NO178047B - Enzymbasert, immunologisk analyse for et antigen samt fast fase for anvendelse ved analysen - Google Patents

Enzymbasert, immunologisk analyse for et antigen samt fast fase for anvendelse ved analysen Download PDF

Info

Publication number
NO178047B
NO178047B NO902899A NO902899A NO178047B NO 178047 B NO178047 B NO 178047B NO 902899 A NO902899 A NO 902899A NO 902899 A NO902899 A NO 902899A NO 178047 B NO178047 B NO 178047B
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
solid phase
antibody
antigen
enzyme
biotin
Prior art date
Application number
NO902899A
Other languages
English (en)
Other versions
NO902899D0 (no
NO178047C (no
NO902899L (no
Inventor
Yoji Marui
Chozo Hayashi
Shigeki Ito
Mieko Fujio
Hiroki Tanaka
Toshihide Nagasaki
Yasuji Soda
Hitoshi Kaneta
Original Assignee
Nippon Shoji Kk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26411503&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO178047(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Nippon Shoji Kk filed Critical Nippon Shoji Kk
Publication of NO902899D0 publication Critical patent/NO902899D0/no
Publication of NO902899L publication Critical patent/NO902899L/no
Publication of NO178047B publication Critical patent/NO178047B/no
Publication of NO178047C publication Critical patent/NO178047C/no

