden Antigen und der festen Phase (a') durchgeführt.
  • Die Erfindung stellt ferner eine feste Phase für einen Enzymimmunoassay bereit, die eine feste Phase mit einem immobilisierten, biotinylierten Antikörper umfaßt, wobei ein Biotinderivat an eine Thiolgruppe eines Fab'-Fragments des Antikörpers, der auf das zu bestimmende Antigen gerichtet ist, über eine aus der Gruppe Avidin, Streptavidin und ein Derivat davon gebunden ist, wobei diese Substanz an den Biotinrest des biotinylierten Antikörpers gebunden ist und ferner an die feste Phase über eine Verknüpfung zwischen einem anderen Biotinderivat und einer an die feste Phase gebundenen hochmolekularen Substanz gebunden ist (nachstehend als "feste Phase II" bezeichnet)
    • Kurze Beschreibung der Zeichnung
  • Fig. 1 zeigt eine Eichkurve für ein Antigen (AFP) in einer durch Enzymimmunoassay vermessenen Probe unter Einsatz der erfindungsgemäßen festen Phase II unter Verwendung eines Biotin Fab'.
  • Fig. 2 zeigt eine Eichkurve für ein Antigen (CEA) in einer durch Enzymimmunoassay vermessenen Probe unter Einsatz der erfindungsgemäßen festen Phase II unter Verwendung eines Biotin Fab'.
  • Fig. 3 zeigt eine Eichkurve für ein Antigen (AFP) in einer durch Enzymimmunoassay vermessenen Probe unter Einsatz der erfindungsgemäßen festen Phase II unter Verwendung eines Biotin-Fab' oder einer herkömmlichen festen Phase mit immobilisiertem Avidin, wobei die Empfindlichkeit im Fall der erfindungsgemäßen festen Phase II und die Empfindlichkeit im Fall der herkömmlichen festen Phase miteinander verglichen werden.
    • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die feste Phase I weist eine Struktur auf, bei der an einer festen Phase ein Komplex aus einer hochmolekularen Substanz/Biotin/Avidin (oder Streptavidin oder ein Derivat davon) immobilisiert ist, wobei in dem Komplex eine hochmolekulare Substanz biotinyliert ist und Avidin, Streptavidin oder ein Derivat davon an den biotinylierten Rest gebunden ist. Mit anderen Worten, weist die feste Phase I eine Struktur auf, bei der Avidin, Streptavidin oder ein Derivat davon über die biotinylierte hochmolekulare Substanz an einer festen Phase immobilisiert ist. Die erfindungsgemäße feste Phase II weist eine Struktur auf, bei der der biotinylierte Antikörper an die feste Phase I am Rest von Avidin und dergl. oder an eine feste Phase gebunden ist, an die eine aus der Gruppe Avidin, Streptavidin und ein Derivat davon ausgewählte Substanz direkt über eine Avidin-Biotin- Verknüpfung gebunden ist.
  • Die feste Phase I kann beispielsweise durch Biotinylieren einer hochmolekularen Substanz mit einem Biotinderivat (nachstehend als "Biotinylierungsreagenz" bezeichnet), durch Verknüpfen der biotinylierten hochmolekularen Substanz mit einer festen Phase über den Rest der hochmolekularen Substanz und durch weiteres Verknüpfen von Avidin, Streptavidin oder einem Derivat davon (z.B. einem neutralisierten Avidin, bei dem die freie(n) Aminogruppe(n) beispielsweise durch Acetylierung mit Essigsäureanhydrid vorher blockiert sind) mit dem Biotinrest. Die hochmolekulare Substanz kann an die feste Phase gemäß verschiedenen Methoden, einschließlich physikalischer Adsorption, kovalenter Bindung und dergl., gebunden werden.
  • Die erfindungsgemäße feste Phase II läßt sich beispielsweise herstellen, indem man einen biotinylierten Antikörper, bei dem das Biotinderivat an eine Thiolgruppe eines Fab'- Fragments eines Antikörpers gebunden ist, an die feste Phase I oder an eine feste Phase bindet, an die Avidin, Streptavidin oder ein Derivat davon direkt über eine Avidin- Biotin-Bindung gebunden ist.
  • Die erfindungsgemäß verwendete hochmolekulare Substanz weist eine funktionelle Gruppe auf, die mit dem Biotinylierungsreagenz reaktiv ist und zur physikalischen Adsorption oder kovalenten Bindung an der festen Phase, einschließlich Proteinen [zum Beispiel Rinderserumalbumin (BSA), Ovalbumin (nachstehend als "OA" abgekürzt), Immunoglobulin, Kollagen, Gelatine, Casein und dergl.], Polysaccharide (zum Beispiel Dextran, Pullulan und dergl.) und dergl., gebunden ist.
  • Beim erfindungsgemäß verwendeten Biotinylierungsreagenz handelt es sich um ein Biotinderivat mit einer funktionellen Gruppe, die mit der hochmolekularen Substanz unter Bildung einer kovalenten Bindung reaktiv ist. Beispiele für Biotinylierungsreagenzien sind Biotin-N-hydroxysuccinimidester (nachstehend als "NHS-Biotin" bezeichnet), N- Biotinyl-6-aminocaproyl-N-hydroxysulfosuccinimidester (nachstehend als "NHS-LC-Biotin" bezeichnet), Sulfosuccinimidyl-2-(biotinamido)-ethyl-1,3-dithiopropionat (nachstehend als "NHS-SS-Biotin" bezeichnet) und dergl. (vergl. Analytical Biochemistry, Bd. 171 (1988), S. 1-32).