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57473—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving carcinoembryonic antigen, i.e. CEA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57476—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving oncofetal proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6878—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids in eptitope analysis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en enzymbasert, immunologisk analyse for et antigen og en fast fase som anvendes til denne. Nærmere bestemt vedrører foreliggende oppfinnelse en enzymbasert, immunologisk analyse for måling av en mengde av et antigen i en prøve ved at et antigen i en prøve omsettes med et biotinylert antistoff, et enzymmerket antistoff og en avidinimmobilisert, fast fase, hvorved det dannes et kompleks av biotinylert antistoff, antigen og enzymmerket antistoff på den avidinimmobiliserte, faste fase, og måling av en enzymaktivitet på den faste fase, samt en fast fase for anvendelse til dette.
Innen moderne medisin er det blitt mer og mer viktig å måle et sporstoff, slik som en tumormarkør eller et hormon. Ettersom måling av et slikt sporstoff krever høy spesifisitet og sensitivitet, er det i stor utstrekning blitt brukt en immunologisk metode hvor det benyttes en antigen-antistoff-reaksjon som har høy spesifisitet og sensitivitet. Det er nå blitt kjent forskjellige immunologiske fremgangsmåter, inkludert en fluorescens/antistoff-fremgangsmåte, en radioimmuno-logisk analyse, en enzymbasert, immunologisk analyse o.l. Blant annet har den enzymbaserte, immunologiske analyse hvor det anvendes et enzym for merking, slike fordeler som et bredt anvendelsesområde, lett håndtering av reagenser, evne til å behandle et stort antall prøver etc, og den begynner å bli en dominerende fremgangsmåte for måling av et sporstoff.
Ved den enzymbaserte, immunologiske analyse for måling av en mengde av et antigen er det i stor utstrekning blitt anvendt en "sandwich"-metode hvor, for å atskille et enzymmerket antistoff som har reagert med et antigen i en prøve og et ikke-omsatt, enzymbundet antistoff fra hverandre (heretter henvist til som "B/F"-separasjon), reaksjonsoppløs-ningen videre underkastes en antigen-antistoff-reaksjon med et antistoff immobilisert på en fast fase, og aktiviteten av et enzym bundet til den faste fase måles etter B/F-separasjon. Antigen-antistoff-reaksjonen på en fast fase i en slik B/F-separasjon krever imidlertid et langt tidsrom for å nå likevekt, noe som resulterer i tidsforbruk for måling og gjør fremgangsmåten uegnet innenfor feltet klinisk kjemi, hvor hurtig- og korttidsmåling er påkrevd. I de senere år er det blitt forsøkt å anvende en annen spesifikk reaksjon, slik som avidin-biotin-reaksjonen i stedet for en antigen-antistoff-reaksjon for å utføre reaksjonen på en fast fase hurtigere.
Anvendelsen av en slik spesifikk binding av avidin-biotin til den immunologiske fremgangsmåte er godt kjent innen histokjemi, slik som beskrevet i Anderson, G.W. et al., J. Amer. Chem. Soc. 86: 1839 (1964). Ved denne fremgangsmåten bindes et biotinylert antistoff til f.eks. et antigen på et vev, og et avidinmerket enzym omsettes videre med dette, hvorved det dannes et kompleks av antistoff, biotin, avidin og enzym i vevet, og så bestemmes lokaliseringen av et antigen i vevet ut fra det resulterende enzymreaksjonsprodukt. Denne fremgangsmåten kan imidlertid ikke anvendes for målingen av et antigen i en prøve.
Japansk patent med første publikasjonsnr. 229368/1988 beskriver anvendelsen av avidin-biotin-reaksjonen til en B/F-separasjon innen feltet klinisk kjemi. Denne fremgangsmåten omfatter å omsette et antistoff som skal bestemmes med et merket antigen, et biotinylert antigen og en avidinimmobilisert, fast fase, hvorved det dannes et kompleks av avidin, biotinylert antigen, antistoff og merket antigen på den faste fase, og måle markøren for å bestemme mengden av antistoffet.
På den annen side er det som et reagens egnet for måling av en mengde av et antigen under anvendelse av avidin-biotin-reaksjonen, kommersielt tilgjengelig et reagens for å måle ferritin som omfatter en avidinimmobilisert, fast fase, et biotinylert antistoff og et antistoff merket med en radio-isotop. Målingen med dette reagenset tar imidlertid fortsatt så lang tid som 3-4 timer. En lignende fremgangsmåte er blitt rapportert i "Program Abstract, general subject No. 41" i "Proceeding of the 28th Annual Meeting of Japan Society of Clinical Chemistry", avholdt 18. og 19. november 1988. Denne fremgangsmåten omfatter å tilsette et enzymmerket antistoff og et biotinylert antistoff til en prøve som inneholder et antigen for å utføre antigen-antistoff-reaksjonen i en væskefase, tilsette en avidinimmobilisert, fast fase for å la det resulterende "sandwich"-kompleks av enzymmerket antistoff, antigen, og biotinylert antistoff absorberes til den faste fase, og måle enzymaktiviteten for å bestemme mengden av antigenet.
Ved denne fremgangsmåten forløper antigen-antistoff-reaksjonen i den flytende fase og når følgelig likevekt, og videre forløper avidin-biotin-reaksjonen på den faste fase hurtigere enn antigen-antistoff-reaksjonen på den faste fase, noe som forkorter reaksjonstiden. Ved denne fremgangsmåten anvendes det også et fluorescerende stoff for å kompensere sensitivitetens utilstrekkelighet på grunn av forkortelsen av reaksjonstiden (til ca. 10 min). Den gir imidlertid fortsatt ikke en vesentlig løsning på problemet med utilstrekkelig sensitivitet fordi antistofftiteren muligens ødelegges, ettersom det biotinylerte antistoff fremstilles ved å binde et biotinderivat til en aminogruppe i et antistoff, og videre - en mengde avidin på den faste fase mangler muligens på grunn av vanskeligheter med å binde avidin til den faste fase.
Under disse omstendighetene har oppfinnerne grundig undersøkt fremstilling av det biotinylerte antistoff uten å forringe antistofftiteren, og med hensyn på måter for økning av mengden av avidin på den faste fase for å overvinne problemet med utilstrekkelig sensitivitet, som nevnt ovenfor, og som et resultat av dette funnet at det første problemet kan løses ved å binde biotinderivatet til en tiolgruppe i et Fab'-fragment i antistoffet, og det andre problemet kan løses ved å binde avidin til den faste fase via et biotinylert stoff med høy molekylvekt for å øke sensitivitet, at sensitiviteten kan økes ytterligere dersom begge midlene anvendes sammen, at selv når et konvensjonelt biotinylert antistoff og avidinimmobilisert, fast fase anvendes kan sensitiviteten økes dersom de anvendes i form av en biotinylert, antistoffbundet, avidinimmobilisert, fast fase hvor det biotinylerte antistoff er bundet til den avidinimmobiliserte, faste fase, og at denne sistnevnte fremgangsmåten med fordel kan utføres for målingen av et antigen bare ved å tilsette det enzymmerkede antistoff, noe som er fordelaktig på grunn av lettere utøvelse av fremgangsmåten.
Ved foreliggende oppfinnelse er det således tilveie-bragt en enzymbasert, immunologisk analyse for et antigen under anvendelse av en fast fase, kjennetegnet ved at det anvendes (a) et biotinylert antistoff hvor et biotinderivat er bundet til en tiolgruppe i et Fab'-fragment av et antistoff, (b) et enzymmerket antistoff og (c) en fast fase immobilisert med et stoff som spesifikt kan reagere med biotinderivatet, valgt fra gruppen bestående av avidin, streptoavidin og et derivat derav, hvor begge antistoffene (a) og (b) er rettet mot det samme antigen som skal bestemmes, men gjenkjenner forskjellige epitoper på antigenet. (Denne analysen henvises heretter til som "immunologisk analyse I").
En foretrukket utførelsesform av analysen ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved at det anvendes (i) en fast fase immobilisert med det biotinylerte antistoff (a) hvor et biotinderivat er bundet til en tiolgruppe i et Fab'-fragment av antistoffet, via et stoff valgt fra gruppen bestående av avidin, streptoavidin og et derivat derav, hvor stoffet er bundet til biotinresten i det biotinylerte antistoff og også er bundet til den faste fase via en binding mellom et annet biotinderivat og et stoff med høy molekylvekt som er bundet til den faste fase, og (ii) det enzymmerkede antistoff (b), hvor begge antistoffene (a) og (b) er rettet mot det samme antigen som skal bestemmes, men gjenkjenner forskjellige epitoper på antigenet. (Denne analysen henvises heretter til som "immunologisk analyse II" ).
En foretrukket utførelsesform av immunologisk analyse I er kjennetegnet ved at den faste fase (c) er en fast fase immobilisert med et stoff som kan reagere spesifikt med et biotinderivat, valgt fra gruppen bestående av avidin, streptoavidin og et derivat derav, hvor stoffet er immobilisert på den faste fase via en binding mellom et annet biotinderivat og et stoff med høy molekylvekt bundet til den faste fase.
[F.eks. bovint serumalbumin (heretter henvist til som
"BSA")].
En annen foretrukket utførelsesform av immunologisk analyse I er kjennetegnet ved at den immunologiske analyse utføres ved å omsette det biotinylerte antistoff (a) og det enzymmerkede antistoff (b) med et antigen som skal bestemmes i en prøve, hvorved det dannes et kompleks av biotinylert antistoff, antigen og enzymmerket antistoff, og så omsette komplekset med stoffet valgt fra gruppen bestående av avidin, streptoavidin og et derivat derav, immobilisert. på den faste fase (c).
Nok en annen foretrukket utførelsesform av immunologisk analyse I er kjennetegnet ved at den immunologiske analyse utføres ved samtidig å omsette det biotinylerte antistoff (a), det enzymmerkede antistoff (b), en prøve inneholdende et antigen som skal bestemmes og den faste fase (c).
En foretrukket utførelsesform av immunologisk analyse II er kjennetegnet ved at den immunologiske analyse utføres ved samtidig å omsette det enzymmerkede antistoff (ii), en prøve som inneholder et antigen som skal bestemmes og den faste fase (i).
Ved foreliggende oppfinnelse er det videre tilveie-bragt en fast fase for enzymbasert, immunologisk analyse, som er kjennetegnet ved at den omfatter en fast fase immobilisert med et biotinylert antistoff hvor et biotinderivat er bundet til en tiolgruppe i et Fab'-fragment av antistoffet som er rettet mot antigenet som skal bestemmes, via et stoff valgt fra gruppen bestående av avidin, streptoavidin og et derivat derav, hvor stoffet er bundet til biotinresten i biotinderivatet og også er bundet til den faste fase via en binding mellom et annet biotinderivat og et stoff med høy molekylvekt som er bundet til den faste fase. (Heretter henvist til som "fast fase I" og "fast fase II", se nedenunder).
En foretrukket utførelsesform av den faste fase ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved at stoffet med høy molekylvekt er valgt fra gruppen bestående av bovint serumalbumin, ovalbumin, immunglobulin, kollagen, gelatin, kasein, pullulan og dekstran. Figur 1 er en kalibreringskurve for et antigen (AFP) i en prøve målt ved hjelp av enzymbasert, immunologisk analyse under anvendelse av et biotin-Fab' eller et biotin-IgG hvor sensitiviteten i tilfellet med biotin-Fab' og sensitiviteten i tilfellet med biotin-IgG sammenlignes med hverandre. Figur 2 er en kalibreringskurve for et antigen (AFP) i en prøve målt ved hjelp av enzymbasert, immunologisk analyse under anvendelse av fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse hvor det brukes et biotin-BSA eller en vanlig avidinimmobilisert, fast fase hvor sensitiviteten i tilfellet med fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse og sensitiviteten i tilfellet med den vanlige faste fase sammenlignes med hverandre . Figur 3 er en kurve som viser en korrelasjon mellom antigenkonsentrasjoner (AFP) i en prøve målt ved hjelp av den enzymbaserte, immunologiske analyse ifølge foreliggende oppfinnelse under anvendelse av den faste fase I hvor det brukes et biotin-BSA, og ved en vanlig enzymbasert, immunologisk analyse under anvendelse av et kommersielt tilgjengelig prøve-sett. Figur 4 er en kalibreringskurve for et antigen (AFP) i en prøve målt ved hjelp av enzymbasert, immunologisk analyse under anvendelse av fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse hvor det brukes et biotin-OA (OA betyr ovalbumin) eller en vanlig avidinimmobilisert, fast fase hvor sensitiviteten i tilfellet med fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse og sensitiviteten i tilfellet med den vanlige faste fase sammenlignes med hverandre. Figur 5 er en kalibreringskurve for et antigen (AFP) i en prøve målt ved hjelp av enzymbasert, immunologisk analyse under anvendelse av fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse hvor det brukes et biotin-Fab' eller en vanlig avidinimmobilisert, fast fase hvor sensitiviteten i tilfellet med fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse og sensitiviteten i tilfellet med den vanlige faste fase sammenlignes med hverandre . Figur 6 er en kalibreringskurve for et antigen (CEA) i en prøve målt ved hjelp av enzymbasert, immunologisk analyse under anvendelse av fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse hvor det brukes et biotin-BSA eller en vanlig avidinimmobilisert, fast fase hvor sensitiviteten i tilfellet med fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse og sensitiviteten i tilfellet med den vanlige faste fase sammenlignes med hverandre . Figur 7 er en kalibreringskurve for et antigen (AFP) i en prøve målt ved hjelp av enzymbasert, immunologisk analyse under anvendelse av fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse hvor det brukes et biotin-BSA og et fluorescerende substrat som enzymsubstrat. Figur 8 er en kalibreringskurve for et antigen (AFP) i en prøve målt ved hjelp av enzymbasert, immunologisk analyse under anvendelse av fast fase II ifølge foreliggende oppfinnelse hvor det brukes et biotin-Fab'. Figur 9 er en kalibreringskurve for et antigen (CEA) i en prøve målt ved hjelp av enzymbasert, immunologisk analyse under anvendelse av fast fase II ifølge foreliggende oppfinnelse hvor det brukes et biotin-Fab'. Figur 10 er en kalibreringskurve for et antigen (AFP) i en prøve målt ved hjelp av enzymbasert, immunologisk analyse under anvendelse av fast fase II ifølge foreliggende oppfinnelse hvor det brukes et biotin-Fab' eller en vanlig avidinimmobilisert, fast fase hvor sensitiviteten i tilfellet med fast fase II ifølge foreliggende oppfinnelse og sensitiviteten i tilfellet med den vanlige faste fase sammenlignes med hverandre .
Fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse har en struktur hvor en fast fase er immobilisert med et kompleks av et stoff med høy molekylvekt, biotin og avidin (eller streptoavidin eller et derivat derav), hvor et stoff med høy molekylvekt er biotinylert, og avidin, streptoavidin eller et derivat derav er bundet til den biotinylerte rest derav, med andre ord en struktur hvor avidin, streptoavidin eller et derivat derav er immobilisert til en fast fase via det biotinylerte stoff med høy molekylvekt. Fast fase II ifølge foreliggende oppfinnelse har en struktur hvor det biotinylerte antistoff er bundet til fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse i resten av avidin etc. på denne, eller til en fast fase hvortil et stoff valgt fra gruppen bestående av avidin, streptoavidin og et derivat derav er direkte bundet gjennom avidin-biotin-binding.
Fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles f.eks. ved biotinylering av et stoff med høy molekylvekt med et biotinderivat (heretter henvist til som "biotinyl-eringsreagens"), binde det biotinylerte stoffet med høy molekylvekt til en fast fase via resten av stoffet med høy molekylvekt og videre binde avidin, streptoavidin eller et derivat derav (f.eks. et nøytralisert avidin hvor fri(e) aminogruppe(r) er forblokkert ved f.eks. acetylering med eddiksyre-anhydrid) til biotinresten. Stoffet med høy molekylvekt kan bindes til den faste fase ved hjelp av forskjellige metoder, inkludert fysisk adsorpsjon, kovalent binding o.l.
Fast fase II ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles f.eks. ved å binde et vanlig biotinylert antistoff eller et biotinylert antistoff hvor biotinderivatet er bundet til en tiolgruppe i et Fab'-fragment i et antistoff til fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse, eller til en fast fase hvortil avidin, streptoavidin eller et derivat derav er bundet direkte gjennom avidin-biotin-binding.
Stoffet med høy molekylvekt som anvendes i foreliggende oppfinnelse, har en funksjonell gruppe som kan reagere med det biotinylerende reagens, og som kan adsorberes fysisk eller bindes kovalent til den faste fase, inkludert proteiner [f.eks. BSA, ovalbumin (heretter henvist til som "OA"), immunglobulin, kollagen, gelatin, kasein etc], polysakkarider (f.eks. dekstran, pullulan etc) o.l.
Det biotinylerende reagens som anvendes ved foreliggende oppfinnelse, er et biotinderivat med en funksjonell gruppe som kan reagere med stoffet med høy molekylvekt, hvorved det dannes en kovalent binding, og omfatter f.eks. biotin-N-hydroksy-succinimidester (heretter henvist til som "NHS-biotin"), N-biotinyl-6-aminokaproyl-N-hydroksysulfosuccinimid-ester (heretter henvist til som "NHS-Lc-biotin"), sulfosuccin-imidyl-2-(biotinamido)etyl-l,3-ditiopropionat (heretter henvist til som "NHS-SS-biotin") o.l. [jf. Analytical Biochemistry, 171, s. 1-32 (1988)].
Det biotinylerende reagens og stoffet med høy molekylvekt kan bindes til hverandre ved å omsette 1 mol av stoffet med høy molekylvekt og fortrinnsvis ca. 1 til ca.
100 mol av det biotinylerende reagens, avhengig av typen av det biotinylerende reagens og stoffet med høy molekylvekt. Reaksjonen kan utføres under slike betingelser at stoffet med høy molekylvekt og det biotinylerende reagens bindes tilstrekkelig til hverandre, og resten på stoffet med høy molekylvekt hvor den faste fase er bundet ikke inaktiveres, f.eks. under betingelsene med pH i oppløsningen som ligger i området fra ca. 4 til ca. 10, reaksjonstemperatur på ca. 4°C til ca.
45°C og reaksjonstid på ca. 10 min til ca. 24 timer.
Det således fremstilte biotinylerte stoff med høy molekylvekt kan bindes til den faste ved hjelp av vanlige fremgangsmåter, slik som fysisk adsorpsjon eller kovalent binding, men fremgangsmåten bør ikke virke inn på bindingen mellom biotinresten i det resulterende biotinylerte stoff med høy molekylvekt/immobiliserte, faste fase og avidin, streptoavidin eller et derivat derav. Fremgangsmåten for fysisk adsorpsjon kan f.eks. utføres ved å senke den faste fase ned i en bufret oppløsning av det biotinylerte stoff med høy molekylvekt (1-1000 ug/ml). Fremgangsmåten for kovalent binding kan utføres f.eks. ved å omsette det biotinylerte stoff med høy molekylvekt i form av en bufret oppløsning (1-1000 ug/ml, pH 5-7) med en fast fase som inneholder karboksylgruppe, og som er forbehandlet med en bufret oppløsning av l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid-hydroklorid (5-200 mg/ml) i 1-24 timer.
Den resulterende faste fase hvortil det biotinylerte stoff med høy molekylvekt er bundet, senkes så ned i en bufret oppløsning av avidin, streptoavidin eller et derivat derav (1-1000 pg/ml) i 1-20 timer, hvorved man får en fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse.
Fast fase II ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles fra fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse eller en fast fase som er fremstilt ved å senke ned en konvensjonell fast fase i en bufret oppløsning av avidin, streptoavidin eller et derivat derav (1-1000 ug/ml) i 1-20 timer, dvs. ved å senke ned den faste fase i en bufret oppløsning av det biotinylerte antistoff (1-1000 pikomol/ml) i 1-20 timer.
Fast fase-materialet anvendt i fast fase I og II ifølge foreliggende oppfinnelse, kan være hvilket som helst vanlig materiale som kan immobilisere komplekset stabilt og har en form som er egnet for vasking og måling, inkludert kuler, plater, testrør, lateks etc. laget av polystyren, poly-propylen, polyvinylklorid, glass, keramikk, agarose o.l, eller hvilket som helst annet stoff som er vanlig anvendt i fremgangsmåter med enzymbasert, immunologisk analyse.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en "sandwich"-immunologisk analyse for et antigen under anvendelse av det biotinylerte antistoff, det enzymmerkede antistoff og den faste fase hvortil avidin, streptoavidin eller et derivat derav er immobilisert, hvor det biotinylerte antistoff er et antistoff hvor biotinderivatet er bundet til en tiolgruppe i Fab'-fragmentet i antistoffet. Slikt biotinylert antistoff kan fremstilles ved først å fremstille Fab'-fragmentet i over-ensstemmelse med den kjente fremgangsmåten, f.eks. fremgangsmåten beskrevet i "Zoku Seikagaku Jikken Koza 5 Meneki Seikagaku Kenkyuho (Biochemical Experiment Course, 2. serie, volum 5, Method of Study in Immunological Biochemistry)", Tokyo Kagaku Dojin, 1986, s. 89-112, og så binde biotinderivatet til tiolgruppen i Fab<1->fragmentet.