  • Das Biotinylierungsreagenz und die hochmolekulare Substanz können aneinander gebunden werden, indem man 1 Mol der hochmolekularen Substanz mit vorzugsweise etwa 1 bis 100 Mol des Biotinylierungsreagenz in Abhängigkeit von der Art des Biotinylierungsreagenz und der hochmolekularen Substanz umsetzt. Die Umsetzung kann unter solchen Bedingungen durchgeführt werden, daß die hochmolekulare Substanz und das Biotinylierungsreagenz aneinander in ausreichendem Maße gebunden werden und der Rest an der hochmolekularen Substanz, wo die feste Phase gebunden wird, nicht inaktiviert wird, beispielsweise bei pH-Bedingungen der Lösung im Bereich von etwa 4 bis etwa 10, einer Reaktionstemperatur von etwa 4 bis etwa 45ºC und einer Reaktionszeit von etwa 10 Minuten bis etwa 24 Stunden.
  • Die auf diese Weise hergestellte biotinylierte hochmolekulare Substanz kann an die feste Phase nach einem üblichen Verfahren gebunden werden, beispielsweise durch physikalische Adsorption oder durch kovalente Bindung; jedoch sollte das Verfahren nicht die Bindung zwischen dem Biotinrest der entstandenen biotinylierten, hochmolekularen Substanz/immobilisierten festen Phase und Avidin, Streptavidin oder einem Derivat dav6n beeinträchtigen. Beispielsweise kann das Verfahren zur physikalischen Adsorption durchgeführt werden, indem man die feste Phase in eine gepufferte Lösung der biotinylierten hochmolekularen Substanz (1-1000 ug/ml) taucht. Das Verfahren zur kovalenten Bindung kann durchgeführt werden, indem man beispielsweise die biotinylierte hochmolekulare Substanz in Form einer gepufferten Lösung (1-1000 ug/ml, pH-Wert 5 bis 7) mit einer festen Phase mit einem Gehalt an einer Carboxylgruppe, wobei eine Vorbehandlung mit einer gepufferten Lösung von 1-Ethyl- 3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid (5 bis 200 mg/ml) für 1 bis 24 Stunden durchgeführt worden ist, umsetzt.
  • Die erhaltene feste Phase, an die die biotinylierte hochmolekulare Substanz gebunden ist, wird sodann in eine gepufferte Lösung von Avidin, Streptavidin oder einem Derivat davon (1 bis 1000 ug/ml) für 1 bis 20 Stunden eingetaucht, wodurch man die feste Phase I erhält.
  • Die erfindungsgemäße feste Phase II kann aus der festen Phase I oder einer festen Phase, die durch Eintauchen einer herkömmlichen festen Phase in eine gepufferte Lösung von Avidin, Streptavidin oder einem Derivat davon (1 bis 1000 ug/ml) für 1 bis 20 Stunden erhalten worden ist, hergestellt werden, d. h. durch Eintauchen der festen Phase in eine gepufferte Lösung des biotinylierten Antikörpers (1 bis 1000 pMol/ml) für 1 bis 20 Stunden.
  • Bei dem in der festen Phase I und in der erfindungsgemäßen festen Phase II verwendeten Festphasenmaterial kann es sich um ein beliebiges herkömmliches Material handeln, das den Komplex in stabiler Weise immobilisieren kann und eine für den Wasch- und Meßvorgang geeignete Gestalt aufweist, einschließlich Kügelchen, Platten, Teströhrchen, Latex und dergl. aus Polysterol, Polypropylen, Polyvinylchlorid, Glas, Keramik, Agarose und dergl., oder um beliebige andere Substanzen, die herkömmlicherweise bei Enzymimmunoassay- Verfahren herangezogen werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Sandwich- Immunoassay für ein Antigen unter Verwendung des biotinylierten Antikörpers, des Enzym-markierten Antikörpers und der festen Phase, an der Avidin, Streptavidin oder ein Derivat davon immobilisiert ist, bereit, wobei es sich beim biotinylierten Antikörper um einen Antikörper handelt, bei dem das Biotinderivat an eine Thiolgruppe des Fab'-Fragments des Antikörpers gebunden ist. Ein derartiger biotinylierter Antikörper kann hergestellt werden, indem man zunächst das Fab'-Fragment gemäß einem bekannten Verfahren, z.B. gemäß dem in "Zoku Seikagaku Jikken Koza 5 Men-eki Seikagaku Kenkyuho (Biochemical Experiment Course, 2. Serie, Bd. 5, Method of Study in Immunological Biochemistry)", Tokyo Kagaku Dojin, 1986, S. 89-112, beschriebenen Verfahren, herstellt und anschließend das Biotinderivat mit der Thiolgruppe des Fab'- Fragments verknüpft.