Biotinderivatet som anvendes ved den ovenfor nevnte fremgangsmåte for fremstilling av det biotinylerte antistoff, er et biotinylerende reagens med en funksjonell gruppe som kan reagere med en tiolgruppe, slik som jodacetylgruppe eller maleimidgruppe, inkludert N-jodacetyl-N-biotinylheksylen-diamin, 3-(N-maleimidobutyryl)biocytin (MBB), 3-(N-maleimido-propionyl)biocytin, 3-(N-maleimidokaproyl)biocytin, N-bio-tinyl-N-(6-meleimidoheksanoyl)hydrazid o.l.
Mengden av Fab<1->fragmentet og det biotinylerende reagens som anvendes ved reaksjonen ovenfor, kan variere avhengig av typen av det biotinylerende reagens, men fortrinnsvis anvendes ca. 5 til ca. 20 molmengder av det biotinylerende reagens pr. mol av Fab'-fragmentet. Reaksjonen utføres under slike betingelser at Fab'-fragmentet og det biotinylerende reagens bindes til hverandre i tilstrekkelig grad og antistoff titeren ikke ødelegges, f.eks. under betingelsene med pH i oppløsningen i området fra ca. 6 til ca. 7, reaksjonstemperatur fra ca. 4 til ca. 40°C, fortrinnsvis ca. 20-30°C, og reaksjonstid på ca. 1 til ca. 24 timer.
Ifølge immunologisk analyse I ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes det biotinylerte antistoff fremstilt ovenfor i "sandwich"-immunoanalysen for et antigen hvor en blanding (50-1000 ul, fortrinnsvis 100-500 ul) av det ovenfor nevnte biotinylerte antistoff og det enzymmerkede antistoff tilsettes en prøveoppløsning (1-100 pl, fortrinnsvis 5-50 pl), hvorved det dannes et biotinylert, antistoff-, antigen- og enzymmerket antistoffkompleks (reaksjon 1), og til dette tilsettes det videre den faste fase hvor avidin^ streptoavidin eller et derivat derav er immobilisert (reaksjon 2). Ved den ovenfor nevnte immunologiske analyse kan alle reagensene, dvs. prøven, det biotinylerte antistoff, det enzymmerkede antistoff og den faste fase hvor avidin, streptoavidin eller et derivat derav er immobilisert, også tilsettes samtidig slik at de ovenfor nevnte to reaksjoner utføres samtidig, noe som mulig-gjør utførelse av den immunologiske analyse i ett enkelt trinn.
Den faste fase hvor avidin, streptoavidin eller et derivat derav immobiliseres, anvendt i den ovenfor nevnte immunologiske analyse, kan være enten den kjente avidinimmobiliserte, faste fase hvortil avidin, streptoavidin eller et derivat derav er direkte immobilisert, inkludert immobilisert avidin D som er kommersielt tilgjengelig, den faste fase beskrevet i japansk patentsøknad med første publikasjonsnr. 229368/1988 o.l., eller fast fase II ifølge foreliggende oppfinnelse. Fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse mulig-gjør mer stabil måling av antigenet og er følgelig foretrukket.
Ifølge den immunologiske analyse II ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes fast fase II ifølge foreliggende oppfinnelse hvor det biotinylerte antistoff fremstilles som nevnt ovenfor, eller det konvensjonelle biotinylerte antistoff er tidligere bundet til fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse, eller den faste fase hvortil avidin, streptoavidin eller et derivat derav er direkte immobilisert, i den immunologiske analyse for et antigen. I dette tilfelle tilsettes en prøveoppløsning (1-100 ul, fortrinnsvis 5-50 ul) og en bufret oppløsning av det enzymmerkede antistoff (50-1000 ul, fortrinnsvis 100-500 ul) til fast fase II, hvorved det dannes et antigen- og enzymmerket antistoffkompleks på den faste fase.
Reaksjonstiden ved den ovenfor nevnte immunologiske analyse er ca. 1 til ca. 20 min, fortrinnsvis ca. 5 til ca.
15 min, for hver av reaksjonene antigen-antistoff-reaksjonen og avidin-biotin-reaksjonen når fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes. I tilfellet med fremgangsmåten med ett enkelt trinn for utførelse av reaksjonene samtidig kan reaksjonstiden være ca. 1 til ca. 30 min, fortrinnsvis ca. 5 til ca. 20 min. Når fast fase II ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes, kan antigen-antistoff-reaksjonen utføres i ca.
1 til ca. 30 min, fortrinnsvis ca. 5 til ca. 20 min.
Etter fullførelse av reaksjonen vaskes den faste fase, og en substratoppløsning (50-1000 ul, fortrinnsvis 100-500 ul) tilsettes, etterfulgt av enzymomsetning i 1-30 min, fortrinnsvis 5-20 min, i tilfellet med kolorimetri, eller i 15 sekunder-15 min, fortrinnsvis 1-5 min, i tilfellet med fluorometri. Etter fullførelse av omsetningen underkastes reaksjonsoppløsningen direkte, eller etter tilsetning av en passende mengde av et reagens, for avslutning av reaksjonen, kolorimetri eller fluorometri. En konsentrasjon av antigenet i prøven beregnes så ut fra en kalibreringskurve som tidligere er blitt fremstilt under anvendelse av antigenoppløsninger med kjent konsentrasjon.
Alle reaksjonene ovenfor utføres ved 10-45°C, fortrinnsvis 20-40°C. Biotin-avidin-reaksjonen og antigen-anti-stof f -reaksjonen utføres ved pH 5-9, fortrinnsvis ved omtrent nøytral pH, og enzymaktiviteten måles ved omtrent optimal pH for enzymet for merking.
Enzymet for merking kan være hvilket som helst enzym som vanligvis anvendes i enzymbasert, immunologisk analyse og omfatter f.eks. p-D-galaktosidase (p-Gal), peroksidase (POD), alkalifosfatase (ALP) o.l. Måling av enzymaktiviteten på den faste fase utføres ved å tilsette en passende mengde substrat til reaksjonssystemet og så måle enzymaktiviteten ved hjelp av en vanlig metode, slik som kolorimetri eller fluorometri. Det anvendte substrat ved målingen av enzymaktiviteten omfatter orto-nitrofenyl-p-D-galaktopyranosid, 4-metylumbelliferyl-p-D-galaktopyranosid etc. i det tilfelle at merkeenzymet er p-Gal; hydrogenperoksid med 2,2'-azino-bis(3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre (ABTS), hydrogenperoksid med 3,3',5,5'-tetrametyl-benzidin, hydrogenperoksid med o-fenylendiamin etc. i tilfellet med POD; paranitrof enylf osf orsyre, ( 4-metyl )umbellif eryl-fosforsyre etc. i tilfellet med ALP.
I henhold til fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan en mengde av antigenet som er til stede i en prøve, slik som humanserum, -plasma, -urin etc, måles med høy sensitivitet og i løpet av svært kort tidsrom. Ved å kombinere fremgangsmåten og den faste fase ifølge foreliggende oppfinnelse, forbedres sensitiviteten mer og den ønskede immunologiske analyse kan utføres på en mer egnet måte.
Foreliggende oppfinnelse er nærmere illustrert i de følgende eksempler, fremstillings- og sammenligningseksempler.
Eksempel 1
Fremstilling av biotinylert antistoff ( biotin- Fab')
(a) Fremstilling av monoklonalt antistoff mot a- feto-protein ( AFP);
Et hybridom ble fremstilt ved hjelp av en polyetylen-glykolmetode under anvendelse av miltceller fra Balb/c-mus immunisert med AFP og musmyelomceller FO. Det erholdte hybridom ble klonet to ganger ved en begrensende fortynningsmetode, hvorved man fikk anti-AFP monoklonalt antistoffproduserende hybridom NHAFP-14. Dette hybridomet ble dyrket på ASF-kultur-medium 103, og et anti-AFP monoklonalt antistoff (MNHAFP-14) ble renset fra kultursupernatanten under anvendelse av protein A-agarosekolonne.
(b) Fremstilling av Fab':
Oppløsningen av anti-AFP monoklonalt antistoff (MNHAFP-14, 10 mg/2 ml) erholdt ved fremgangsmåte (a) ovenfor, ble dialysert mot 0,1 M acetatbuffer (pH 4,2), til denne ble det tilsatt en pepsinoppløsning (20 mg/ml 0,1 M acetatbuffer, 100 pl), og blandingen ble omsatt ved 37°C i 20 timer. Reaksjonsoppløsningen ble sentrifugert og supernatanten underkastet behandling på "Sephacryl-S-200"-kolonne (1,5 cm x 50 cm, elueringsmiddel: 0,1 M fosfatbuffer, pH 6,0), hvorved man fikk en F(ab')2-fraksjon. Til F(ab')2-fraksjonen ble det tilsatt 2-merkaptoetylamin-hydroklorid ved en sluttkonsentra-sjon på 10 mmol/1, og blandingen ble omsatt ved 37°C i 1 time. Reaksjonsoppløsningen ble sentrifugert og supernatanten underkastet behandling på "Sephacryl-S-200"-kolonne (1,5 cm x 50 cm, elueringsmiddel: 0,1 M fosfatbuffer, pH 6,0), hvorved man fikk en Fab'-fraksjon. (c) Fremstilling av biotinylert antistoff ( biotin- Fab'): 3-(N-maleimidobutyryl)biocytin (MBB) ble syntetisert iht. fremgangsmåten beskrevet i Anal. Biochem.149, s. 529-536 (1985). Til Fab' (1,66 mg/1,3 ml) fremstilt i fremgangsmåte (a) ovenfor, ble MBB-oppløsningen tilsatt (0,5 mg/ml i 0,1 M fosfatbuffer, pH 6,0, 0,5 ml), og blandingen ble omsatt ved værelsestemperatur i 2 timer. Reaksjonsoppløsningen ble sentrifugert og supernatanten underkastet behandling på "Sephadex-G-25"-kolonne (1,5 cm x 30 cm, elueringsmiddel: 0,1 M fosfatbuffer, pH 6,0), hvorved man fikk det ønskede biotin-Fab ' .
Eksempel 2
Fremstilling av enzymmerket antistoff ( POD- Fab')
(a) Fremstilling av anti- AFP monoklonalt antistoff:
På samme måte som beskrevet i eksempel 1 (a) ble det fremstilt et anti-AFP monoklonalt antistoff (MNHAFP-18).
(b) Fremstilling av Fab':
Ved bruk av det anti-AFP monoklonale antistoff (MNHAFP-18) erholdt i fremgangsmåte (a) ovenfor, ble fremgangsmåten ifølge eksempel 1 (b) gjentatt, hvorved man fikk Fab' .
(c) Fremstilling av POD- maleimid:
6 mg POD ble oppløst i 0,8 ml 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,0), og til dette ble det tilsatt 50 pl N-(Y-maleimido-butyryloksy)succinimid (80 mg/ml N,N'-dimetylformamid), og blandingen ble omsatt ved 30°C i 1 time. Reaksjonsoppløsningen ble sentrifugert og supernatanten underkastet behandling på "Sephadex-G-25"-kolonne (1,5 cm x 30 cm, elueringsmiddel: 0,1 M fosfatbuffer, pH 6,0), hvorved man fikk en POD-maleimid-fraksjon.
(d) Fremstilling av POD- Fab':
Til 1 mg av det Fab' som ble fremstilt i fremgangsmåte (b) ovenfor, ble det tilsatt 1 mg av POD-maleimidet fremstilt ved fremgangsmåte (c) ovenfor, og blandingen ble omsatt i et kaldt rom i 20 timer. Reaksjonsoppløsningen ble sentrifugert og supernatanten underkastet behandling på "Sephacryl-S-200"-kolonne (1,5 cm x 50 cm, elueringsmiddel.: 0,1 M fosfatbuffer, pH 6,5), hvorved man fikk den ønskede POD-Fab'-frak-sjon.