  • Bei dem beim vorstehenden Verfahren zur Herstellung des biotinylierten Antikörpers verwendeten Biotinderivat handelt es sich um ein Biotinylierungsreagenz mit einer funktionellen Gruppe, die mit einer Thiolgruppe reaktiv ist, beispielsweise einer Iodacetylgruppe oder Maleinimidgruppe, einschließlich N-Iodacetyl-N-biotinylhexylendiamin, 3-(N- Maleinimidobutyryl)-biocytin (MBB), 3-(N- Maleinimidopropionyl)-biocytin, 3-(N-Maleinimidocaproyl)- biocytin, N-Biotinyl-N-(6-maleinimidohexanoyl)-hydrazid und dergl.
  • Die Mengen des bei der vorstehenden Umsetzung verwendeten Fab'-Fragments und des Biotinylierungsreagenz können je nach Art des Biotinylierungsreagenz variieren, wobei aber vorzugsweise etwa 5 bis etwa 20 Mol Biotinylierungsreagenz pro 1 Mol Fab'-Fragment verwendet werden. Die Umsetzung wird unter solchen Bedingungen durchgeführt, daß das Fab'-Fragment und das Biotinylierungsreagenz in ausreichendem Maße aneinander gebunden werden und der Antikörpertiter nicht beeinträchtigt wird, beispielsweise bei pH-Bedingungen der Lösung von 6 bis etwa 7, einer Reaktionstemperatur von etwa 4 bis etwa 40ºC und vorzugsweise etwa 20 bis etwa 30ºC und einer Reaktionszeit von etwa 1 bis etwa 24 Stunden.
  • Beim erfindungsgemäßen Enzymimmunoassay wird die erfindungsgemäße feste Phase II, bei der der auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellte biotinylierte Antikörper vorher an die feste Phase I gebunden ist, oder die feste Phase, an der Avidin, Streptavidin oder ein Derivat davon direkt immobilisiert ist, für den Immunoassay eines Antigens eingesetzt. Dabei werden eine Probenlösung (1 bis 100 ul und vorzugsweise 5 bis 50 ul) und eine gepufferte Lösung des Enzym-markierten Antikörpers (50 bis 1000 ul und vorzugsweise 100 bis 500 ul) zur festen Phase II unter Bildung eines Antigen-Enzym-markierter-Antikörper-Komplexes an der festen Phase gegeben.
  • Die Reaktionszeit beim vorstehenden Immunoassay beträgt etwa 1 bis etwa 20 Minuten und vorzugsweise etwa 5 bis etwa 15 Minuten jeweils für die Umsetzung der Antigen-Antikörper- Reaktion und der Avidin-Biotin-Reaktion bei Verwendung von Phase I. Im Fall des einstufigen Verfahrens zur gleichzeitigen Durchführung der Umsetzungen kann die Reaktionszeit etwa 1 bis etwa 30 Minuten und vorzugsweise etwa 5 bis etwa 20 Minuten betragen. Bei Verwendung der erfindungsgemäßen festen Phase II kann die Antigen- Antikörper-Reaktion für etwa 1 bis etwa 30 Minuten und vorzugsweise für etwa 5 bis etwa 20 Minuten durchgeführt werden.
  • Nach beendeter Umsetzung wird die feste Phase gewaschen und mit einer Substratlösung (50 bis 1000 ul und vorzugsweise 100 bis 500 ul) versetzt, wonach sich eine Enzymreaktion von 1 bis 30 Minuten und vorzugsweise 5 bis 20 Minuten im Fall einer kolorimetrischen Bestimmung oder von 15 Sekunden bis 15 Minuten und vorzugsweise 1 bis 5 Minuten im Fall einer fluorimetrischen Bestimmung anschließt. Nach beendeter Umsetzung wird die Reaktionslösung direkt oder nach Zugabe einer geeigneten Menge eines Reagenz zur Beendigung der Reaktion der kolorimetrischen oder fluorimetrischen Bestimmung unterworfen. Die Konzentration des Antigens in der Probe wird sodann aus der Eichkurve, die vorher unter Verwendung von Antigenlösungen bekannter Konzentration aufgestellt worden ist, berechnet.
  • Sämtliche vorstehenden Umsetzungen werden bei 10 bis 45ºC und vorzugsweise bei 20 bis 40ºC durchgeführt. Die Biotin-Avidin- Reaktion und die Antigen-Antikörper-Reaktion werden bei einem pH-Wert von 5 bis 9 und vorzugsweise bei etwa neutralem pH- Wert durchgeführt. Die Enzymaktivität wird um den optimalen pH-Wert für das Markierungsenzym gemessen.
  • Beim Markierungsenzym kann es sich um ein beliebiges Enzym handeln, das üblicherweise für Enzymimmunoassays verwendet wird. Beispiele hierfür sind β-D-Galactosidase (β-Gal), Peroxidase (POD), alkalische Phosphotase (ALP) und dergl. Die Messung der Enzymaktivität an der festen Phase wird durch Zugabe einer geeigneten Menge an Substrat zum Reaktionssystem und durch anschließende Messung der Enzymaktivität nach einem herkömmlichen Verfahren beispielsweise durch kolorimetrische oder fluorimetrische Messung, gemessen. Beispiele für zur Messung der Enzymaktivität verwendete Substrate sind o- Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid, 4-Methylumbelliferyl-β-Dgalactopyranosid und dergl. im Fall des Markierungsenzyms β- Gal; Wasserstoffperoxid mit 2,2'-Azino-bis-3- ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS), Wasserstoffperoxid mit 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, Wasserstoffperoxid mit o- Phenylendiamin und dergl. im Fall von POD; p- Nitrophenylphosphorsäure, (4-Methyl)umbelliferylphosphorsäure und dergl. im Fall von ALP.
  • Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann eine Menge des in einer Probe, wie Humanserum, Plasma, Urin und dergl., vorhandenen Antigens mit hoher Empfindlichkeit und in äußerst kurzer Zeit gemessen werden. Durch Kombination des Verfahrens und der Festphase gemäß der Erfindung kann die Empfindlichkeit weiter verbessert und der gewünschte Immunoassay in noch zweckmäßigerer Weise durchgeführt werden.
  • Nachstehend wird die Erfindung anhand der folgenden Beispiele, Herstellungsbeispiele und Vergleichsbeispiele, die jedoch nicht als Beschränkung anzusehen sind, näher erläutert.
    • Beispiel 1 [Herstellung von biotinyliertem Antikörper (Biotin-Fab')] (a) Herstellung von monoklonalem Antikörper gegen α- Fetoprotein (AFP):
  • Ein Hybridoma wurde nach einem Polyethylenglykol-Verfahren unter Verwendung von Milzzellen von mit AFP immunisierten BALB/c-Mäusen und Mäuse-Myelomzellen FO hergestellt. Das erhaltene Hybridoma wurde zweimal gemäß einem limitierenden Verdünnungsverfahren geklont, wodurch man ein anti-AFP- monoklonale Antikörper bildendes Hybridoma NHAFP-14 erhielt. Dieses Hybridoma wurde auf einem ASF-Kulturmedium 103 (Produkt der Firma Ajinomoto K. K.) gezüchtet, und ein anti- AFP-monoklonaler Antikörper (MNHAFP-14) wurde unter Verwendung einer Protein A-Agarose-Säule aus dem Kulturüberstand gereinigt.
    • (b) Herstellung von Fab':
  • Die beim vorstehenden Verfahren (a) erhaltene anti-AFP- monoklonale Antikörperlösung (MNHAFP-14; 10 mg/2 ml) wurde gegen 0,1 M Acetatpuffer (pH-Wert 4,2) dialysiert. Sodann wurde eine Pepsinlösung (Produkt der Firma Boehringer Mannheim GmbH; 20 mg/ml, 0,1 M Acetatpuffer; 100 ul) zugesetzt, und das Gemisch wurde 20 Stunden bei 37ºC umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert und der Überstand über eine Sephacryl -S-200-Säule ( 1,5 cm x 50 cm, Elutionsmittel: 0,1 M Phosphatpuffer, pH-Wert 6,0) gegeben, wobei man eine F(ab')&sub2;-Fraktion erhielt. Die F(ab')&sub2;-Fraktion wurde mit 2-Mercaptoethylamin-hydrochlorid in einer Endkonzentration von 10 mMol/Liter versetzt, und das Gemisch wurde 1 Stunde bei 37ºC umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert und der Überstand wurde über eine Sephacryl -S 200-Säule ( 1,5 cm x 50 cm, Elutionsmittel: 0,1 M Phosphatpuffer, pH-Wert 6,0) gegeben, wobei man eine Fab'- Fraktion erhielt.
    • (c) Herstellung von biotinyliertem Antikörper (Biotin-Fab'):
  • Gemäß dem in Anal. Biochem., Bd. 149 (1985), S. 529-536 beschriebenen Verfahren, wurde 3-(N-Maleinimidobutyryl)biocytin (MBB) hergestellt. Das beim vorstehenden Verfahren (a) hergestellte Fab' (1,66 mg/1,3 ml) wurde mit der MBB- Lösung (0,5 mg/ml in 0,1 M Phosphatpuffer, pH-Wert 6,0; 0,5 ml) versetzt. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde über eine Sephadex -G-25-Säule ( 1,5 cm x 30 cm, Elutionsmittel: 0,1 M Phosphatpuffer, pH-Wert 6,0) gegeben. Man erhielt das gewünschte Biotin-Fab'.
    • Beispiel 2 [Herstellung von Enzym-markiertem Antikörper (POD- Fab')] (a) Herstellung von anti-AFP-monoklonalem Antikörper:
  • Gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 (a) wurde ein anti-AFP- monoklonaler Antikörper (MNHAFP-18) hergestellt.
    • (b) Herstellung von Fab':
  • Unter Verwendung des gemäß dem vorstehenden Verfahren (a) hergestellten anti-AFP-monoklonalen Antikörpers (MNHAFP-18) wurde das Verfahren von Beispiel 1 (b) unter Bildung des Fab' wiederholt.
    • (c) Herstellung von POD-Maleinimid:
  • POD (Produkt der Firma Boehringer Mannheim Gmbh; 6 mg) wurde in 0,1 M Phosphatpuffer (0,8 ml; pH-Wert 7,0) gelöst. N-(7- Maleinimidobutyryloxy)-succinimid (Produkt der Firma Dojin Kagaku K. K.; 80 mg/ml N,N'-Dimethylformamid; 50 ul) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei 30 ºC umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde über eine Sephadex -G-25-Säule ( 1,5 cm x 30 cm, Elutionsmittel: 0,1 M Phosphatpuffer, pH-Wert 6,0) gegeben. Man erhielt eine POD-Maleinimid-Fraktion.
    • (d) Herstellung von POD-Fab':
  • Das gemäß dem vorstehenden Verfahren (b) hergestellte Fab' (1 mg) wurde mit dem gemäß dem vorstehenden Verfahren (c) hergestellten POD-Maleinimid (1 mg) versetzt. Das Gemisch wurde 20 Stunden in einem Kühlraum umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert und der Überstand wurde über eine Sephacryl -S-200-Säule ( 1,5 cm x 50 cm, Elutionsmittel: 0,1 M Phosphatpuffer, pH-Wert 6,5) gegeben. Man erhielt die gewünschte POD-Fab'-Fraktion.
    • Herstellungsbeispiel (Herstellung von herkömmlicher Avidinimmobilisierter fester Phase)
  • Avidin (Produkt der Firma Wako Jun-yaku K. K.; Reagenz für die Biochemie, 5 mg) wurde in 20 mM Carbonatpuffer (pH-Wert 9,6, mit einem Gehalt an 0,15 M Natriumchlorid; 10 ml) gelöst. Etwa 30 Polystyrolkügelchen (Typ C, Produkt der Firma Sumitomo Bakelite Co., Ltd., als feste Phase) wurden zu der vorstehenden Lösung gegeben und 20 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen, um das Avidin an der festen Phase zu adsorbieren. Diese feste Phase wurde mehrfach mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, in 1 % Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung (in 0,1 M Phosphatpuffer, pH- Wert 7,0) getaucht und sodann 20 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Man erhielt die gewünschte feste Phase mit immobilisiertem Avidin.
    • Vergleichsbeispiel 1 [AFP-Immunoassay unter Verwendung von Biotin-Fab' (2 Stufen)]
  • Humanes AFP (Produkt der Firma Daco Co.) wurde in Humanserum ohne AFP gelöst. Die Lösung wurde auf AFP-Konzentrationen von 0 bis 1000 ng/ml eingestellt. Die Probe (50 ul) wurde in ein Teströhrchen gegeben. Eine Antikörperlösung (400 ul), die durch Zugabe von 10 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0, mit einem Gehalt an 0,15 M Natriumchlorid und 0,5 % BSA) zu einem Gemisch des Biotin-Fab' (Fab'-Konzentration 160 ug/ml; 50 ul) und des POD-Fab' (POD-Aktivität 26,1 IU/ml; 500 ul) in einer solchen Menge, daß sich ein Gesamtvolumen von 10 ml ergab, hergestellt worden war, wurde zugegeben. Das Gemisch wurde 10 Minuten bei 37ºC inkubiert. Anschließend wurde die Reaktionslösung zu der gemäß dem Herstellungsbeispiel erhaltenen festen Phase mit immobilisiertem Avidin gegeben. Das Gemisch wurde 10 Minuten bei 37ºC inkubiert. Nach beendeter Umsetzung wurde die Reaktionslösung durch Absaugen entfernt. Eine Waschlösung (physiologische Kochsalzlösung; 2 ml) wurde zu der festen Phase gegeben. Nach Schütteln wurde die Waschlösung durch Absaugen entfernt. Dieser Waschvorgang wurde weitere zweimal wiederholt. Nach dem Waschen wurde eine Substratlösung (ABTS 1 mg/ml, 0,01 % Wasserstoffperoxid, 0,1 m Citratpuffer, pH-Wert 4,2; 500 ul) zu der erhaltenen festen Phase gegeben. Das Gemisch wurde 15 Minuten bei 37ºC umgesetzt. Das Gemisch wurde mit 5mM Natriumazid (2 ml) als Mittel zum Stoppen der Reaktion versetzt. Die Absorption bei 415 nm wurde gemessen.
    • Vergleichsbeispiel 2 (Herstellung von fester Phase 1) (a) Herstellung von Biotin-BSA:
  • BSA (Produkt der Firma Oriental Yeast K. K., F-V; 30 mg) wurde in 0,1 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0; 1 ml) gelöst. Die Lösung wurde mit einer NHS-SS-Biotin-Lösung (Produkt der Firma Pierce Chemical Co., 16,8 mg/ml in 0,1 M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0; 1 ml) versetzt. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei 30ºC umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde über eine Sephadex -G- 25-Säule ( 1,5 cm x 30 cm, Elutionsmittel: 50 mM Carbonatpuffer, pH-Wert 9,6) gegeben. Man erhielt eine Biotin-BSA-Fraktion.