Fremstilling ( fremstilling av konvensjonell avidinimmobilisert fast fase) 5 mg avidin ble oppløst i 10 ml 20 mM karbonatbuffer (pH 9,6, inneholdende 0,15 M natriumklorid). Cirka 30 poly-styrenkuler (type C, fast fase) ble tilsatt oppløsningen ovenfor og fikk stå ved værelses temperatur i 20 timer for å adsor-bere avidin på den faste fase. Denne faste fasen ble vasket med en fysiologisk saltoppløsning flere ganger, nedsenket i 1 % oppløsning av bovint serumalbumin (BSA) (i 0,1 M fosfat-buf fer, pH 7,0) og fikk stå ved værelses temperatur i 20 timer, hvorved man fikk den ønskede avidinimmobiliserte, faste fase.
Eksempel 3
AFP immunologisk analyse under anvendelse av biotin- Fab' ( to trinn)
Human-AFP ble oppløst i humant serum uten AFP, og oppløsningen ble regulert til AFP-konsentrasjoner i området 0-1000 ng/ml. Denne prøven (50 pl ble tilsatt et prøverør, og til dette ble det tilsatt 400 pl av en antistoffoppløsning som var fremstilt ved å tilsette 10 mM fosf atbuf fer (pH 7,0, inneholdende 0,15 M natriumklorid og 0,5 % BSA) til en blanding av biotin-Fab' (Fab'-konsentrasjon på 160 pg/ml, 50 pl) og POD-Fab' (POD-aktivitet på 26,1 IU/ml, 500 pl), slik at totalvolumet ble 10 ml, og blandingen ble inkubert ved 37°C i 10 min. Til reaksjonsoppløsningen ble deretter den avidinimmobiliserte, faste fase fremstilt under fremstillingen ovenfor tilsatt, og blandingen ble inkubert ved 37°C i 10 min. Etter fullførelse av omsetningen ble reaksjonsoppløsningen fjernet ved avsuging, og en vaskeoppløsning (fysiologisk salt-oppløsning, 2 ml) ble tilsatt den faste fase, og etter om-røring ble vaskeoppløsningen fjernet ved avsuging. Denne vaskefremgangsmåten ble gjentatt ytterligere to ganger. Etter vasking ble 500 pl av en substratoppløsning (ABTS 1 mg/ml, 0,01 % hydrogenperoksid, 0,1 M sitratbuffer, pH 4,2) tilsatt den resulterende faste fase, og blandingen ble omsatt ved 37°C 1 15 min. Til blandingen ble det tilsatt 2 ml 5. mM natriumazid som en reaksjonsstanser, og absorbansen ved 415 nm ble målt. Resultatene er vist i figur 1 som en sirkel.
Eksempel 4
AFP immunologisk analyse under anvendelse av biotin- Fab' ( ett trinn)
Prøven (50 pl) fremstilt i eksempel 3 ble tilsatt et prøverør, og til dette ble den avidinimmobiliserte, faste fase fremstilt under fremstillingen ovenfor tilsatt, og videre 400 pl av den samme antistoffoppløsning som ble brukt i eksempel 3, og blandingen ble inkubert ved 37°C i 10 min. Etter fullførelse av omsetningen ble reaksjonsoppløsningen fjernet ved avsuging, og til den faste fase ble 2 ml av den samme vaskeoppløsning som ble brukt i eksempel 3 tilsatt. Etter risting ble vaskeoppløsningen fjernet ved avsuging. Vaskefremgangsmåten ble gjentatt ytterligere to ganger. Etter vaskingen ble 500 pl av den samme substratoppløsning som ble brukt i eksempel 3 tilsatt den resulterende faste fase, og blandingen ble omsatt ved 37°C i 15 min. Til blandingen ble 2 ml av den samme reaksjonsstanser som ble brukt i eksempel 3 tilsatt, og absorbansen ved 415 nm ble målt. Resultatene er vist i figur 1 som et triangel.
Sanunenligningseksempel 1
Den samme fremgangsmåten som ifølge eksempel 3 ble gjentatt, bortsett fra at et biotinylert antistoff hvor biotinderivatet var bundet til aminogruppen i et antistoff, som var fremstilt ved å tilsette en NHS-biotinoppløsning (1 mg/ml DMSO, 300 pl) til en oppløsning av anti-AFP monoklonalt antistoff (MNHAFP-14, 2,5 mg/ml 0,1 M fosfatbuffer), omsette blandingen ved 30°C i 1 time og underkaste reaksjonsoppløsningen behandling på "Sephadex-G-25"-kolonne, ble anvendt i stedet for biotin-Fab' ifølge eksempel 3 ved den samme molare konsentrasjon. Resultatene er vist i figur 1 som x.
Sanunenligningseksempel 2
Den samme fremgangsmåten som ifølge eksempel 4 ble gjentatt, bortsett fra at det biotinylerte antistoff i sammenligningseksempel 1 ble anvendt i stedet for biotin-Fab' ifølge eksempel 4, ved den samme molare konsentrasjon. Resultatene er vist i figur 1 som et kvadrat.
Som det klart fremgår av resultatene vist i figur 1, har fremgangsmåten hvor det anvendes biotin-Fab' ifølge foreliggende oppfinnelse sensitivitet som er ca. to ganger større enn sensitiviteten til fremgangsmåten hvor det konvensjonelt biotinylerte antistoff anvendes, hvor biotinderivatet er bundet til aminogruppen i antistoffet.
Eksempel 5
Fremstilling av fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse (a) Fremstilling av biotin- BSA: 30 mg BSA ble oppløst i 1 ml 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,0), og til dette ble 1 ml av en NHS-SS-biotinoppløsning (16,8 mg/ml i 0,1 M fosfatbuffer, pH 7,0) tilsatt, og blandingen ble omsatt ved 30°C i 1 time. Reaksjonsoppløsningen ble sentrifugert og supernatanten underkastet behandling på "Sephadex-G-25"-kolonne (1,5 cm x 30 cm, elueringsmiddel: 50 mM karbonatbuffer, pH 9,6), hvorved man fikk en biotin-BSA-fraksjon. (b) Fremstilling av fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse: Det biotin-BSA som ble fremstilt ifølge fremgangsmåte (a) ovenfor, ble fortynnet med 50 mM karbonatbuffer (pH 9,6) for å regulere biotin-BSA-konsentrasjonen til 10 ug/ml. Denne oppløsningen (100 pl) ble helt over i hver brønn i en plate ("Immunoplate I", 96 brønner) og fikk reagere ved værelsestemperatur i 1 time for immobilisering. Etter vasking av brønnene med en fysiologisk saltoppløsning flere ganger ble 100 pl av en avidinoppløsning ("Avidin D", 50 pg/ml i 0,1 M fosfatbuffer, pH 7,0) helt i hver brønn og fikk reagere ved 37°C i 1 time. Etter vasking av brønnene med en fysiologisk saltoppløsning flere ganger ble 250 pl 3 % BSA-oppløsning (i 50 mM karbonatbuffer, pH 9,6) tilsatt, og det ble behandlet ved 37°C i 1 time, hvorved man fikk fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse.
Eksempel 6
Fremstilling av fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse (a) Fremstilling av biotin- OA: 30 mg OA ble oppløst i 1 ml 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,0), til dette ble det tilsatt 100 pl av en NHS-Lc-biotin-oppløsning (12,6 mg/ml 0,1 M fosfatbuffer, pH 7,0), og blandingen ble omsatt ved 30°C i 1 time. Deretter ble fremgangsmåten ifølge eksempel 5 (a) gjentatt, hvorved man fikk en biotin-OA-fraksj on. (b) Fremstilling av fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse: Det biotin-OA som ble fremstilt ved fremgangsmåte (a) ovenfor, ble fortynnet med 50 mM karbonatbuf fer (pH 9,6) for å regulere til 10 pg/ml. Deretter ble fremgangsmåten ifølge eksempel 5 (b) gjentatt, hvorved man fikk fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse.
Eksempel 7
Fremstilling av fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse ( a) Fremstilling av biotin- immunglobulin: Ved å bruke kanin-IgG ble fremgangsmåten (den første halvdelen) ifølge eksempel 1 (b) gjentatt, hvorved man fikk et F(ab')2. Til 3 ml av denne F(ab')2 (10 mg/ml i 0,1 M fosfatbuffer, pH 7,0) ble det så tilsatt 300 pl av en NHS-Lc-biotin-oppløsning (15 mg/ml i 0,1 M fosfatbuffer, pH 7,0), og blandingen ble omsatt ved 30°C i 1 time. Deretter ble fremgangsmåten ifølge eksempel 5 (a) gjentatt, hvorved man fikk et biotin-F( ab 1 )2-fragment. Deretter ble fremgangsmåten (den siste halvdelen) ifølge eksempel 1 (b) gjentatt, hvorved man fikk et biotin-Fab'. (b) Fremstilling av fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse: Det biotin-Fab' som ble fremstilt ved fremgangsmåte (a) ovenfor, ble fortynnet med 50 mM karbonatbuffer (pH 9,6) for å regulere til en konsentrasjon på 20 pg/ml. Deretter ble fremgangsmåten ifølge eksempel 5 (b) gjentatt, hvorved man fikk fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse.
Eksempel 8
Fremstilling av enzymmerket antistoff ( p- Gal- Fab')
(a) Fremstilling av Fab':
Under anvendelse av det anti-AFP monoklonale anti stoff (MNHAFP-18) fremstilt ifølge eksempel 2 (a), ble fremgangsmåten ifølge eksempel 2 (b) gjentatt, hvorved man fikk Fab' .
(b) Fremstilling av B- Gal- maleimid:
10 mg p-Gal ble oppløst i 2 ml 0,1 M fosfatbuffer (pH 6,0), og til dette ble det tilsatt 100 pl av en o-fenylen-dimaleimidoppløsning (25 mg/ml i N,N-dimetylformamid), og blandingen ble omsatt ved 30°C i 20 min. Reaksjonsoppløsningen ble sentrifugert og supernatanten underkastet behandling på "Sephadex-G-25"-kolonne (1,5 cm x 30 cm, elueringsmiddel: 0,1 M fosfatbuffer, pH 6,0), hvorved man fikk en p-Gal-maleimidfraksj on.
(c) Fremstilling av p- Gal- Fab':
Til 1 mg av det Fab' fremstilt ved fremgangsmåte (a) ovenfor, ble det tilsatt 3,9 mg av p-Gal-maleimidet fremstilt ved fremgangsmåte (b), og blandingen ble omsatt ved 30°C i 30 min. Reaksjonsoppløsningen ble sentrifugert og supernatanten underkastet behandling på "Sepharose 6B"-kolonne (1,5 cm x 50 cm, elueringsmiddel: 10 mM fosfatbuffer, pH 6,5), inneholdende 0,1 % BSA), hvorved man fikk et p-Gal-Fab'-fragment.
Eksempel 9
AFP immunologisk analyse
20 pl av prøven fremstilt i eksempel 3 ble helt over i hver brønn i fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse, og til dette ble det tilsatt 100 pl av en antistoffoppløsning, og blandingen ble inkubert ved 37°C i 15 min. Antistoffoppløs-ningen som ble brukt ved denne fremgangsmåten, ble fremstilt ved å tilsette 0,01 M fosfatbuffer (pH 7,0, inneholdende 0,1 M natriumklorid og 0,2 % BSA) til 16 pg av det biotin-Fab' som ble fremstilt i eksempel 1 og 20 enheter av p-Gal-Fab', og det samlede volum ble fylt opp til 10 ml. Etter fullførelse av omsetningen ble reaksjonsoppløsningen fjernet ved avsuging, og så ble en vaskeoppløsning (fysiologisk saltoppløsning) tilsatt brønnen, etterfulgt av fjerning av vaskeoppløsningen ved avsuging. Denne vaskefremgangsmåten ble gjentatt ytterligere fire ganger. Etter vasking ble 100 pl av en substratoppløsning [o-nitrofenyl-p-D-galaktopyranosid (3,01 g/l) i 50 mM fosfat-buf f er (inneholdende 75 mM natriumklorid, 0,04 % MgCl2, 0,05 % BSA, 6 % etylenglykol)] tilsatt den resulterende brønn, og blandingen ble omsatt ved 37°C i 10 min, og så ble reaksjonen stanset ved å tilsette 100 pl 1 % natriumkarbonat. Absorbansene ved 415 nm (hoved) og ved 600 nm (sub) ble målt. Resultatene er vist i figur 2 som en sirkel.
Sammenligningseksempel 3
Fremgangsmåtene ifølge eksempel 9 ble gjentatt, bortsett fra at den konvensjonelle avidinimmobiliserte, faste fase som ble fremstilt iht. fremgangsmåten ifølge eksempel 5, bortsett fra at biotin-BSA ikke ble immobilisert, ble brukt i stedet for fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse. Resultatene er vist i figur 2 som et triangel. Som det klart fremgår av resultatene vist i figur 2, hadde den immunologiske analyse hvor fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes, ca. to ganger høyere sensitivitet enn sensitiviteten til den immunologiske analyse hvor den konvensjonelle avidinimmobiliserte, faste fase anvendes. Figur 3 viser korrelasjonen mellom AFP-konsentrasjonen målt ved hjelp av den immunologiske analyse under anvendelse av fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse og konsentrasjonen målt ved hjelp av den konvensjonelle enzymbaserte, immunologiske analyse (AFP EIA-sett "Mitsui" II). Som det klart fremgår av resultatene vist i figur 3, ble det oppnådd god korrelasjon.
Eksempel 10
AFP immunologisk analyse
AFP immunologisk analyse ble utført ved å bruke fremgangsmåtene ifølge eksempel 9, bortsett fra at fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilt ifølge eksemplene 6 og 7, hvor hhv. biotin-OA og biotin-Fab' ble brukt, ble anvendt i stedet for fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilt ifølge eksempel 5, og bortsett fra at absorbansen ved 415 nm (hoved) og ved 650 nm (sub) ble målt. Resultatene er vist i hhv. figur 4 og 5 som en sirkel.
Fremgangsmåten ifølge sammenligningseksempel 3 hvor den konvensjonelle avidinimmobiliserte, faste fase anvendes, ble også gjentatt for å utføre den AFP immunologiske analyse. Resultatene er vist i figurene 4 og 5 som et triangel.
Som det klart fremgår av resultatene vist i figurene 4 og 5, hadde den immunologiske analyse hvor fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes, høyere sensitivitet enn sensitiviteten til den immunologiske analyse hvor den konvensjonelle avidinimmobiliserte, faste fase anvendes, med ca. 1,5 gang i tilfellet med biotin-OA og ca. 1,8 gang i tilfellet med biotin-Fab'.
Eksempel 11
Immunologisk analyse for karsinoembryoantigen ( CEA)
(a) Fremstilling av biotin- Fab':
Det ønskede biotin-Fab' (anti-CEA-antistoff) ble fremstilt ved å anvende fremgangsmåten ifølge eksempel 1, bortsett fra at et anti-CEA monoklonalt antistoff (MA3564F) ble brukt i stedet for det anti-AFP monoklonale antistoff.
(b) Fremstilling av POD- Fab':
Det ønskede POD-Fab<1> (anti-CEA-antistoff) ble fremstilt ved å anvende fremgangsmåten ifølge eksempel 2, bortsett fra at et anti-CEA monoklonalt antistoff (239-1) ble brukt i stedet for det anti-AFP monoklonale antistoff. (c) Fremstilling av fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse: Fremgangsmåtene ifølge eksempel 5 under anvendelse av biotin-BSA ble gjentatt, hvorved man fikk fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse. Fremgangsmåtene ifølge sammenligningseksempel 3 ble også gjentatt, hvorved man fikk den konvensjonelle avidinimmobiliserte, faste fase som en kontroll.
(d) CEA immunologisk analyse:
Human-CEA ble oppløst i humanserum uten noe CEA, og oppløsningen ble regulert til CEA-konsentrasjoner i området 0-50 ng/ml. 50 pl av denne prøven ble helt over i hver brønn i den faste fase fremstilt ifølge fremgangsmåte (c) ovenfor, til dette ble det tilsatt 100 pl av en antistoffoppløsning fremstilt ved å tilsette 0,01 M fosfatbuffer (pH 7,0, inneholdende 0,1 M natriumklorid og 0,2 % BSA) til 10 pg av biotin-Fab' og 15 IU av POD-Fab', slik at det totale volum ble 10 ml, og blandingen ble inkubert ved 37°C i 15 min. Etter fullførelse av omsetningen ble reaksjonsoppløsningen fjernet ved avsuging, og en vaskeoppløsning (fysiologisk saltoppløsning) ble tilsatt brønnen, etterfulgt av fjerning av vaskeoppløsningen ved avsuging. Denne vaskefremgangsmåten ble gjentatt ytterligere fire ganger. Etter vasking ble 100 pl av en substratoppløsning (ABTS 1 mg/ml, 0,01 % hydrogenperoksid, i 0,1 M sitratbuffer, pH 4,2) tilsatt den resulterende brønn, og blandingen ble omsatt ved 37°C i 10 min. Til blandingen ble det tilsatt 100 pl 5 mM natriumazid som en reaksjonsstanser, og absorbansene ved 415 nm (hoved) og ved 650 nm (sub) ble målt. Resultatene er vist i figur 6 som en sirkel.
CEA immunologisk analyse ble også utført ved å bruke fremgangsmåtene ovenfor, bortsett fra at brønnen med den konvensjonelle avidinimmobiliserte, faste fase ble anvendt i stedet for fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse. Resultatene er vist i figur 6 som et triangel.
Som det klart fremgår av resultatene vist i figur 6, ga den faste fase I ifølge foreliggende oppfinnelse likeledes høyere sensitivitet (ca. 1,7 ganger) enn den konvensjonelle avidinimmobiliserte, faste fase ved CEA immunologisk analyse.
(e) Korrelasjon:
Korrelasjonen (n = 20) mellom den immunologiske analyse under anvendelse av fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse og den konvensjonelle enzymbaserte, immunologiske analyse (CEA EIA II "Abott") ble undersøkt, og som et resultat av dette ble det observert en god korrelasjon med en korrela-sjonskoeffisient på 0,964 og en regresjonsformel på y = 0,642x + 2,0.
Eksempel 12
AFP immunologisk analyse under anvendelse av fluorescerende substrat
Den AFP immunologiske analyse ble utført iht. fremgangsmåtene ifølge eksempel 9, med det unntak at antigen-antistof f -reaksjonen og biotin-avidin-reaksjonen ble utført ved 37°C i 8 min, enzymreaksjonen ble utført ved 37"C i 1 min, 33,8 mg/l 4-metylumbelliferyl-p-D-galaktopyranosid ble brukt i stedet for o-nitrofenyl-p-D-galaktopyranosid som substrat-oppløsning, og absorbansmålingen ble gjort ved en eksitasjons-bølgelengde på 360 nm og ved en målebølgelengde på 450 nm. Resultatene er vist i figur 7. Som det klart fremgår av resultatene vist i figur 7, ble det oppnådd en god kalibreringskurve .
Det er funnet at anvendelsen av det fluorescerende substrat realiserer målingen av en AFP-konsentrasjon i løpet av et kortere tidsrom enn kolorimetrien ifølge eksempel 9.
Eksempel 13
Fremstilling av fast fase II ifølge foreliggende oppfinnelse
Til fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilt iht. fremgangsmåten ifølge eksempel 5 (a), ble 100 ul av biotin-Fab'-oppløsningen (1,6 pg/ml i 10 mM fosfatbuffer, pH 7,0, inneholdende 0,15 M NaCl og 0,1 % BSA) fremstilt ifølge eksempel 1, og blandingen ble omsatt ved 37°C i 1 time, hvorved man fikk fast fase II ifølge foreliggende oppfinnelse for AFP immunologisk analyse.
Eksempel 14
Fremstilling av fast fase II ifølge foreliggende oppfinnelse
Til fast fase I ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilt iht. fremgangsmåten ifølge eksempel 5 (b), ble 100 pl av biotin-Fab'-oppløsningen (1 pg/ml i 10 mM fosfatbuffer, pH 7,0, inneholdende 0,15 M NaCl og 0,1 % BSA) fremstilt i eksempel 11 (a) tilsatt, og blandingen ble omsatt ved 37°C i 1 time, hvorved man fikk fast fase II ifølge foreliggende oppfinnelse for CEA immunologisk analyse.
Eksempel 15 Fremstilling av fast fase II ifølge foreliggende oppfinnelse
Til den konvensjonelle avidinimmobiliserte, faste fase fremstilt iht. fremgangsmåten ifølge sanunenligningseksempel 3, ble 100 pl av biotin-Fab'-oppløsningen (1,6 pg/ml i 10 mM fosfatbuffer, pH 7,0, inneholdende 0,15 M NaCl og 0,1 % BSA) fremstilt ifølge eksempel 1 tilsatt, og blandingen ble omsatt ved 37°C i 1 time, hvorved man fikk fast fase II ifølge foreliggende oppfinnelse for AFP immunologisk analyse.
Eksempel 16
AFP immunologisk analyse
Human-AFP ble oppløst i humanserum uten AFP, og opp-løsningen ble regulert til AFP-konsentrasjoner i området 0-500 ng/ml. 20 pl av denne prøven ble helt over i hver brønn av fast fase II ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilt ifølge eksempel 13, og til dette ble det tilsatt 100 pl av en enzymmerket antistoffoppløsning fremstilt ifølge eksempel 8 ved å tilsette 0,01 M fosfatbuffer (pH 7,0, inneholdende 0,1 M natriumklorid og 0,2 % BSA) til 20 U av p-Gal-Fab', slik at totalvolumet ble 10 ml, og blandingen ble inkubert ved 37°C i 15 min. Deretter ble fremgangsmåten ifølge eksempel 9 gjentatt for å utføre den AFP immunologiske analyse, bortsett fra at absorbansene ved 415 nm (hoved) og 650 nm (sub) ble målt. Resultatene er vist i figur 8.
Eksempel 17
CEA immunologisk analyse
Human-CEA ble oppløst i humanserum uten noe CEA og oppløsningen regulert til CEA-konsentrasjoner i området 0-50 ng/ml. 50 pl av denne prøven ble helt over i hver brønn av fast fase II ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilt ifølge eksempel 14, og til dette ble det tilsatt 100 pl av en enzymmerket antistoffoppløsning fremstilt ifølge eksempel 11 (b) ved å tilsette 0,01 M fosfatbuffer (pH 7,0, inneholdende 0,1 M natriumklorid og 0,2 % BSA) til 15 IU av POD-Fab', slik at totalvolumet ble 10 ml, og blandingen ble inkubert ved 37"C i 15 min. Deretter ble fremgangsmåten ifølge eksempel 11 (d) gjentatt for å utføre den CEA immunologiske analyse. Resul-
tåtene er vist i figur 9.
Eksempel 18
AFP immunologisk analyse
Human-AFP ble oppløst i humanserum uten noe AFP og oppløsningen regulert til AFP-konsentrasjoner i området 0-1000 ng/ml. 20 pl av denne prøven ble helt over i hver brønn av fast fase II ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilt ifølge eksempel 15, og til dette ble 100 pl av en enz<y>mmerket antistoffoppløsning fremstilt ifølge eksempel 8 tilsatt ved å tilsette 0,01 M fosfatbuffer (pH 7,0, inneholdende 0,1 M natriumklorid og 0,2 % BSA) til 20 U av p-Gal-Fab<1>, slik at totalvolumet ble 10 ml, og blandingen ble inkubert ved 37°C i 15 min. Fremgangsmåten ifølge eksempel 9 ble deretter gjentatt for å utføre den AFP immunologiske analyse, bortsett fra at absorbansene ved 415 nm (hoved) og 650 nm (sub) ble målt. Resultatene er vist i figur 10 som en sirkel.
Fremgangsmåten ifølge sanunenligningseksempel 3 under anvendelse av den konvensjonelle avidinimmobiliserte, faste fase ble også gjentatt for å utføre den AFP immunologiske analyse. Resultatene er vist i figur 10 som et triangel.
Som det klart fremgår av resultatene vist i figur 10, hadde fremgangsmåten hvor fast fase II ifølge foreliggende anvendes, ca. tre ganger høyere sensitivitet enn fremgangsmåten hvor den konvensjonelle avidinimmobiliserte, faste fase anvendes.