    • (b) Herstellung von fester Phase I
  • Das gemäß dem vorstehenden Verfahren (a) hergestellte Biotin- BSA wurde mit 50 mM Carbonatpuffer (pH-Wert 9,6) unter Einstellung einer Biotin-BSA-Konzentration von 10 ug/ml verdünnt. Diese Lösung (100 ul) wurde in die einzelnen Vertiefungen einer Platte (Produkt der Firma Nunc Co., Immunoplate I, 96 Vertiefungen) gegossen und 1 Stunde zur Immobilisierung bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach mehrmaligem Waschen der Vertiefungen mit physiologischer Kochsalzlösung wurde eine Avidinlösung (Avidin D, Produkt der Firma Vector Laboratories, Inc., 50 ug/ml in 0,1 M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0; 100 ul) in die einzelnen Vertiefungen gegossen und 1 Stunde bei 37ºC umgesetzt. Nach mehrmaligem Waschen der Vertiefungen mit physiologischer Kochsalzlösung, wurde 3 % BSA-Lösung (in 50 mM Carbonatpuffer, pH-Wert 9,6; 250 ul) zugegeben. Nach 1- stündiger Behandlung bei 37ºC erhielt man die feste Phase I.
    • Beispiel 3 [Herstellung von Enzym-znarkiertein Antikörper (β- Gal-Fab')] (a) Herstellung von Fab':
  • Unter Verwendung des in Beispiel 2 (a) hergestellten Anti- AFP-monoklonalen-Antikörpers (MNHAFP-18) wurde das Verfahren von Beispiel 2 (b) wiederholt. Man erhielt Fab'.
    • (b) Herstellung von β-Gal-Maleininid:
  • β-Gal (Produkt der Firma Oriental Yeast K. K., 10 mg) wurde in 0,1 M Phosphatpuffer (pH-Wert 6,0, 2 ml) gelöst. Diese Lösung wurde mit einer o-Phenylendimaleinimid-Lösung (Produkt der Firma Aldrich Co., 25 mg/ml in N,N'-Dimethylformamid; 100 ul) versetzt. Das Gemisch wurde 20 Minuten bei 30ºC umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert und der Überstand über eine Sephadex -G-25-Säule ( 1,5 cm x 30 cm, Elutionsmittel: 0,1 M Phosphatpuffer, pH-Wert 6,0) gegeben. Man erhielt eine β-Gal-Maleinimid-Fraktion.
    • (c) Herstellung von β-Gal-Fab':
  • Das gemäß dem vorstehenden Verfahren (a) hergestellte Fab' (1 mg) wurde mit dem gemäß dem Verfahren (b) hergestellten β- Gal-Maleinimid (3,9 mg) versetzt. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 30ºC umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde über ein Sepharoser 68-Säule ( 1,5 cm x 50 cm, Elutionsmittel: 10 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 6,5 mit einem Gehalt an 0,1 % BSA) gegeben. Man erhielt ein β-Gal-Fab'-Fragment.
    • Vergleichsbeispiel 3 (AFP-Immunoassay)
  • Die im Vergleichsbeispiel 1 hergestellte Probe (20 ul) wurde in die einzelnen Vertiefungen der Phase I gegossen. Eine Antikörperlösung (100 ul) wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde 15 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die bei diesem Verfahren verwendete Antikörperlösung wurde durch Zugabe von 0,01 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0, mit einem Gehalt an 0,1 M Natriumchlorid und 0,2 % BSA) zu dem gemäß Beispiel 1 hergestellten Biotin-Fab' (16 ug) und dem β-Gal-Fab' (20 U) unter Einstellen eines Gesamtvolumens von 10 ml hergestellt. Nach beendeter Umsetzung wurde die Reaktionslösung durch Absaugen entfernt. Sodann wurde eine Waschlösung (physiologische Kochsalzlösung) in die Vertiefung gegeben, wonach die Waschlösung durch Absaugen entfernt wurde. Dieses Waschverfahren wurde weitere 4 mal wiederholt. Nach dem Waschen wurde eine Substratlösung [o-Nitrophenyl-β-D- galactopyranosid, 3,01 g/l in 50 mM Phosphatpuffer (mit einem Gehalt an 75 mM Natriumchlorid, 0,04 % MgCl&sub2;, 0,05 % BSA, 6 % Ethylenglykol); 100 ul] in die resultierende Vertiefung gegeben. Das Gemisch wurde 10 Minuten bei 37ºC umgesetzt. Anschließend wurde die Reaktion durch Zugabe von 1 % Natriumcarbonat (100 ul) gestoppt. Die Absorption bei 415 nm (Hauptabsorption) und bei 600 nm (Nebenabsorption) wurde gemessen.
    • Vergleichsbeispiel 4
  • Das Verfahren von Vergleichsbeispiel 3 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß die herkömmliche feste Phase mit immobilisiertem Avidin, die gemäß dem Verfahren von Vergleichsbeispiel 2, mit der Ausnahme, daß das Biotin-BSA nicht immobilisiert war, hergestellt worden war, anstelle der festen Phase I verwendet wurde.
    • Vergleichsbeispiel 5 [1=unoassay auf karzinoembryonales Antigen (CEA)] (a) Herstellung von Biotin-Fab':
  • Der gewünschte Biotin-Fab'-anti-CEA-Antikörper wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellt, mit der Ausnahme, daß ein anti-CEA-monoklonaler Antikörper (MA3564F, Produkt der Firma Oriental Yeast K. K.) anstelle des anti-AFP- monoklonalen Antikörpers verwendet wurde.
    • (b) Herstellung von POD-Fab':
  • Der gewünschte POD-Fab' (anti-CEA-Antikörper) wurde unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel 2 hergestellt, mit der Ausnahme, daß ein anti-CEA-monoklonaler Antikörper (239-1, Produkt der Firma Morinaga Seikagaku Kenkyusho) anstelle des anti-AFP-monoklonalen Antikörpers verwendet wurde.
    • (c) Herstellung von fester Phase I:
  • Die Verfahren von Vergleichsbeispiel 2 wurden unter Verwendung von Biotin-BSA unter Bildung der erfindungsgemäßen festen Phase I wiederholt. Die Verfahren von Vergleichsbeispiel 4 wurden ebenfalls unter Bildung von herkömmlicher fester Phase mit immobilisiertem Avidin als Kontrolle wiederholt.
    • (d) CEA-Immunoassay:
  • Humanes CEA (Produkt der Firma Morinaga Seikagaku Kenkyusho) wurde in Humanserum ohne CEA gelöst. Die Lösung wurde auf CEA-Konzentrationen im Bereich von 0 bis 50 ng/ml eingestellt. Diese Proben (50 ul) wurden in die einzelnen Vertiefungen der gemäß dem Verfahren (c) hergestellten festen Phase gegossen. Eine Antikörperlösung (100 ul), die durch Zugabe von 0,01 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0, mit einem Gehalt an 0,1 M Natriumchlorid und 0,2 % BSA) zum Biotin-Fab' (10 ug) und zum POD-Fab' (15 IU) in einer solchen Menge, daß das Gesamtvolumen 10 ml betrug, hergestellt worden war, wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde 15 Minuten bei 37ºC inkubiert. Nach beendeter Umsetzung wurde die Reaktionslösung durch Absaugen entfernt. Die Vertiefung wurde mit einer Waschlösung (physiologischer Kochsalzlösung) versetzt, wonach die Waschlösung durch Absaugen entfernt wurde. Dieses Waschverfahren wurde weitere 4 mal wiederholt. Nach dem Waschen wurde eine Substratlösung (ABTS 1 mg/ml, 0,01 % Wasserstoffperoxid, in 0,1 M Citratpuffer, pH-Wert 4,2; 100 ul) in die resultierende Vertiefung gegeben. Das Gemisch wurde 10 Minuten bei 37ºC umgesetzt. Sodann wurde das Gemisch mit 5 mM Natriumazid (100 ul) zur Beendigung der Umsetzung versetzt. Die Absorption bei 415 nm (Hauptabsorption) und bei 650 nm (Nebenabsorption) wurde gemessen.
    • Beispiel 4 (Herstellung der erfindungsgemäßen festen Phase II)
  • Die gemäß Vergleichsbeispiel 2(a) hergestellte feste Phase I wurde mit der gemäß Beispiel 1 hergestellten Biotin-Fab'- Lösung (1,6 ug/ml in 10 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0, mit einem Gehalt an 0,15 M NaCl und 0,1 % BSA; 100 ul) versetzt. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei 37ºC umgesetzt. Man erhielt die erfindungsgemäße feste Phase II für einen AFP- Immunoassay.
    • Beispiel 5 (Herstellung der erfindungsgemäßen festen Phase II)
  • Die gemäß Vergleichsbeispiel 2 (b) hergestellte feste Phase I wurde mit der gemäß Vergleichsbeispiel 5 (a) hergestellten Biotin-Fab'-Lösung (ug/ml in 10 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0, mit einem Gehalt an 0,15 M NaCl und 0,1 % BSA); 100ul) versetzt. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei 37ºC umgesetzt. Man erhielt die erfindungsgemäße feste Phase II für einen CEA- Immunoassay.
    • Beispiel 6 (Herstellung der erfindungsgemaßen festen Phase II)
  • Die gemäß dem Verfahren von Vergleichsbeispiel 4 hergestellte herkömmliche feste Phase mit immobilisiertem Avidin wurde mit der gemäß Beispiel 1 hergestellten Biotin-Fab'-Lösung (1,6 ug/ml in 10 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0, mit einem Gehalt an 0,15 M NaCl und 0,1 % BSA; 100ul) versetzt. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei 37ºC umgesetzt. Man erhielt die erfindungsgemäße feste Phase II für einen AFP-Immunoassay.
    • Beispiel 7 (AFP-Immunoassay)
  • Humanes AFP (Produkt der Firma Dako Co.) wurde in Humanserum ohne AFP gelöst. Die Lösung wurde auf AFP-Konzentrationen von 0 bis 500 ng/ml eingestellt. Die Proben (20 ul) wurden in die einzelnen Vertiefungen der gemäß Beispiel 4 hergestellten erfindungsgemäßen festen Phase II gegossen. Eine Enzymmarkierte Antikörperlösung (100 ul), die gemäß Beispiel 3 durch Zugabe von 0,01 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0, mit einem Gehalt an 0,1 M Natriumchlorid und 0,2 % BSA) zu β-Gal- Fab' (20 U) so hergestellt worden war, daß das Gesamtvolumen 10 ml betrug, wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde 15 Minuten bei 37ºC inkubiert. Anschließend wurde das Verfahren von Vergleichsbeispiel 3 zur Durchführung des AFP-Immunoassays wiederholt mit der Ausnahme, daß die Absorption bei 415 nm (Hauptabsorption) und 650 nm (Nebenabsorption) gemessen wurde. Die Ergebnisse-sind in Fig. 1 dargestellt.