Claims (8)

1. Enzymbasert, immunologisk analyse for et antigen under anvendelse av en fast fase, karakterisert ved at det anvendes (a) et biotinylert antistoff hvor et biotinderivat er bundet til en tiolgruppe i et Fab'-fragment av et antistoff, (b) et enzymmerket antistoff og (c) en fast fase immobilisert med et stoff som spesifikt kan reagere med biotinderivatet, valgt fra gruppen bestående av avidin, streptoavidin og et derivat derav, hvor begge antistoffene (a) og (b) er rettet mot det samme antigen som skal bestemmes, men gjenkjenner forskjellige epitoper på antigenet.
2. Immunologisk analyse ifølge krav 1, karakterisert ved at den faste fase (c) er en fast fase immobilisert med et stoff som kan reagere spesifikt med et biotinderivat, valgt fra gruppen bestående av avidin, streptoavidin og et derivat derav, hvor stoffet er immobilisert på den faste fase via en binding mellom et annet biotinderivat og et stoff med høy molekylvekt bundet til den faste fase.
3. immunologisk analyse ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den immunologiske analyse utføres ved å omsette det biotinylerte antistoff (a) og det enzymmerkede antistoff (b) med et antigen som skal bestemmes i en prøve, hvorved det dannes et kompleks av biotinylert antistoff, antigen og enzymmerket antistoff, og så omsette komplekset med stoffet valgt fra gruppen bestående av avidin, streptoavidin og et derivat derav, immobilisert på den faste fase (c).
4. Immunologisk analyse ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den immunologiske analyse utføres ved samtidig å omsette det biotinylerte antistoff (a), det enzymmerkede antistoff (b), en prøve inneholdende et antigen som skal bestemmes og den faste fase (c).
5. Immunologisk analyse ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes (i) en fast fase immobilisert med det biotinylerte antistoff (a) hvor et biotinderivat er bundet til en tiolgruppe i et Fab'-frag-ment av antistoffet, via et stoff valgt fra gruppen bestående av avidin, streptoavidin og et derivat derav, hvor stoffet er bundet til biotinresten i det biotinylerte antistoff og også er bundet til den faste fase via en binding mellom et annet biotinderivat og et stoff med høy molekylvekt som er bundet til den faste fase, og (ii) det enzymmerkede antistoff (b), hvor begge antistoffene (a) og (b) er rettet mot det samme antigen som skal bestemmes, men gjenkjenner forskjellige epitoper på antigenet.
6. Immunologisk analyse ifølge krav 5, karakterisert ved at den immunologiske analyse utføres ved samtidig å omsette det enzymmerkede antistoff (ii), en prøve som inneholder et antigen som skal bestemmes og den faste fase (i).
7. Fast fase for enzymbasert, immunologisk analyse, karakterisert ved at den omfatter en fast fase immobilisert med et biotinylert antistoff hvor et biotinderivat er bundet til en tiolgruppe i et Fab'-fragment av antistoffet som er rettet mot antigenet som skal bestemmes, via et stoff valgt fra gruppen bestående av avidin, streptoavidin og et derivat derav, hvor stoffet er bundet til biotinresten i biotinderivatet og også er bundet til den faste fase via en binding mellom et annet biotinderivat og et stoff med høy molekylvekt som er bundet til den faste fase.
8. Fast fase ifølge krav 7, karakterisert ved at stoffet med høy molekylvekt er valgt fra gruppen bestående av bovint serumalbumin, ovalbumin, immunglobulin, kollagen, gelatin, kasein, pullulan og dekstran.
NO902899A 1989-06-29 1990-06-28 Enzymbasert, immunologisk analyse for et antigen samt fast fase for anvendelse ved analysen NO178047C (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP16769789 1989-06-29
JP2070341A JP2619549B2 (ja) 1989-06-29 1990-03-20 抗原の定量法およびそれに用いる固相