    • Beispiel 8 (CEA-Immunoassay)
  • Humanes CEA (Produkt der Firma Morinaga Seikagaku Kenkyusho) wurde in Humanserum ohne CEA gelöst. Die Lösung wurde auf CEA-Konzentrationen von 0 bis 50 ng/ml eingestellt. Die Proben (50 ul) wurden in die einzelnen Vertiefungen der gemäß Beispiel 5 hergestellten erfindungsgemäßen festen Phase II gegossen. Eine Enzym-markierte Antikörperlösung (100 ul), die gemäß Beispiel 5 (b) durch Zugabe von 0,01 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0, mit einem Gehalt an 0,1 M Natriumchlorid und 0,2 % BSA) zum POD-Fab' (15 IU) hergestellt worden war, wurde in einer solchen Menge zugesetzt, daß das Gesamtvolumen 10 ml betrug, hergestellt worden war, wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde 15 Minuten bei 37ºC inkubiert. Anschließend wurde das Verfahren von Vergleichsbeispiel 5 (d) zur Durchführung des CEA-Immunoassays wiederholt. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt.
    • Beispiel 9 (AFP-Immunoassay)
  • Humanes AFP (Produkt der Firma Dako Co.) wurde in Humanserum ohne AFP gelöst. Die Lösung wurde auf AFP-Konzentrationen im Bereich von 0 bis 1000 ng/ml eingestellt. Die Proben (20 ul) wurden in die einzelnen Vertiefungen der gemäß Beispiel 6 hergestellten erfindungsgemäßen festen Phase II gegossen. Eine Enzym-markierte Antikörperlösung (100 ul), die gemäß Beispiel 3 durch Zugabe von 0,01 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0, mit einem Gehalt an 0,1 M Natriumchlorid und 0,2 % BSA) zum β-Gal-Fab' (20 U) hergestellt worden war, wurde in einer solchen Menge zugesetzt, daß das Gesamtvolumen 10 ml betrug. Das Gemisch wurde 15 Minuten bei 37ºC inkubiert. Anschließend wurde das Verfahren von Vergleichsbeispiel 3 zur Durchführung des AFP-Immunoassay wiederholt, mit der Ausnahme, daß die Absorption bei 415 nm (Hauptabsorption) und bei 650 nm (Nebenabsorption) gemessen wurde. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 durch Kreise dargestellt.
  • Das Verfahren von Vergleichsbeispiel 4 wurde ferner unter Verwendung von herkömmlicher fester Phase mit immobilisiertem Avidin zur Durchführung des AFP-Immunoassay wiederholt. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 in Form von Dreiecken dargestellt.
  • Wie aus den in Fig. 3 dargestellten Ergebnissen hervorgeht, weist das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung der festen Phase II im Vergleich zur herkömmlichen festen Phase mit immobilisiertem Avidin etwa die 3-fache Empfindlichkeit auf.

Claims (4)

1. Enzymimmunoassay für ein Antigen unter Verwendung einer festen Phase, dadurch gekennzeichnet, daß er folgendes umfaßt (a') einen biotinylierten Antikörper, bei dem ein Biotinderivat an eine Thiolgruppe eines Fab'-Fragments des Antikörpers, der an einer festen Phase immobilisiert ist, über eine Substanz gebunden ist, die aus der Gruppe Avidin, Streptavidin und ein Derivat davon ausgewählt ist, wobei diese Substanz an den Biotinrest des biotinylierten Antikörpers gebunden ist und ferner an die feste Phase über eine Verknüpfung zwischen einem anderen Biotinderivat und einer an die feste Phase gebundenen, hochmolekularen Substanz gebunden ist, und (b') einen Enzym-markierten Antikörper, wobei die beiden Antikörper (a') und (b') auf das gleiche, zu bestimmende Antigen gerichtet sind, aber unterschiedliche Epitope des Antigens erkennen.
2. Immunoassay nach Anspruch 1, wobei der Immunoassay durch gleichzeitiges Umsetzen von Enzym-markiertem Antikörper (b'), einer ein zu bestimmendes Antigen enthaltenden Probe und der festen Phase (a') durchgeführt wird.
3. Feste Phase für einen Enzymimmunoassay, umfassend einen biotinylierten Antikörper, bei dem ein Biotinderivat an eine Thiolgruppe eines Fab'-Fragments des Antikörpers, der auf das zu bestimmende Antigen gerichtet ist und an einer festen Phase immobilisiert ist, über eine aus der Gruppe Avidin, Streptavidin und ein Derivat davon ausgewählte Substanz gebunden ist, wobei die Substanz an den Biotinrest des biotinylierten Antikörpers gebunden ist und ferner an die feste Phase über eine Verknüpfung zwischen einem weiteren Biotinderivat und einer an die feste Phase gebundenen hochmolekularen Substanz gebunden ist.
4. Feste Phase nach Anspruch 3, wobei die hochmolekulare Substanz aus der Gruppe Rinderserumalbumin, Ovalbumin, Immunoglobulin, Kollagen, Gelatine, Kasein, Pullulan und Dextran ausgewählt ist.
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