Publications (4)

Publication Number Publication Date
NO902899D0 NO902899D0 (no) 1990-06-28
NO902899L NO902899L (no) 1991-01-02
NO178047B true NO178047B (no) 1995-10-02
NO178047C NO178047C (no) 1996-01-10

Family

ID=26411503

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO902899A NO178047C (no) 1989-06-29 1990-06-28 Enzymbasert, immunologisk analyse for et antigen samt fast fase for anvendelse ved analysen

Country Status (8)

Country Link
US (1) US5378608A (no)
EP (2) EP0405578B1 (no)
JP (1) JP2619549B2 (no)
DE (1) DE69021953T2 (no)
DK (1) DK0405578T3 (no)
ES (1) ES2078923T3 (no)
FI (1) FI101022B (no)
NO (1) NO178047C (no)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6274325B1 (en) * 1990-06-25 2001-08-14 Boehringer Mannheim Gmbh Method for carrying out a homogeneous-immunoassay based on agglutination
JP2968039B2 (ja) * 1990-11-29 1999-10-25 株式会社京都第一科学 化学発光免疫測定法
DE4140142A1 (de) * 1991-12-05 1993-06-09 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim, De Multivalentes dextranreagenz zum einsatz in praezipitationstests
ES2051247B1 (es) * 1992-11-27 1994-12-16 Univ Cordoba Procedimiento para la deteccion y medida de los niveles de hormona luteotropica porcina.
US5747352A (en) * 1994-05-23 1998-05-05 Beckman Instruments, Inc. Reagents and methods for the rapid and quantitative assay of pharmacological agents
DE19530078A1 (de) * 1995-08-16 1997-02-20 Bayer Ag Optischer Festphasenbiosensor auf Basis von Streptavidin und Biotin
DE19534988A1 (de) * 1995-09-21 1997-03-27 Forssmann Wolf Georg Verfahren zur Herstellung und Anwendung synthetischer, biotinylierter Peptide
US5958704A (en) 1997-03-12 1999-09-28 Ddx, Inc. Sensing system for specific substance and molecule detection
US6303325B1 (en) 1998-05-29 2001-10-16 Dade Behring Inc. Method for detecting analytes
JP4004230B2 (ja) * 1998-11-06 2007-11-07 株式会社三菱化学ヤトロン 架橋アビジン含有新規複合体、架橋アビジンを用いる分析方法、並びに分析用試薬及びキット
WO2002090961A2 (en) * 2001-05-03 2002-11-14 Immunetics, Inc. Systems and methods for detection of analytes in biological fluids
US20040209294A1 (en) * 2002-09-02 2004-10-21 National Food Research Institute Method to produce a receptor chip using biotinylated protein
WO2004072258A2 (en) * 2003-02-11 2004-08-26 University Of Washington Stimuli-responsive polymer conjugates and related methods
US20040248223A1 (en) * 2003-06-05 2004-12-09 Idexx Laboratories, Inc. Reduction of interfering peroxidase activity in peroxidase based detection methods
JP5224477B2 (ja) * 2006-11-01 2013-07-03 ベックマン コールター， インコーポレイテッド 親和性アッセイのための結合表面
US7981688B2 (en) 2007-03-08 2011-07-19 University Of Washington Stimuli-responsive magnetic nanoparticles and related methods
US8426214B2 (en) * 2009-06-12 2013-04-23 University Of Washington System and method for magnetically concentrating and detecting biomarkers
US9080933B2 (en) 2009-11-09 2015-07-14 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Stimuli-responsive polymer diagnostic assay comprising magnetic nanoparticles and capture conjugates
US20110117668A1 (en) * 2009-11-09 2011-05-19 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Self-powered smart diagnostic devices
US9005910B2 (en) 2010-04-14 2015-04-14 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Complex of labeled probes and water-soluble carrier
WO2013016653A1 (en) * 2011-07-28 2013-01-31 Cell Signaling Technology, Inc. Multi component detection

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE430062B (sv) * 1977-03-04 1983-10-17 Pharmacia Fine Chemicals Ab Kopplings- eller tioleringsreagens
JPS5510590A (en) * 1978-05-04 1980-01-25 Wellcome Found Enzyme immunity quantity analysis
US4282287A (en) * 1980-01-24 1981-08-04 Giese Roger W Biochemical avidin-biotin multiple-layer system
SE8003732L (sv) * 1980-05-19 1981-11-20 Pharmacia Diagnostics Ab Sett vid bestemningsmetoder involverande biospecifika affinitetsreaktioner
DE3263249D1 (en) * 1981-08-21 1985-05-30 Hoffmann La Roche Method for the determination of carcinoembryonic antigen (cea) and suitable antibody solution for the determination
US4434150A (en) * 1981-10-19 1984-02-28 Ortho Diagnostic Systems, Inc. Immunological reagents employing polymeric backbone possessing reactive functional groups
US4429008B1 (en) * 1981-12-10 1995-05-16 Univ California Thiol reactive liposomes
GB8307156D0 (en) * 1983-03-15 1983-04-20 Celltech Ltd Heterogeneous binding assays
US4496654A (en) * 1983-04-08 1985-01-29 Quidel Detection of HCG with solid phase support having avidin coating
US4935339A (en) * 1985-05-07 1990-06-19 Nichols Institute Diagnostics Delayed solid phase immunologic assay
EP0256117A1 (en) * 1986-02-06 1988-02-24 Microbiological Associates, Inc. Latex agglutination using avidin/biotin system
US4778751A (en) * 1986-05-12 1988-10-18 Diagnostic Products Corporation Method for measuring antigens or antibodies in biological fluids using ligand labeled antigens or ligand labeled antibodies
US4798795A (en) * 1987-02-17 1989-01-17 Hoechst Celanese Corporation Biotinylating agents
JPH07107537B2 (ja) * 1987-08-03 1995-11-15 イーストマン コダック カンパニー アビジン−及びビオチン−固定試薬，分析要素並びにその使用法
US4916075A (en) * 1987-08-19 1990-04-10 Ohmicron Corporation Differential homogeneous immunosensor device
JPS6488367A (en) * 1987-09-30 1989-04-03 Japan Chem Res Immobilized antibody
EP0390910B1 (en) * 1988-10-17 1995-12-13 Molecular Devices Corporation Hapten derivatized capture membran and assays using such membrane

Also Published As

Publication number Publication date
NO902899D0 (no) 1990-06-28
NO178047C (no) 1996-01-10
EP0405578B1 (en) 1995-08-30
FI903228A0 (fi) 1990-06-27
DK0405578T3 (da) 1995-09-18
JPH03128460A (ja) 1991-05-31
ES2078923T3 (es) 1996-01-01
DE69021953D1 (de) 1995-10-05
EP0405578A2 (en) 1991-01-02
NO902899L (no) 1991-01-02
US5378608A (en) 1995-01-03
EP0620438A1 (en) 1994-10-19
JP2619549B2 (ja) 1997-06-11
DE69021953T2 (de) 1996-04-04
FI101022B (fi) 1998-03-31
EP0405578A3 (en) 1991-05-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO178047B (no) Enzymbasert, immunologisk analyse for et antigen samt fast fase for anvendelse ved analysen
US4624930A (en) Immunochemical process
US5143852A (en) Antibodies to ligand analogues and their utility in ligand-receptor assays
KR102549704B1 (ko) Pivka-ii의 측정 방법, 및 pivka-ii 면역측정 시약 또는 키트의 제조 방법
JPH06317589A (ja) アッセイ干渉を排除したイムノアッセイ法およびキット
JPH06507021A (ja) 多重リガンドを同時検出する新規接合体及び検定法
JPH02156155A (ja) 特異的結合性物質の測定法及び試薬
WO1986000140A1 (en) Polyclonal antibodies, preparation and use
US4513088A (en) Assay for monoclonal antibody against surface Ig of a human B cell tumor
US5173406A (en) Liposome immunoassay method and kit therefor
US20080254440A1 (en) Anti-Sars Virus Antibody, Hybridoma Producing the Antibody and Immunoassay Reagent Using the Antibody
EP1271152A1 (en) Method of examining cancer by assaying autoantibody against mdm2 and reagent therefor
JPH06239899A (ja) ヒトタウ蛋白に対する抗体、並びに該抗体を利用する体液中のヒトタウ蛋白の測定方法
US5437981A (en) Method for the immunological determination of ligands
AU628298B2 (en) Method for measuring human insulin
JP3847983B2 (ja) 免疫学的分析用試薬、免疫学的分析方法及び免疫学的分析用キット
JPH01209370A (ja) 免疫活性物質の測定法及び測定試薬
JPH03170058A (ja) イムノアッセイ用試薬複合体
JPH09288108A (ja) 免疫測定に用いる非特異反応抑制剤、非特異反応抑制方法および測定キット
WO2001079266A1 (fr) Anticorps anti-recepteur du facteur de croissance du keratinocyte humain
JPH03503566A (ja) 天然結合タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いたイムノアツセイ
KR940008091B1 (ko) 리간드의 면역학적 검출방법
WO2023013725A1 (ja) サイログロブリンのイムノアッセイ及びそのためのキット
Guesdon Amplification systems for enzyme immunoassay
JPH1048217A (ja) プロテインキナーゼのリン酸化酵素活性の測定法及び測定キット